HPLC 法測定五指毛桃中補(bǔ)骨脂素含量及質(zhì)量評估

葉曉玲 賴吉儉 張錦炳

五指毛桃也稱五爪毛桃,主要應(yīng)用于肝炎、脾虛浮腫等疾病治療［1］。有研究人員表明［2］,香豆素類是五指毛桃各成分中有效的成分之一,而補(bǔ)骨脂素便是一種呋喃香豆素類化合物,具有抗病毒、消炎等突出作用,在五指毛桃的各項(xiàng)組成成分中,補(bǔ)骨脂素是最為主要的一種有效成分［3］。此次研究獲取來自不同地區(qū)的10 批五指毛桃作為研究樣本,并采用HPLC 法進(jìn)行提取,對波長進(jìn)行設(shè)定,從而對五指毛桃進(jìn)行鑒別和測定,為檢查等方面提供有效的依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 一般資料

1.1 試驗(yàn)藥材 此次獲取的補(bǔ)骨脂素是由中國藥品生物品鑒定所生產(chǎn)及提供的,CAS 號為66-97-7,批號為110739- 201617；所使用的乙腈由上海麥克林生化科技有限公司提供,貨號為A800361-5 ml,色譜純級別,超純水等,在其他研究過程中所用試劑為分析純。此次研究獲取的五指毛桃樣本來自廣西、廣東、云南、福建以及貴州等地,共10 批藥材樣本,將其進(jìn)行編號為1#～10#,并將獲取的五指毛桃樣本做烘干處理,然后將其粉碎,過40 目篩后留備用。

1.2 試驗(yàn)儀器 研究使用了由美國Waters 生產(chǎn)的高效液相色譜儀來進(jìn)行試驗(yàn)檢測,還使用了二極管陣列檢測器以及島津Shim-pack VP-ODS 色譜柱(規(guī)格為長250 mm,粒徑為5 μm,內(nèi)鏡為4.6 mm),日本生產(chǎn),產(chǎn)品貨號為228-34937-91,使用了由廣州瑞明儀器有限公司生產(chǎn)的高FA2104N 型電子分析天平,還使用了由北京天佑恒達(dá)科技有限公司生產(chǎn)的KQ5200 型超聲波清洗器。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜柱條件 此次試驗(yàn)研究主要是將補(bǔ)骨脂素與獲取的樣本實(shí)施190～600 nm 的波長進(jìn)行掃描,從而來對其最大吸收波長進(jìn)行確定。

此次研究使用島津Shim-pack VP-ODS 色譜柱(規(guī)格為長250 mm,粒徑為5 μm,內(nèi)鏡為4.6 mm)；將乙腈-(35∶64)設(shè)定為流動相,洗脫方式為等度洗脫；將流速設(shè)定為1.0 ml/min；檢測波長為246 nm,柱溫為34℃。在此條件下將補(bǔ)骨脂素及其對照品保留10 min左右。

2.2 制備供試品溶液 取出五指毛桃經(jīng)處理后的粉末適量,并以《中國藥典》(2010 年版)［4］附錄中ⅡC方法操作規(guī)定為依據(jù),對五指毛桃粉末進(jìn)行顯微鑒別,同時(shí)以《中國藥典》(2010 年版)附錄中提及的ⅨH、ⅨK、ⅩC 方法為依據(jù)加以操作,分別對五指毛桃樣本中包含的灰分、水分以及醇性浸出物進(jìn)行測定。

