航天黃花菜組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究＊

帥娜娜，穆妮妮，張秀麗，黃衛(wèi)紅，任麗娟，頡敏昌△

（1.甘肅省慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 慶陽 745000；2.慶陽市西峰區(qū)農(nóng)業(yè)行政綜合執(zhí)法大隊(duì)，甘肅 慶陽 745000）

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）屬百合科（liliaceae）萱草屬，別名萱草、忘憂草、金針菜、健腦草、安神菜等，是一種常見的多年生草本植物[1]，在我國已有2000 多年的栽培史，自古以來就是一種美食。黃花菜花蕾呈細(xì)長條狀，黃色，有芳香氣味，具有藥食同源的功能[2]，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、多種維生素、游離氨基酸、黃酮類物質(zhì)和鈣、磷、鐵、鋅、硒等礦物質(zhì)元素[3]，還具有清熱解毒、抗菌消炎、安神補(bǔ)腦、抵抗抑郁、延緩衰老及抗癌抑癌等功效[4]。

黃花菜在我國栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，南北各地均有栽植，多分布于中國秦嶺以南、甘肅、湖南、江蘇、浙江、湖北、江西、四川、陜西、吉林、廣東與內(nèi)蒙古草原等地。慶陽地處黃花菜優(yōu)生區(qū)的核心區(qū)，是全球品質(zhì)最好、面積最大、栽培歷史最悠久的黃花菜產(chǎn)區(qū)。慶陽黃花菜不僅菜條肥大，色澤黃亮，而且還具有肉質(zhì)厚嫩，久煮不爛的特點(diǎn)。被列為國家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。

航天誘變育種是將空間技術(shù)與常規(guī)農(nóng)業(yè)育種相結(jié)合，利用空間的特殊環(huán)境，使種子或其他植物體產(chǎn)生遺傳變異，返回地面種植，獲得有益突變體，選育新品種的植物育種技術(shù)[5]。我國的航天育種走在世界前列，在農(nóng)作物育種方面已取得了重要的成果，至目前已通過國家、省級審定或鑒定的品種有200 多個(gè)。黃花菜的航天育種起步較晚，發(fā)展相對落后，現(xiàn)在還未見成熟報(bào)道。

2019 年6 月-2020 年7 月，采用組織培養(yǎng)法擴(kuò)繁航天黃花菜新品種金蕾二號種苗，試驗(yàn)對金蕾二號外植體采集、消毒，繼代培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基滅菌，接種，煉苗，移栽大田等環(huán)節(jié)做了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2019 年6 月-2020 年7 月在慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院組培室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自主選育的航天黃花菜新品種金蕾二號。

1.3 試驗(yàn)儀器

生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，型號：HFsafe-1200LC）、全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，100 L）、接種器械滅菌器（濟(jì)南格艾特儀器設(shè)備有限公司）、紫外線燈、酒精燈。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 外植體消毒

1）幼蕾花絲：將采集的金蕾二號幼小花蕾（長度6 cm 以下），用流水沖凈晾干，在無菌條件下，用70%乙醇浸10～20 s，超純水沖洗3 次，晾干，再用0.1%氯化汞浸8～10 min，超純水沖洗7 次，用滅菌濾紙吸干水分，撕開花瓣，取出花絲，用無菌剪刀將其剪成長約0.5 cm 的小段。

2）根狀莖：將新挖的金蕾二號植株置于自來水下，小水沖洗2～3 h，用毛刷輕輕刷洗葉片及根系間的泥土，洗凈后除去根系，剝離外層葉片，保留根狀莖上部3～4 cm，晾干。在無菌條件下，用70%酒精浸30 s，超純水沖洗3 次，再用0.1%升汞加0.02%吐溫溶液浸泡5 min，超純水沖洗7 次，滅菌濾紙吸干水分，手術(shù)刀剝?nèi)ナＳ嗳~片，切取莖尖0.2～0.5 cm。

