• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DNA雙鏈退火壓力對DNA聚合酶gp5鏈置換的調(diào)控*

    2021-08-14 07:54:40賈棋樊秦凱侯文清楊晨光王利邦王浩徐春華李明陸穎
    物理學報 2021年15期
    關(guān)鍵詞:解旋酶外切雙鏈

    賈棋 樊秦凱 侯文清 楊晨光 王利邦王浩 徐春華 李明 陸穎?

    1) (中國科學院物理研究所, 北京 100190)

    2) (中國科學院大學, 北京 100049)

    DNA聚合酶是執(zhí)行DNA復(fù)制和修復(fù)的重要蛋白, 由于其只能從5′向3′方向聚合, 所以在聚合雙鏈DNA時會有兩種模式: 其一是先打開DNA雙鏈, 讓其暴露出3′-5′方向的模板鏈(先導(dǎo)鏈), 然后沿著這條鏈復(fù)制出新鏈以此置換舊鏈, 這就是鏈置換的合成.另一種是沿著已經(jīng)置換出的5′-3′方向的模板鏈(滯后鏈)進行延伸合成.T7噬菌體作為常被研究的模式生物, 其DNA聚合酶gp5在復(fù)制過程中既會參與鏈置換也會參與延伸合成, 已有的研究報道gp5自身獨立鏈置換的能力很弱, 其與T7解旋酶gp4耦合形成復(fù)制體后可以發(fā)生快速且持續(xù)的鏈置換, 這一現(xiàn)象的分子機制尚待厘清.本文通過單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法對gp5聚合過程的動力學進行了研究, 發(fā)現(xiàn)gp5在沒有外力幫助下時會進入鏈置換-外切的循環(huán), 導(dǎo)致聚合難以延伸, 調(diào)控這一循環(huán)的關(guān)鍵則是DNA雙鏈退火壓力.進一步的實驗表明gp5和gp4形成復(fù)制體后,gp4輔助gp5克服了退火壓力從而聚合可以延伸.

    1 引 言

    DNA復(fù)制過程中解旋酶和聚合酶會形成一個復(fù)制體先解開DNA雙鏈讓其形成3′-5′方向先導(dǎo)鏈和5′-3′方向滯后鏈.在先導(dǎo)鏈上聚合酶聚合的方向和打開DNA的方向是一致的, 所以會連續(xù)復(fù)制并且會置換出滯后鏈, 這種復(fù)制又被稱為鏈置換.而滯后鏈上聚合酶聚合的方向與打開DNA的方向相反, 只能打開一段再合成一段導(dǎo)致其合成是不連續(xù)的進而形成岡崎片段[1,2].由于DNA復(fù)制機制在各個物種間是高度保守的[1], 而T7噬菌體復(fù)制時所需蛋白非常簡單, 僅由DNA聚合酶(gp5)、DNA解旋酶(gp4)及單鏈結(jié)合蛋白(gp2.5)組成,是一個良好的研究模型[3-5].形成復(fù)制體后gp5聚合酶有著高速合成DNA的能力, 其鏈置換速度在飽和的脫氧核糖三磷酸(100 μmol/L dNTP)下可以達到200個核苷酸(nt)每秒[6,7].gp4作為解旋酶, 其單獨解旋速度在飽和脫氧脫氧胸苷三磷酸(1 mmol/L dTTP)下只能達到20 nt每秒, 遠遠低于gp5的速度[6-8].最近, 冷凍電鏡的研究發(fā)現(xiàn),gp5的前端有一個起到打開DNA雙鏈效果的氨基酸二級結(jié)構(gòu)[9], 也就是說gp5自身具有打開雙鏈的能力.又有報道顯示gp5如果沒有g(shù)p4的幫助就難以進行鏈置換[7,10].因此, 聚合酶在先導(dǎo)鏈上鏈置換過程的分子機制值得研究.

