超高效合相色譜在獨(dú)一味有效成分測(cè)定中的應(yīng)用＊

靳貴林，邊 洋，李 雪

（1.西藏藏醫(yī)藥大學(xué) 藏醫(yī)藥基礎(chǔ)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏 拉薩 850000；2.西安交通大學(xué)，陜西 西安 710000）

2015 版《中國(guó)藥典》收載獨(dú)一味為唇形科植物獨(dú)一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分[1]。獨(dú)一味(Lamiophlomis herba)藏藥名“達(dá)巴”；《度母本草》：“莖方形，如標(biāo)尺，葉圓形，有疣狀腺點(diǎn)，鋪地而生；治療月經(jīng)過(guò)多，尿閉等癥，葉子搗碎涂于傷口，可促進(jìn)傷口愈合?！薄毒е楸静荨罚骸叭~圓而厚，莖方，花分紫、黃、白”?，F(xiàn)代藥理研究顯示獨(dú)一味對(duì)于牙齦炎具有很好的療效[2-3]，對(duì)于骨折患者具有鎮(zhèn)痛止血作用[4-5]，對(duì)于肩周炎、腰腿痛患者具有明顯的鎮(zhèn)痛效果[6-7]。乙永林[8]認(rèn)為獨(dú)一味中桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量較高可以作為獨(dú)一味質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。郝自新[9]研究提示山桅苷甲酯、8-0-乙酰山桅苷甲酯色譜分離較好，可以作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)性成分。昝珂[10]研究顯示山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素、綠原酸、蘆丁、毛蕊花糖苷、槲皮素等化學(xué)成分含量較高，峰位明顯。綜上所述，以山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素為指標(biāo)性成分，可以更好地評(píng)價(jià)獨(dú)一味質(zhì)量的優(yōu)劣。

超高效色譜是一種新的分析方法，廣泛用于藥物分析和分離[11,12]。超高效色譜中的流動(dòng)相是超臨界二氧化碳，具有氣體的擴(kuò)散特性和液體的密度和流動(dòng)性[13,14]。在超臨界狀態(tài)下，液態(tài)二氧化碳具有較高的分離效率[15,16]。UPC2還具有許多其他優(yōu)點(diǎn)，例如分析時(shí)間短，提取與分離集成在一起，對(duì)環(huán)境的危害較小[17,18]。最終，UPC2進(jìn)行了3D 全波長(zhǎng)掃描以確定化合物含量，從而克服了單波長(zhǎng)檢測(cè)的局限性?，F(xiàn)在，關(guān)于獨(dú)一味的質(zhì)量評(píng)價(jià)的報(bào)道很多，但是沒(méi)有基于UPC2的質(zhì)量評(píng)價(jià)的詳細(xì)研究[19,20]。本課題引進(jìn)新技術(shù)超高效合相色譜法，以3D 全波長(zhǎng)掃描能夠更好地測(cè)定各化學(xué)成分含量；以山桅苷甲酯為指標(biāo)性成分，旨在用新技術(shù)來(lái)建立獨(dú)一味多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)分析方法。

1 儀器及供試藥材

1.1 儀器與試劑

Waters 超高效合相色譜

水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；220v、50HZ1.5KW型號(hào)：WB-2000）

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）

超聲儀器（江蘇昆聲市超聲儀器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）

AT.Lichom C18 液相分析色譜柱（250mm×4.6mmid.5um）

電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204-IC）

CO2（食品級(jí)9999）

甲醇（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180373013）

乙腈（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180514268）

磷酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，生產(chǎn)批號(hào)xk13-011-00027）

山桅苷甲酯（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，CAS:623-65-8，批號(hào)：61222202）

1.2 藥材

2019 年，從西藏林芝采集了五批獨(dú)一味藥材，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定為正品獨(dú)一味，藥材信息見(jiàn)表1：

表1 藥材信息

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件

以CO2與甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，15%甲醇0～1min，18%甲醇1～5min，20%甲醇5～6min，25%甲醇6～7min，30%甲醇7～8min，30%甲醇8～9min，15%甲醇9～10min。柱溫，30℃；3D 全波長(zhǎng)掃描，進(jìn)樣量1μL、2μL、3μL、4μL、5μL；色譜圖如圖1 所示，經(jīng)分析進(jìn)樣量為2μL 色譜圖較好。

圖1 色譜圖

2.2 供試品制備

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，置于150mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱(chēng)重加甲醇補(bǔ)充減少量，濾過(guò)，取續(xù)濾液10mL定容于10mL 容量瓶,待用。

2.3 對(duì)照品制備及成分確定

取山桅苷甲酯5mg，置于25mL 容量瓶，用甲醇溶解，定容于25mL,即得0.2mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,待用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

取濃度為0.0015mg/mL、0.003mg/mL、0.0045mg/mL、0.006mg/mL、0.0075mg/mL 山桅苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣2μL 在3D 全波長(zhǎng)掃描下進(jìn)樣，計(jì)算峰面積，以峰面積為y 軸，樣品量為x 軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得出山桅苷甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及r 值見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及r 值

