養(yǎng)雞場(chǎng)混合感染的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

文│李佳璇 宋祥軍（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

王苗利 藺曉月 陳靜 孫圣福（山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心）

鄒本革（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院）

近年來(lái)，隨著養(yǎng)雞業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，以及飼養(yǎng)管理不當(dāng)，使得養(yǎng)殖場(chǎng)常發(fā)生兩種或兩種以上病原體的混合感染。雞大腸桿菌常與其他細(xì)菌、病毒等病原體混合或繼發(fā)感染，蛋雞和肉雞更易發(fā)病，生殖系統(tǒng)炎癥對(duì)于蛋雞養(yǎng)殖危害較為嚴(yán)重。如某養(yǎng)雞場(chǎng)因飼養(yǎng)管理不當(dāng)，雞群抵抗力下降，引起大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的混合感染，導(dǎo)致蛋雞發(fā)病死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重。當(dāng)多種病原體混合感染時(shí)，單一用藥或使用抗生素可能達(dá)不到理想的治療效果，還會(huì)大大增加臨床診斷及治療的難度，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。為了避免病情加重，產(chǎn)生耐藥菌株等不良后果，可采取聯(lián)合用藥或幾組敏感藥物交替使用的方法來(lái)治療多種病原體的混合感染。

金黃色葡萄球菌（SA），屬于葡萄球菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種常見(jiàn)的食源性致病微生物，常引起化膿性疾病、敗血癥等。雞感染SA后會(huì)引起敗血癥和病理變化，雛雞多表現(xiàn)為急性，青年雞表現(xiàn)為急性或慢性，成年雞表現(xiàn)為慢性，感染后死亡率最高的是雛雞。大腸桿菌屬腸桿菌科、埃希菌屬，有菌毛、莢膜和微莢膜，是革蘭氏陰性短桿菌，有鞭毛，可運(yùn)動(dòng)。禽致病性大腸桿菌（APEC）能引起肉雞的心包炎、肺泡炎、肝周炎及敗血癥；蛋雞出現(xiàn)輸卵管炎和敗血癥，導(dǎo)致蛋雞死亡率上升，產(chǎn)蛋率下降。

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展壯大，抗生素的使用成了畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中不可或缺的環(huán)節(jié)，但是抗生素的使用并沒(méi)有得到有效的監(jiān)管，許多散養(yǎng)戶在沒(méi)有獸醫(yī)的指導(dǎo)下隨意使用抗生素，不僅達(dá)不到治療效果，反而會(huì)出現(xiàn)其他不良癥狀。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行鑒定和藥敏分析，可以指導(dǎo)正確的臨床用藥，確定其敏感藥物，對(duì)防止抗生素濫用以及產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性具有重大意義，為臨床治療金黃色葡萄球菌病和大腸桿菌病混合感染提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料。

（1）主要儀器設(shè)備。梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60，奧林巴斯顯微鏡，羅氏自動(dòng)核酸提取儀，羅氏熒光定量PCR儀，生物安全柜，移液器（0～300微升）。

（2）主要試劑盒。禽傳染性支氣管炎病毒（AIBV）核酸檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自廣州伯鑫生物科技有限公司；禽流感病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；雞傳染性新城疫病毒熒光RTPCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。

（3）主要試劑材料?？岂R嘉顯色培養(yǎng)基，梅里埃藥敏分析卡，革蘭氏染色液，0.45%氯化鈉溶液，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，0.01M的PBS緩沖液（pH7.2）。

◎圖1 新城疫病毒RT-PCR擴(kuò)增圖像

◎圖2 傳染性支氣管炎病毒RT-PCR擴(kuò)增圖像

◎圖3 禽流感病毒RT-PCR擴(kuò)增圖像

2.試驗(yàn)方法。

（1）發(fā)病情況調(diào)查。調(diào)查了山東省濟(jì)南市章丘區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)蛋雞發(fā)病情況，調(diào)查內(nèi)容包括該養(yǎng)殖場(chǎng)雞存欄量、死亡數(shù)量、發(fā)病日齡、臨床癥狀、免疫和用藥情況以及剖檢情況，并對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)環(huán)境、消毒情況進(jìn)行記錄。

（2）病毒檢測(cè)。采取5只病死雞肝，分別研磨，制成混懸液，離心。按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行熒光RTPCR擴(kuò)增。