2.3 制作補(bǔ)骨脂素對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及精密稱量 將已完成制作的10.4 mg 補(bǔ)骨脂素置于10 ml 量瓶中,然后通過甲醇將其溶解,將容量確定為10 ml,然后使用精密測量儀器制備對照品溶液,溶液的濃度差分別為0.564、2.257、4.514、9.027、18.054、36.108、72.218、144.435 mg/L。然后從各種濃度的對照品溶液中吸取10 μl,使用色譜儀對其峰面積分別進(jìn)行測量,將縱坐標(biāo)設(shè)置成峰面積積分值,將橫坐標(biāo)設(shè)置成補(bǔ)骨脂素對照品的量,然后通過線性回歸方式進(jìn)行分析,通過分析得出結(jié)果為r=0.9997,線性范圍是0.5～290.0 μg。然后再使用精密儀器將對照品溶液吸取,取量為10 μl,依據(jù)研究過程中設(shè)置的色譜條件,重復(fù)檢測樣品,檢測次數(shù)為6 次,對所測峰面積進(jìn)行記錄,通過分析顯示得出補(bǔ)骨脂素的峰面積RSD 值可達(dá)0.52%,這表明儀器的精密度較為良好,可對其進(jìn)行使用。

2.4 穩(wěn)定性評估 將同批次樣本供試樣溶液10 μl,通過精密儀器將其吸取,吸取量為10 μl,然后馬上對樣本補(bǔ)骨脂素的含量進(jìn)行測定,并分別在2、4、12、24 h后通過同樣的測定方法進(jìn)行測量,通過測量結(jié)果顯示,補(bǔ)骨脂素的鋒面值RSD 可達(dá)到0.64%,此測定結(jié)果說明此樣本在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性表現(xiàn)良好。

2.5 重復(fù)性檢測 以隨機(jī)的方式從10 份樣本中抽取出同批次五指毛桃,取量應(yīng)為1 g,并將其制備成供試樣本,對每個(gè)樣本之中的補(bǔ)骨脂素含量進(jìn)行檢測,通過檢測結(jié)果顯示RSD 可達(dá)1.82%,此結(jié)果說明這種方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 加樣回收試驗(yàn) 準(zhǔn)備好濃度為210 mg/L 的1 ml補(bǔ)骨脂素,并將該材料加入到精密儀器之中,液體完成揮發(fā)之后,稱取同批次含補(bǔ)骨脂素的五指毛桃,稱取量為0.6 g,然后將其制備成供試樣本,通過檢測,其平均回收率均能夠達(dá)到90%以上,其中,RSD 可達(dá)1.926%,通過加樣回收試驗(yàn)研究結(jié)果表明,此次研究所采取的全部方法具有良好的回收效果,詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.7 檢測樣本含量 此次研究對各產(chǎn)地五指毛桃的粉末樣本進(jìn)行了測量,樣本取量為1.0 g,通過HPLC 法對所選樣本進(jìn)行檢測,通過檢測結(jié)果表明,所有五指毛桃樣本中補(bǔ)骨脂素的含量均在0.043%～0.069%之間,其中,廣東河源地區(qū)的五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量最高,為0.069%,見表2。色譜圖見圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂素對照品(A)與五指毛桃(B)高效液相色譜圖

表2 各樣本五指毛桃補(bǔ)骨脂素含量檢測結(jié)果匯總

3 討論

五指毛桃是桑科植物的一種,雖然其名字里面含有“桃”字,但其并不是桃,之所以稱之為“五指毛桃”主要是因其葉子長得像五指,并且葉片上分布著較多的細(xì)毛,當(dāng)其果實(shí)成熟的時(shí)候,果實(shí)外表與毛桃非常相像,從而稱之為“五指毛桃”［5］。該植物具有較高的藥用價(jià)值,是健脾補(bǔ)肺、行氣利濕、舒筋活絡(luò)的專用中草藥［6］。有研究對五指毛桃的乙醇提取物的醋酸乙酯及氯仿進(jìn)行了化學(xué)成分研究［7］,研究分離得到4 種化合物,之后又通過質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、薄層色譜法、紫外光譜法、紅外光譜法以及高效液相色譜法等方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定,通過鑒定得出,五指毛桃所含4 種主要化合物分別為補(bǔ)骨脂素、β-谷甾醇、佛手柑內(nèi)酯以及鄰苯二甲酸二異丁酯［8］。