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

以山桅苷甲酯為特征性成分來(lái)檢測(cè)精密度，取已知濃度的山桅苷甲酯溶液2μL，進(jìn)樣6 次，計(jì)算得RSD 值小于2%，故而儀器的精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項(xiàng)下提取。提取液用0.25μm 濾膜過(guò)濾，在1h、4h、7h、10h、16h、24h分別進(jìn)樣2μL，在3D 全波長(zhǎng)掃描下測(cè)定山桅苷甲酯峰面積，依據(jù)峰面積計(jì)算含量，得山桅苷甲酯在24h 內(nèi)RSD 值為1.5%穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項(xiàng)下提取。提取液用0.25μm 濾膜過(guò)濾，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)6 次，分別進(jìn)樣2μL，在3D 全波長(zhǎng)掃描下測(cè)定山桅苷甲酯峰面積，計(jì)算山桅苷甲酯含量，計(jì)算得RSD 值小于2%，故而得出實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，按照“2.2 供試品制備”項(xiàng)下提取。提取液用0.25μm 濾膜過(guò)濾，各加入已知濃度的山桅苷甲酯對(duì)照品溶液0.3ug，而后定容于10mL 容量瓶。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)5 次，用0.25μm 濾膜過(guò)濾，取2μL,進(jìn)樣測(cè)定山桅苷甲酯面積計(jì)算加樣回收率，其值見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率數(shù)值

由表3 可知，平均加樣回收率為95%，RSD 值小于2%，故而加樣回收率較好。

3 獨(dú)一味中山桅苷甲酯峰位確定

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，置于50mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱(chēng)重加甲醇補(bǔ)充減少量，濾過(guò)，濃縮，而后定容于10mL 容量瓶。用0.25μm 濾膜過(guò)濾，取2μL 進(jìn)樣，得供試品色譜圖如圖2 所示；

圖2 峰1 為山桅苷甲酯峰

4 最佳提取方式選擇

4.1 提取溶劑的選擇

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，置于150mL 的6 個(gè)帶塞錐形瓶，其中5 個(gè)錐形瓶中各自加入50%、60%、70%、80%、100%甲醇各50mL，一個(gè)錐形瓶中加入50mL 甲醇，稱(chēng)定重量。超聲提取90min，計(jì)算山桅苷甲酯的含量見(jiàn)表4。

表4 提取溶劑考察

由表4 可知，甲醇提取液中所含山桅苷甲酯含量最高，故而選取獨(dú)一味的最佳提取溶劑為甲醇。

4.2 提取料液比選擇

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.00g，分別置于4 個(gè)150mL 的帶塞錐形瓶，分別加入70%乙醇30mL、40mL、50mL、60mL，稱(chēng)定重量。分別超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱(chēng)重加70%乙醇補(bǔ)充減少量，濾過(guò)，而后取續(xù)慮液10mL于容量瓶中。用0.25μm 濾膜過(guò)濾，取2μL 進(jìn)樣，計(jì)算獨(dú)一味中山桅苷甲酯含量見(jiàn)表5。

表5 不同料液比下山桅苷甲酯含量

由表5 分析可知，在料液比為1:3 的情況下山桅苷甲酯的含量最高，故而選擇最佳料液比為1:3提取獨(dú)一味中的山桅苷甲酯。

4.3 超聲提取時(shí)間的選擇

精密稱(chēng)取過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h 的獨(dú)一味供試品1.01g，分別置于6 個(gè)150mL 的帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量。分別超聲提取30min、50min、60min、80min、120min、150min，置于室溫下冷卻，稱(chēng)重加甲醇補(bǔ)充減少量，濾過(guò)，而后取續(xù)慮液10mL 于容量瓶中。用0.25μm 濾膜過(guò)濾，取2μL 進(jìn)樣，計(jì)算獨(dú)一味中山桅苷甲酯含量見(jiàn)表6：

表6 不同超聲提取時(shí)間下山桅苷甲酯含量

由表6 可知超聲提取90min，提取液中的山桅苷甲酯含量較高，故而選擇超聲提取時(shí)間為90min。

5 獨(dú)一味中所含山桅苷甲酯含量的測(cè)定

精密稱(chēng)取不同月份過(guò)40 目篩，60℃下干燥2h的獨(dú)一味供試品1.00g，按月份編號(hào)，每個(gè)供試品平行3 次，置于50mL 帶塞錐形瓶，加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量。超聲提取90min，置于室溫下冷卻，稱(chēng)重加甲醇補(bǔ)充減少量，濾過(guò)，而后定容于10mL 容量瓶。用0.45μm 濾膜過(guò)濾，取2μL 進(jìn)樣，計(jì)算獨(dú)一味中山桅苷甲酯的含量，其值見(jiàn)表7；

表7 山桅苷甲酯含量

由表7 可知該方法可以有效而準(zhǔn)確的測(cè)出獨(dú)一味中山桅苷甲酯的含量，山桅苷甲酯含量在0.53±0.041mg/g 范圍內(nèi)波動(dòng)。

6 結(jié)論

獨(dú)一味(Lamiophlomis herba)藏藥名“達(dá)巴”；《度母本草》：“莖方形，如標(biāo)尺，葉圓形，有疣狀腺點(diǎn)，鋪地而生；治療月經(jīng)過(guò)多，尿閉等癥，葉子搗碎涂于傷口，可促進(jìn)傷口愈合?！背咝V中的流動(dòng)相是超臨界二氧化碳，具有氣體的擴(kuò)散特性以及液體的密度和流動(dòng)性，在超臨界狀態(tài)下，液態(tài)二氧化碳具有較高的分離效率。UPC23D 全波長(zhǎng)掃描克服了單波長(zhǎng)檢測(cè)的局限性，且具有分析時(shí)間短，提取與分離一體化，對(duì)環(huán)境無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中，建立了一種基于UPC2的新的定量分析方法，用于評(píng)價(jià)獨(dú)一味的質(zhì)量品質(zhì)。