（3）細(xì)菌分離鑒定及藥敏分析。一是病料接種培養(yǎng)。選取病料病變交界處的區(qū)域，在顯色培養(yǎng)基上劃線接種，將培養(yǎng)基倒置，放于37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。二是細(xì)菌染色鏡檢。將細(xì)菌固定在潔凈玻片上，采用革蘭氏染色法將細(xì)菌染色。在100倍油鏡下觀察染色結(jié)果。三是細(xì)菌分離純化。挑取顯色培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種，37℃恒溫純化培養(yǎng)24小時(shí)。四是細(xì)菌16S rRNA鑒定及繪制進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，并使用生物信息學(xué)MEGA6.0軟件，繪制進(jìn)化樹(shù)。五是細(xì)菌藥敏分析。挑取純化好的單菌落，在氯化鈉溶液中混勻，制備成菌懸液，插入藥敏分析卡，待18小時(shí)后讀取結(jié)果。

二、結(jié)果與分析

1.發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果。該養(yǎng)殖場(chǎng)存欄雞4000只，主要是蛋雞發(fā)病死亡。病雞的糞便正常，無(wú)呼吸道及其他癥狀，基本上是突然死亡。該養(yǎng)殖場(chǎng)在發(fā)病后使用慶大霉素進(jìn)行治療，但并未達(dá)到治療效果。解剖發(fā)現(xiàn)，病死雞肝輕微腫大且易碎，心肌內(nèi)膜出血。實(shí)地調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，該養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防控不到位，飼養(yǎng)環(huán)境較差，沒(méi)有及時(shí)清理糞便，通風(fēng)較差，雞舍消毒不徹底，對(duì)飼養(yǎng)人員管理不嚴(yán)格。

2.病毒檢測(cè)結(jié)果。

（1）新城疫病毒檢測(cè)結(jié)果。雞新城疫病毒RT-PCR結(jié)果見(jiàn)表1，新城疫病毒RT-PCR擴(kuò)增圖像見(jiàn)圖1。由表1可知，本次測(cè)定的5份樣品核酸的CT值＞40，無(wú)陽(yáng)性結(jié)果；由圖1可知，其擴(kuò)增曲線為一條直線，與陰性對(duì)照相符，新城疫病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性，因此該養(yǎng)殖場(chǎng)的蛋雞并非新城疫病毒感染。

表1 雞新城疫病毒RT-PCR結(jié)果判定

（2）傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)結(jié)果。傳染性支氣管炎病毒RT-PCR結(jié)果見(jiàn)表2，傳染性支氣管炎病毒RTPCR擴(kuò)增圖像見(jiàn)圖2。由表2可知，本次測(cè)定的樣品核酸無(wú)CT值；由圖2可知，其擴(kuò)增曲線為一條直線，與陰性對(duì)照相符，傳染性支氣管炎病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明該養(yǎng)殖場(chǎng)的蛋雞并非傳染性支氣管炎病毒感染。

表2 傳染性支氣管炎病毒RT-PCR結(jié)果判定

（3）禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果。禽流感病毒RT-PCR結(jié)果見(jiàn)表3，禽流感病毒RT-PCR擴(kuò)增圖像見(jiàn)圖3。由表3可知，本次測(cè)定的樣品核酸無(wú)CT值；由圖3可知，其擴(kuò)增曲線為直線，與陰性對(duì)照相符，禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明該養(yǎng)殖場(chǎng)的蛋雞并非禽流感病毒感染。

表3 禽流感病毒RT-PCR結(jié)果判定

3.細(xì)菌分離鑒定及藥敏分析結(jié)果。

（1）病料接種結(jié)果。顯色培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖4～8。由圖可知，培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出兩種不同顏色的菌落，分別為黃色菌落和紫色菌落。

（2） 染色鏡檢結(jié)果。染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖9和圖10。由圖9可知，黃色菌落為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈藍(lán)紫色、葡萄串樣；由圖10可知，紫色菌落為革蘭氏陰性短桿菌，呈紅色、棒狀。

（3）分離純化結(jié)果。兩種細(xì)菌純化效果良好，無(wú)雜菌生長(zhǎng)。

◎圖9 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色情況

◎圖10 大腸桿菌革蘭氏染色情況

（4）16S測(cè)序及繪制進(jìn)化樹(shù)結(jié)果。

16S測(cè)序結(jié)果。16S的測(cè)序鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，菌種1與大腸桿菌的同源性為99.36%，菌種2與金黃色葡萄球菌的同源性為100%。

表4 兩種菌的16S鑒定結(jié)果

進(jìn)化樹(shù)繪制。進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖11。對(duì)1809007A和1809007B分離菌株的16S片段采用生物信息學(xué)MEGA6.0軟件，選擇NJ（Neighbor-Joining，鄰接法）、Kimura 2-parameter（Kimura-2參數(shù)）模型和Bootstrap 1000，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。其中，紅色三角標(biāo)注的為分離菌株。由進(jìn)化樹(shù)可以看出，1809007A菌株與Escherichia coli 16S ribosomal RNA，J01859.1和Escherichia coli strain NBRC102203NR_114042.1 菌株同源性較高，處于同一分支，同源性為99.6%，推斷1809007A為大腸桿菌菌株。1809007B菌株與Staphylococcus aureus strain ATCC 12600 NR_115606.1和Staphylococcus aureus subsp. anaerobius strain NR_036828.1同源性較高，同源性為100%，推斷1809007B為金黃色葡萄球菌。