1.4.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)及外植體的選擇

將黃花菜幼蕾花絲和根狀莖分別接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過40 d 的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)不同外植體誘導(dǎo)分化情況，選擇最佳外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，pH5.8～6.0，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃～28 ℃，光照度2000～2500 lx，光照時(shí)間16h。

1.4.3 繼代培養(yǎng)

將誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織，分割成0.6～1.5 cm 的小塊，接入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基1 為MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6－BA 4.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+蔗糖3%；繼代培養(yǎng)基2 為MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）4.74 g+瓊脂5.5 g/L+6－BA 0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。每瓶接種4 個(gè)單芽，重復(fù)3 次。培養(yǎng)溫度25 ℃～28 ℃，光照度2000～2500 lx，光照時(shí)間16 h。經(jīng)過30 d 的培養(yǎng)，隨機(jī)選出30 瓶統(tǒng)計(jì)愈傷組織、芽叢、無根苗（高3cm、6 片葉以上）增殖情況。

1.4.4 生根培養(yǎng)

金蕾二號繼代培養(yǎng)生成的無根苗高約3 cm，葉6 片以上時(shí)，接入不同激素的1/2MS 生根培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基1 為1/2MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）2.47 g+瓊脂5.5 g/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖3%，生根培養(yǎng)基2 為1/2MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）2.47 g+瓊脂5.5 g/L+IBA0.2 mg/L+蔗糖3%。培養(yǎng)溫度25～28℃，光照度2000～2500 lx，光照時(shí)間16 h。經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，觀察生根情況。

1.4.5 煉苗

無根苗在生根培養(yǎng)基上生根2 條以上時(shí)，使生根苗逐步接受自然光照、與外界交換空氣、適應(yīng)較低濕度的環(huán)境，直至具備在自然環(huán)境中生存的能力，煉苗完成。

組培苗經(jīng)過30d 煉苗，高度達(dá)到10cm 以上，根狀莖直徑0.6 cm 以上，肉質(zhì)根2 條以上，生長健壯，定植大田。大田等行栽植，行距0.85m，株距0.40 m。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的選擇

經(jīng)過40 d 的誘導(dǎo)培養(yǎng)，不同外植體誘導(dǎo)頻率統(tǒng)計(jì)見表1。據(jù)結(jié)果可以看出，花絲、根狀莖尖兩類外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，金蕾二號幼蕾的花絲接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，7 d 花絲膨大，萌動(dòng)3 個(gè)，15 d 有31 個(gè)花絲基部長出黃色愈傷組織，40 d 愈傷組織達(dá)到46 個(gè)，逐漸變綠分化增多，進(jìn)入高峰，誘導(dǎo)愈傷率為76.67%；根狀莖尖作為外植體接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，7 d 根狀莖尖膨大，萌動(dòng)1個(gè)，15d 有19 個(gè)根狀莖尖基部長出黃色愈傷組織，40d 愈傷組織變綠分化增多，達(dá)到28 個(gè)，同時(shí)長出許多新生芽點(diǎn)，誘導(dǎo)愈傷率為46.67%。綜上，可選黃花菜幼蕾花絲為最佳外植體。

表1 外植體誘導(dǎo)頻率統(tǒng)計(jì)表

2.2 繼代培養(yǎng)

選取繼代培養(yǎng)的黃花菜無菌苗，接種于含不同濃度6－BA、NAA、IBA 的培養(yǎng)基中，增值情況見表2。結(jié)果表明，20 d 繼代培養(yǎng)基1、繼代培養(yǎng)基2 都能產(chǎn)生大量淡綠色外觀呈不規(guī)則的顆粒狀胚性愈傷組織，繼代培養(yǎng)基1 愈傷組織增殖快，30 d 愈傷組織增殖3.1 倍。繼代培養(yǎng)基2 萌發(fā)芽叢41 個(gè)，生成無根苗23 個(gè)。繼代培養(yǎng)基1 適合金蕾二號愈傷組織增殖培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基2 適合金蕾二號分化胚性愈傷組織，生成芽叢，長出無根苗。試驗(yàn)中還觀察到，金蕾二號花絲誘導(dǎo)愈傷過程中，初次出現(xiàn)的愈傷組織越緊實(shí)，表面有小顆粒狀分布的，則增殖及生成芽叢的能力就越強(qiáng)，而誘導(dǎo)的愈傷組織越松散則再生能力越差。