    有研究者通過單分子磁鑷的方式對DNA雙鏈施加大于8 pN的拉力時, gp5可以持續(xù)鏈置換但是也有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 而將外力變小, 持續(xù)外切的情況就會更加頻繁導(dǎo)致gp5難以鏈置換[11].這一結(jié)果說明了gp5可以獨自鏈置換, 但是新合成的堿基又會被外切掉.由于技術(shù)局限, 磁鑷無法在完全沒有力作用下(生理條件下)對gp5的鏈置換和外切進行測量, 這也留下了疑問: gp5在沒有力作用下, 有無一定程度的鏈置換及外切的現(xiàn)象.

    這里我們使用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的方法在一個沒有力的生理條件下, 并在一個接近單核苷酸尺度的分辨率下對gp5的鏈置換動力學進行測量.本工作發(fā)現(xiàn)即使沒有外力的幫助, gp5也可以鏈置換, 但是鏈置換到4 nt左右后就會回退.通過突變掉外切活性的蛋白, 證明了這種回退是外切導(dǎo)致的.為了證明退火壓力對gp5的影響, 本文使用了納米張力器的FRET方法,對DNA雙鏈施加了一個微小的力[12,13], 以此來減弱DNA雙鏈的退火壓力.施加力后外切的長度減小、鏈置換的長度提高了.進一步的實驗發(fā)現(xiàn)gp4和gp5形成了復(fù)制體后合成速度會有一定升高, 而其最主要的特征是不再有外切的出現(xiàn).這說明了gp4幫助gp5克服了DNA的退火壓力, 從而減少了gp5外切的發(fā)生.

    2 實驗材料與方法

    2.1 聚丙烯酰胺電泳凝膠實驗步驟

    首先配置12%聚丙烯酰胺電泳凝膠: 48 g尿素, 30 mL 40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(19∶1)溶液, 10 mL 10 × TBE, H2O(補足100 mL), 10%APS 700 μL, TEMED 66 μL.配置好后在電泳儀上以400 V的電壓預(yù)跑30 min.在這一過程中準備電泳的樣品, 分別是樣品1: 10 nmol/L DNA;樣品2: 加入40 nmol/L DNA, 40 nmol/L gp5,100 μmol/L dNTP, 1 mmol/L二 硫 疏 糖 醇 在37 ℃水浴反應(yīng)1 min后用100 mmol/L EDTA終止反應(yīng); 樣品3: 使用exo—gp5, 其余和樣品2一樣; 樣品4: 和樣品2一樣, 但是反應(yīng)時間為5 min;樣品5: 和樣品3一樣, 但是反應(yīng)時間為5 min.然后將5個樣品加入不同的條帶處進行3 h的電泳,最后用凝膠成像儀分析條帶位置.

    2.2 單分子實驗玻片的清洗與修飾

    首先使用丙酮、甲醇、食人魚洗液(濃硫酸+雙氧水)對玻片進行深度清潔, 接著使用硅烷化試劑進行修飾, 最后使用100∶1的mPEG和biotin-PEG經(jīng)行修飾.詳情可以見參考文獻[14].

    2.3 單分子熒光共振能量實驗步驟

    首先將上訴的玻片用雙面膠粘成具有不同通道的樣品池, 接著加入鏈酶親和素連接波片的biotin-PEG, 然后加入100 pmol/L DNA, 最后加入1 nmol/L gp5和4 μmol/L dNTP, 收集Cy3和Cy5的光強信息, 并以此計算熒光轉(zhuǎn)移效率.對于gp5和gp4一起加入的實驗過程為, 先體外孵育1 nmol/L gp5, 20 nmol/L gp4和100 μmol/L dTTP形成復(fù)合體再加入到樣品池中.

    2.4 蛋白和緩沖液

    gp5購買于NEB公司, exo—gp5購買于GE health公司.gp4按照文獻[15]的方法純化得到.dNTP購買于Takara公司.DNA購買于上海生工公司, 退火的方法詳見文獻[16].實驗時的緩沖體系為: 50 mmol/L NaCl, 20 mmol/L pH為7.9的Tris緩沖液, 10 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L DTT.