而從民族用藥經(jīng)驗(yàn)方面來看,五指毛桃被使用的疾病更加廣泛,例如肺氣腫、重癥肌無力等方面的疾病,五指毛桃均可發(fā)揮一定的功效［9］。當(dāng)前國家地方相關(guān)藥物質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)只是從TLC 鑒別一級性狀等方面來對五指毛桃的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)和檢測［10］,這種評測方式無法滿足五指毛桃大面積規(guī)?；N植的臨床需求。早于2004 年,我國發(fā)布了《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》［11］,但作為盛產(chǎn)五指毛桃的大省,該標(biāo)準(zhǔn)中居然并未收錄五指毛桃的相關(guān)含量檢測項(xiàng)目,而從上述內(nèi)容中可以了解到,其中包含的有效成分的極性比較小,通常采取極性較小的溶劑進(jìn)行展開測定,通過甲苯-丙酮、正乙烷-醋酸乙酯、氯仿-正丁醇等一系列展開劑依據(jù)薄層色譜法來進(jìn)行試驗(yàn)［7,12］,通過補(bǔ)骨脂素對照品以及對照藥材來實(shí)施對照,即便是采取這些方法,五指毛桃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也未曾收錄［13］。所以應(yīng)該構(gòu)建更為科學(xué)合理的五指毛桃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),從而使《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》得以完善,并且還能夠?yàn)椤吨袊幍洹窐?gòu)建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系創(chuàng)造相應(yīng)的參考條件。可見五指毛桃的藥學(xué)價(jià)值是非常大的［14］。

在本次研究中,通過HPLC 法對五指毛桃進(jìn)行提取過程中,對其樣本采集、試劑提取、波長測量等實(shí)施了細(xì)致的研究,最后對HPLC 提取的具體流程進(jìn)行了確定,最后選擇了流動性乙腈-水完成分離,采用甲醇進(jìn)行提取,超聲波提取,通過此次研究結(jié)果顯示,補(bǔ)骨脂素的提取方法具有較高的精密度,并且在穩(wěn)定性方面也比較高,在可重復(fù)性方面比較強(qiáng),這些研究結(jié)果充分證實(shí)了該研究方法的有效性,可以作為五指毛桃質(zhì)量控制的相關(guān)參考依據(jù)。同時(shí),此次研究還進(jìn)行了加樣回收試驗(yàn),經(jīng)試驗(yàn)研究得出,檢測的平均回收率均可達(dá)到90%以上,平均回收率可達(dá)到99.56%,RSD 為1.926%,說明此次研究的方法具有良好的回收效果,最后,對樣本含量進(jìn)行了檢測,主要檢測了10 個(gè)樣本補(bǔ)骨脂素含量,經(jīng)檢測得出,10 個(gè)樣本中補(bǔ)骨脂素含量最高為0.069%,最低含量為0.043%。此外,此次研究結(jié)論彌補(bǔ)了以往研究中的不足,例如,上文所述研究并未對不同產(chǎn)地五指毛桃作為研究,僅對不同采收年份、不同類型品種以及不同采收季節(jié)三個(gè)方面得出研究結(jié)果,而本次研究則選擇了我國10 個(gè)市對五指毛桃中補(bǔ)骨脂素的含量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究,并得出廣東河源的五指毛桃補(bǔ)骨脂素的含量最高,這也是該地區(qū)規(guī)?；N植五指毛桃的主要依據(jù),對不同產(chǎn)地五指毛桃中補(bǔ)骨脂素含量的研究便是對當(dāng)前研究不足的完善。

綜上所述,經(jīng)過程序優(yōu)化后的HPLC 法對補(bǔ)骨脂素的提取更加簡單快捷,可行性表現(xiàn)突出,并且能夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,能夠?qū)ξ逯该业馁|(zhì)量評估提供有效依據(jù),應(yīng)予以推廣。