表2 繼代培養(yǎng)基愈傷組織增殖統(tǒng)計(jì)表

2.3 生根培養(yǎng)

采用添加NAA、IBA 兩種不同激素的生根培養(yǎng)基，生根情況見表3。結(jié)果表明，生根培養(yǎng)基1 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發(fā)出白色乳狀凸起4個(gè)，30 d 有113 個(gè)苗生根，共生根267 條，無根苗生根率75.33%。生根培養(yǎng)基2 接種18 d 從無根苗的根狀莖上萌發(fā)出白色乳狀凸起1 個(gè)，30 d 有99 個(gè)苗生根，共生根299 條。兩種生根培養(yǎng)基都能促進(jìn)生根，生根培養(yǎng)基1 培養(yǎng)的植株葉片寬大、苗較健壯，生根快；生根培養(yǎng)基2 生根數(shù)較多、根較粗長、根系發(fā)達(dá)。30 d 后，根數(shù)繼續(xù)增加，根系繼續(xù)擴(kuò)大。當(dāng)無根苗生根2～3 條以上時(shí)，植株葉片增多，根部肥大，植株生長旺盛，開始煉苗。

表3 生根培養(yǎng)基生根統(tǒng)計(jì)表

2.4 煉苗

（1）使用80%多菌靈300～500 倍液均勻噴霧處理寧夏中青生物科技有限公司生產(chǎn)的育苗基質(zhì)，加水濕透至育苗基質(zhì)手握成團(tuán)，捏不出水分，裝入直徑10cm 的營養(yǎng)缽，每缽栽入1 株2 條根系以上，植株葉片寬大、生長健壯的組培苗，立即放入小拱棚，保持溫度25～28℃、相對濕度55%～80%，逐步接受陽光照射。栽入155 株帶根組培苗進(jìn)行煉苗，11d 后將組培苗移出小拱棚時(shí)，死亡76 株，存活79 株。日光溫室內(nèi)整好練苗用地，開溝，鋪放處理的育苗基質(zhì)，栽入苗子，沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì)，壓實(shí)，輕澆薄水。7 d 內(nèi)及時(shí)補(bǔ)水。10d 后全部死亡。

（2）日光溫室內(nèi)開溝，鋪放用80%多菌靈300～500 倍液處理的育苗基質(zhì)，將130 株2 條根系以上，葉片寬大、生長健壯的組培苗，從培養(yǎng)瓶移出，沖去根部培養(yǎng)基基質(zhì)，栽入育苗基質(zhì)之上，沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì)，壓實(shí)，輕澆薄水，加蓋遮陽網(wǎng)。移栽7d 內(nèi)及時(shí)補(bǔ)水，保持小環(huán)境具有較高的空氣濕度，減少葉面的水分蒸發(fā)，當(dāng)外圍老葉枯死，新葉長出后，逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，10d 后僅存活1 株，存活率不足1%。

（3）將生根2 條以上的生根苗，連同培養(yǎng)瓶置于自然光照環(huán)境，第1 天接受自然光照1h,以后每天增加20 min,逐步適應(yīng)自然光，7d 后解開封口繩，再過2 d，將封口膜上移，使瓶內(nèi)組培苗能與外界進(jìn)行空氣交換，適應(yīng)較低濕度的環(huán)境，7d 后將封口膜去掉，張開瓶口，置于日光下10 d，煉苗完成，移栽大田。大田挖小坑，噴施80%多菌靈300～500 倍液，進(jìn)行土壤消毒，栽入苗子，沿苗子兩側(cè)撒入處理過的育苗基質(zhì)，壓實(shí)，輕澆薄水，加蓋遮掩網(wǎng)遮光，視土壤墑情及時(shí)用噴霧器補(bǔ)水。栽植7d 后去掉遮掩網(wǎng)，噴灑0.1%尿素水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300～500 倍液1 次，然后每10d 噴1 次。栽植生根苗2216 株，成活1319 株，成活率在59.52%。