    3 結(jié)果與討論

    3.1 外切活性對gp5鏈置換的影響

    之前的文獻認為持續(xù)外切是導(dǎo)致gp5無法鏈置換的原因[11], 為了直接證明這一點, 本文使用突變了外切活性的exo—gp5作為對照組實驗(為了區(qū)分, 在后續(xù)的結(jié)果與討論部分, 把沒有突變的野生型gp5寫作exo+gp5), 并建立了如圖1(a)所示的DNA, 其引物鏈末端標記了Alexa488, 而變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)被用來分離這些引物鏈,最后使用488 nm激光照明就可以特異性地得到引物鏈的長度, 進而得知DNA聚合酶的鏈置換情況.通過對比exo+gp5和exo—gp5反應(yīng)產(chǎn)物, 從圖1(b)電泳結(jié)果的第3道中可以發(fā)現(xiàn)在1 min的時間內(nèi)exo—gp5大部分產(chǎn)物都被全部鏈置換了,只有極少數(shù)留在原來的位置, 相反的是, 在圖1(b)電泳結(jié)果的第2道中exo+gp5只有極少數(shù)全部被鏈置換.不僅如此, exo+gp5還外切了一些原有DNA.通過在圖1(b)電泳結(jié)果第4道和第5道中展示的延長反應(yīng)時間后的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn): 所有exo—gp5都全部合成了, 但是exo+gp5仍然只有很少的全長延伸產(chǎn)物.從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的結(jié)果可以得知, exo+gp5是一個雙向的馬達, 它既可以鏈置換也可以外切, 但是由于外切活性的存在導(dǎo)致了其鏈置換能力很弱, 甚至會把原有的DNA外切的更短.而如果突變了外切活性, exo—gp5可以獨立的打開DNA雙鏈并進行合成.由于PAGE實驗只展示了最后的結(jié)果, 無法看到exo+gp5在鏈置換與外切中切換的動態(tài)過程, 也就無法測量exo+gp5單次鏈置換和外切的長度和速度,所以我們使用了單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法[17,18]來實時觀測其轉(zhuǎn)化的方式和原因.

    圖1 exo+ gp5和exo— gp5的PAGE實驗 (a)電泳實驗的DNA, 在引物鏈5′端標記有Alexa488; (b) 對Alexa488照明得到的結(jié)果: 第1個條帶為DNA的原始長度, 第2個條帶是exo+ gp5合成1 min后的結(jié)果, 第3個條帶是exo— gp5合成1 min后的結(jié)果, 第4個條帶是exo+ gp5合成5 min后的結(jié)果, 第5個條帶是exo— gp5合成5 min后的結(jié)果Fig.1.PAGE assays of exo+ gp5 and exo— gp5.(a) Illustration of DNA that used in PAGE assays.Alexa488 is labeled on the 5′ overhand of primer DNA.(b) Results of various condition.The first lane: Original length of the DNA.The second lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 1 minute.The third lane: The synthesis-product of exo—gp5 with 1 minute.The fourth lane: The synthesis-product of exo+ gp5 with 5 minute.The fifth lane: The synthesisproduct of exo— gp5 with 5 minute.

    3.2 gp5外切與鏈置換的動態(tài)過程

    構(gòu)建了如圖2(a)所示的Y型DNA, 通過標記在DNA不同單鏈上的Cy3和Cy5來進行測量DNA聚合酶鏈置換的長度和速度.當DNA聚合酶打開DNA雙鏈時, Cy3和Cy5的距離會變遠,進而導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移效率FRET降低, 相反當DNA聚合酶回退時, FRET就會增加.因為FRET和距離的關(guān)系為6次方, 所以這種方法可以達到2—3 ?的精度.