◎圖4～8 分別為病料1～5的顯色培養(yǎng)結(jié)果

（5）金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的藥敏結(jié)果。純化好的革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌制備成均勻的菌懸液，分別插入藥敏卡，放入梅里埃生化及藥敏儀VITECⅡcompact60中，反應(yīng)18小時(shí)，觀察結(jié)果：金黃色葡萄球菌藥敏分析結(jié)果見(jiàn)表5，大腸桿菌藥敏分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 金黃色葡萄球菌藥敏分析結(jié)果

表6 大腸桿菌藥敏分析結(jié)果

根據(jù)表5中的MIC值和解釋結(jié)果可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)金黃色葡萄球菌最為敏感的藥物為氨芐西林（MIC值為0.06）；其次是替加環(huán)素、苯唑西林和慶大霉素；環(huán)丙沙星、四環(huán)素等藥物不敏感。

根據(jù)表6中MIC值和解釋結(jié)果可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)大腸桿菌最敏感的藥物為厄他培南（MIC值≤0.5）和環(huán)丙沙星（MIC值為0.5）；其次為亞胺培南和左氧氟沙星；慶大霉素、頭孢類(lèi)及青霉素類(lèi)藥物等不敏感。

三、結(jié)論與討論

1.結(jié)論。該養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染，金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林敏感，大腸桿菌對(duì)厄他培南與環(huán)丙沙星敏感。根據(jù)喹諾酮類(lèi)藥物與青霉素類(lèi)藥物配伍在治療某些細(xì)菌病時(shí)具有協(xié)同作用，因此選用氨芐西林與環(huán)丙沙星配合使用，協(xié)同增強(qiáng)藥效。在該養(yǎng)殖場(chǎng)混合使用這兩種藥物，取得了良好的治療效果，為臨床上大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合感染提供了合理的治療方案。

◎圖11 大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的進(jìn)化樹(shù)

2.加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。近年來(lái)，在蛋雞的養(yǎng)殖過(guò)程中，病原體混合感染的病例越來(lái)越多，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了較大危害。該養(yǎng)殖場(chǎng)雞群被金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合感染，主要原因是該養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)于生物安全的重要性認(rèn)識(shí)不夠，雞舍通風(fēng)不暢，糞便清理不及時(shí)，雞舍消毒不徹底，雞舍環(huán)境較差，導(dǎo)致雞群免疫力下降，被環(huán)境中的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌感染而患病。大腸桿菌與金黃色葡萄球菌都是條件致病菌，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、不注重生物安全都會(huì)增加感染風(fēng)險(xiǎn)，因此建議該養(yǎng)雞場(chǎng)場(chǎng)主加強(qiáng)對(duì)生物安全知識(shí)的學(xué)習(xí)，強(qiáng)化養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)雞群疫病檢測(cè)、防控工作：定期對(duì)雞進(jìn)行預(yù)防接種；及時(shí)清理糞便，加強(qiáng)衛(wèi)生消毒，做好雞舍內(nèi)的衛(wèi)生工作；注意給雞群做好防寒保暖，適當(dāng)補(bǔ)充光照；科學(xué)飼喂，嚴(yán)格控制飼養(yǎng)人員流動(dòng)。

3.重視實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。該養(yǎng)殖場(chǎng)在雞群發(fā)病前期根據(jù)過(guò)往經(jīng)驗(yàn)，使用了慶大霉素一種抗生素進(jìn)行治療。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定，發(fā)病雞是由金黃色葡萄球菌和大腸桿菌這兩種細(xì)菌感染導(dǎo)致的，慶大霉素只對(duì)金黃色葡萄球菌敏感，對(duì)大腸桿菌并不敏感，因此經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的用藥不僅未見(jiàn)好轉(zhuǎn)，反而損失慘重。胡慧等對(duì)河南某養(yǎng)雞場(chǎng)感染大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的雛雞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果是環(huán)丙沙星與慶大霉素是這兩種菌的首要敏感藥物，對(duì)氨芐西林不敏感。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)藥敏分析，篩選出這兩種細(xì)菌的敏感藥物是氨芐西林與環(huán)丙沙星，與胡慧等的藥敏分析結(jié)果不完全一致，因此不可盲目參考其他養(yǎng)殖場(chǎng)的治療方案。由此可知，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于臨床診斷和治療意義重大，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)不僅可以精確診斷出病原微生物，還可以指導(dǎo)科學(xué)用藥，大大降低死亡率，減少養(yǎng)殖場(chǎng)戶的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展具有重要意義。