（4）將組培苗生根2 條以上的培養(yǎng)瓶，解開封口繩置于培養(yǎng)室，2d 后將封口膜上移，7 d 后將封口膜去掉，張開瓶口，組培苗能與外界交換空氣，適應(yīng)較低濕度的環(huán)境，10d 后使用80%多菌靈300～500倍液均勻噴霧處理育苗基質(zhì)，加水濕透至育苗基質(zhì)手握成團(tuán)，捏不出水分，裝入6cm×6cm32 孔或4.5cm×4.5cm50 孔育苗盤，在培養(yǎng)室經(jīng)過10d 過渡，期間，死亡13 株，10d 后將育苗盤移入自然光照環(huán)境，第1d 接受自然光照1h，以后每天增加20 min，逐步適應(yīng)自然光照和有菌環(huán)境，7d 后，又死亡27株，煉苗期間共死亡40 株，死亡率48.78%。存活42株移栽大田。大田挖小坑，噴施80%多菌靈300～500倍液，進(jìn)行土壤消毒，栽入苗子，壅土壓實(shí)。輕澆薄水，視土壤墑情及時(shí)用噴霧器補(bǔ)水。栽植7 d 后噴灑加入0.1%尿素的水溶液1 次、噴霧80%多菌靈300～500 倍液1 次，然后每10 天噴1 次，10d 后，成活19 株。成活率23.17%。

由表4 可以看出，金蕾二號煉苗成活率低，馴化難度大。采用方法（3）煉苗成活率相對較高，但也只有59.52%。航天黃花菜組培苗與傳統(tǒng)品種黃花菜品種組培苗相比生長勢較弱，更容易死亡。

表4 煉苗成活率統(tǒng)計(jì)表

2.5 大田區(qū)域試驗(yàn)示范

在位于合水縣固城鎮(zhèn)高臺(tái)村合水縣鑫慶豐黃花菜農(nóng)民專業(yè)合作社基地栽植金蕾二號組培苗試驗(yàn)示范田1330 m2。試驗(yàn)用苗經(jīng)過大田生長50 d 以上，根狀莖直徑0.8 cm 以上，肉質(zhì)根3 條以上，生長健壯。栽植時(shí)將地上葉片剪短至3～5 cm，行距0.85m，株距0.40 m。共栽植3900 株，成活3889 株，成活率99.71%。經(jīng)過煉苗存活下來的金蕾二號組培苗，栽植大田后抵抗力提高，與其他黃花菜品種無差異。

3 討論與結(jié)果

1）金蕾二號組培苗再生系統(tǒng)的生長周期明顯，花絲接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基經(jīng)過萌動(dòng)膨大，誘導(dǎo)出黃色愈傷組織，繼代增殖培養(yǎng)形成芽叢，長出無根苗，無根苗在生根培養(yǎng)基中萌發(fā)出根系。不同煉苗方法成活率差異很大，需要進(jìn)一步探索。

2）本研究結(jié)果表明，金蕾二號通過反復(fù)繼代增殖培養(yǎng)，可達(dá)到大量繁殖的目的。黃花菜以花絲為外植體進(jìn)行組培快繁，可采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L、繼代培養(yǎng)基MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 4.0mg/L+NAA0.1mg/L+3%和MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）4.74g+瓊脂5.5g/L+6-BA 0.5mg/L+IBA0.2mg/L+3%蔗糖；生根培養(yǎng)基1/2MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）2.47g+瓊脂5.5g/L+NAA0.2mg/L 或1/2MS 培養(yǎng)基粉（不含糖和瓊脂）2.47g+瓊脂5.5g/L+IBA0.2mg/L 的組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)。

3）金蕾二號黃花菜組培苗生長勢弱，煉苗難度大，成活率低。金蕾二號煉苗中存活的組培苗，抵抗能力不斷提高，移栽到大田后與其他黃花菜品種無差異。