    之前報道中發(fā)現(xiàn)輔助因子Trx會幫助exo+gp5結(jié)合DNA, 進而延長exo+gp5在延伸時的合成長度, 使其從數(shù)十nt的量級變到數(shù)百nt的量級[19].圖2(a)和圖2(b)展示了不加入Trx的對照組實驗結(jié)果, exo+gp5幾乎無法鏈置換, 而從圖2(c)和圖2(d)可以看出加入Trx后exo+gp5可以打開DNA雙鏈進行鏈置換, 進而使得FRET下降,但是FRET下降到一定長度后就會發(fā)生回退.這里我們對曲線中每次下降的長度(synthesis processivity)進行統(tǒng)計, 通過擬合可以發(fā)現(xiàn)下降長度的分布是單e指數(shù)分布, 其分布的平均長度 〈 processivity 〉 = 0.26 ± 0.03 (圖2(g)).根據(jù)文獻[17]結(jié)果在不加力時ΔFRET = 0.07約為1 nt, 也就可以將下降的平均長度換算為約3.7個核苷酸.在之前的工作[11]中認為只有大于8 pN才有合成的出現(xiàn), 而在4 pN時只有外切被發(fā)現(xiàn), 這可能是其精度所限導(dǎo)致的, 無法看到這種短片段的鏈置換.本工作進一步對其鏈置換速度進行分析(鏈置換長度/時間), 發(fā)現(xiàn)其速度即使在低濃度dNTP(4 μmol/L)也可以達到8 nt/s (圖4(d)), 這些現(xiàn)象說明exo+gp5獨自鏈置換的速度是很快的, 但是容易回退.為了直接研究這種回退到底是什么導(dǎo)致的, 采用突變了外切結(jié)構(gòu)域的exo—gp5作為對照組進行了smFRET實驗, 從圖2(e)和圖2(f)可以發(fā)現(xiàn)在exo—gp5的實驗中幾乎就沒有回退的現(xiàn)象, 這說明了回退的確是外切導(dǎo)致的.之前的單分子文獻發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶在鏈置換時有持續(xù)外切的現(xiàn)象, 但是由于都是在施加外力的情況下發(fā)現(xiàn)的, 所以可能無法證實沒有力的情況下是否還有持續(xù)外切[11,20,21].我們對曲線中每次回退的長度(excision processivity)進行了統(tǒng)計, 從圖2(h)的擬合可以發(fā)現(xiàn)其長度的分布也是單e指數(shù)衰減的,平均長度為0.24 ± 0.03, 換算后就是在3.4 nt左右, 這一現(xiàn)象驗證了即使沒有外力的介入, exo+gp5在鏈置換時也有持續(xù)外切的現(xiàn)象.通過這些實驗可以發(fā)現(xiàn), gp5鏈置換到4 nt左右時, exo+gp5就開始外切, 而由于鏈置換和外切的長度差不多,聚合酶此時進入了鏈置換-外切的循環(huán)中無法真正的進行鏈置換.本文也發(fā)現(xiàn)如果外切活性突變后,聚合酶就可以一直鏈置換, 但是沒有了外切活性,聚合酶的復(fù)制保真度會大大降低, 導(dǎo)致生命復(fù)制的錯誤率增加.

    圖2 T7 DNA聚合酶gp5不斷重復(fù)鏈置換和外切 (a), (b)沒有結(jié)合輔助因子Trx時聚合酶無法鏈置換DNA雙鏈; (c), (d)有輔助因子Trx時聚合酶能夠部分鏈置換DNA, 但是會回退; (e), (f)外切活性突變后的gp5不會再外切; (g) exo+ gp5 + Trx實驗中合成長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù); (h) exo+ gp5 + Trx實驗中外切長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù)Fig.2.T7 DNA polymerase gp5 repeats in synthesis-excision cycle: (a), (b) exo+ gp5 cannot have displacement synthesis without co-factor Trx; (c), (d) gp5 with Trx repeats in synthesis-excision cycle; (e), (f) exo— gp5 attain full-length displacement synthesis without excision; (g) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx, the distribution is well fit by an exponential;(h) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5+ Trx, the distribution is well fit by an exponential.

    3.3 力對野生型gp5鏈置換長度的影響

    通常認為聚合酶的外切功能只會切除錯誤的核苷酸, 而exo+gp5只有萬分之一的概率插入錯誤的核苷酸[22], 所以鏈置換過程中的外切不全是錯誤導(dǎo)致的.上面的實驗發(fā)現(xiàn)外切是要exo+gp5鏈置換到一定程度后才會明顯出現(xiàn)的, 鏈置換的過程伴隨的是舊雙鏈退火壓力.為了證明是力改變了exo+gp5的模式, 我們通過圖3(a)所示的納米張力器來研究力對外切的影響.納米張力器的原理是通過一段彎曲的雙鏈DNA來對需要鏈置換的DNA施加張力, 這個張力大概在5—6 pN左右,而此時根據(jù)計算[12]ΔFRET = 0.11為1 nt, 也就對實驗精度有進一步的提高.通過實驗發(fā)現(xiàn)當張力加到DNA上后, 聚合酶鏈置換長度和外切長度仍然是單e指數(shù)衰減的分布(圖3(c)和圖3(d)),經(jīng)過換算后, 聚合酶的速度稍微有提高到9 nt/s(圖3(b)和圖4(d)), 而外切的平均長度變?yōu)?.9 nt,比不加力的情況稍微變小, 這意味著外切程度變低了.另一方面聚合酶的鏈置換平均長度變?yōu)榱?.9 nt, 比不加力變長了, 但是這種變長仍然無法完全鏈置換, 這說明了在6 pN的外力幫助下, gp5仍然無法克服退火壓力的影響.

    圖3 T7 DNA聚合酶gp5外切的原因是退火壓力 (a)納米張力器示意圖; (b) 納米張力器實驗的典型曲線; (c) exo+ gp5 +Trx在受力后合成長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù); (d) exo+ gp5 + Trx受力后外切長度的統(tǒng)計圖, 其分布滿足單e指數(shù)Fig.3.DNA regression pressure induced exonuclease activity: (a) Illustration of nanotensionior; (b) typical trace from assay of nanotensionior; (c) histogram of synthesis processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential; (d) histogram of excision processivity from assay of exo+ gp5 + Trx with tension, the distribution is well fit by an exponential.

    3.4 解旋酶幫助聚合酶克服了退火壓力解旋酶對聚合酶鏈置換的影響

    我們之前的工作發(fā)現(xiàn)單獨加入gp4解旋速度是很慢的[16], 而單獨加入exo+gp5就無法完全鏈置換.為了研究復(fù)制體鏈置換的情況, exo+gp5,Trx和gp4以及dTTP被體外孵育好后加入到反應(yīng)池中(圖4(a)), 通過圖4(b)所示曲線可發(fā)現(xiàn)鏈置換速度變快了而且也沒有外切的出現(xiàn).由圖4(d)可知, 復(fù)制體的速度(14 nt/s)快于聚合酶單獨的速度(8 nt/s), 而加入gp4后最大的特點就是聚合酶不再回退(圖4(c)).這說明了聚合酶打開雙鏈后, 由于解旋酶阻擋了退火壓力, 聚合酶可以持續(xù)鏈置換而不會外切, 這就使得兩者配合在一起, 解旋酶阻擋聚合酶不再外切, 而聚合酶幫助解旋酶打開雙鏈.這里值得注意的是, 外切對于聚合酶的保真度是有很大幫助的[23,24], 在加入gp4后不再出現(xiàn)外切,這雖然提高了合成效率但是可能降低了保真度.

    圖4 T7 DNA解旋酶幫助聚合酶克服退火壓力 (a) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換的示意圖, (b) gp4, exo+ gp5和Trx共同鏈置換時的典型曲線; (c) exo+ gp5 + Trx + gp4可以完全鏈置換; (d)不同情況的鏈置換速度Fig.4.gp4 decrease DNA regression pressure which facilitate gp5 to attain processive strand-displacement synthesis: (a) Illustration of displacement by gp4, exo+ gp5 and Trx; (b) typical trace from assay of gp4, exo+ gp5 and Trx; (c) exo+ gp5 + Trx +gp4 attain processive synthesis; (d) synthesis speed in various condition.

    3.5 聚合酶鏈置換的機制

    如圖5(a)所示單獨的聚合酶面對DNA雙鏈時, 能夠打開雙鏈, 但是其合成長度非常的低, 其原因在于退火壓力的出現(xiàn), 這種壓力使得聚合酶無法在打開雙鏈后順利插入核苷酸只能進行外切的反應(yīng), 而外切一旦開始就會持續(xù)3—4 nt左右導(dǎo)致過度外切的出現(xiàn), 當外切完后聚合酶又進入了鏈置換模式.單獨的聚合酶就會一直陷入這種聚合-外切循環(huán).但是有了解旋酶加入后, 如圖5(b)所示解旋酶幫助聚合酶承受了退火壓力, 使得聚合酶可以鏈置換.另一方面由于聚合酶打開雙鏈的能力很強, 這也就幫助了解旋酶進行解旋.這種互相配合使得復(fù)制體可以快速地進行鏈置換.

    圖5 T7 DNA聚合酶不同情況鏈置換時的模型 (a) 野生型gp5單獨鏈置換時進入鏈置換和外切的循環(huán); (b) 野生型gp5在gp4的幫助下, 沒有外切的出現(xiàn)可以持續(xù)鏈置換Fig.5.Model for gp5 strand displacement activity in various condition: (a) exo+ gp5 repeats in synthesis-excision cycle; (b) gp4 facilitate exo+ gp5 to attain processive strand-displacement synthesis.

    之前的文獻證明聚合酶和解旋酶不是一直同步進行的, 而是會有脫耦的出現(xiàn)[25].這些情況都需要野生型gp5本身有一定的鏈置換能力, 在本實驗中發(fā)現(xiàn)野生型gp5能夠獨立鏈置換4 nt左右才容易外切, 也就是說野生型gp5和gp4之間可以存在4 nt的脫耦而不影響復(fù)制體的合成.之前我們的工作也發(fā)現(xiàn)了gp4的解旋甚至有換鏈的情況[26],這種情況也說明了需要野生型gp5具有一定的獨立鏈置換能力, 否則DNA的復(fù)制就會完全停止.

    4 結(jié) 論

    本工作使用smFRET的方法發(fā)現(xiàn)gp5能夠獨自鏈置換, 但是其鏈置換4個核苷酸后就會由于退火壓力的影響, 進而外切核苷酸.有趣的是這種外切是有持續(xù)性的, 過度的外切會降低合成的效率.當對DNA施加力來抵抗退火壓力后, gp5合成的會變長, 外切會變短, 這說明了gp5的外切活性是受力調(diào)控的, 力越大越不容易出現(xiàn)外切.而加入解旋酶后, 幫助聚合酶克服了退火壓力, 使得聚合酶可以一直合成核苷酸.這種獨特的模式使得gp5, gp4的協(xié)同下可以快速的進行鏈置換.

    猜你喜歡
    解旋酶外切雙鏈
    關(guān)于橢圓外切平行四邊形的一個幾何不變量
    二氫楊梅素對Bloom解旋酶結(jié)構(gòu)和生物學活性的影響
    RNA解旋酶在細胞中的功能研究進展*
    蠶學通訊(2019年4期)2019-04-15 01:54:40
    探究拋物線內(nèi)接、外切三角形的性質(zhì)
    漢防己甲素衍生物HL-27對BLM解旋酶生物學特性的影響
    單分子技術(shù)研究T 7解旋酶的解旋與換鏈?
    物理學報(2018年11期)2018-06-19 10:04:22
    橢圓內(nèi)接外切六邊形的幾何特性研討
    圓外切三角形與圓的關(guān)系
    高新區(qū)科技企業(yè)孵化網(wǎng)絡(luò)“雙層雙鏈”結(jié)構(gòu)研究
    淺析TTT雙鏈刮板輸送機驅(qū)動運行與故障排除
    河南科技(2014年12期)2014-02-27 14:10:34
    亚洲欧美日韩东京热| 欧美日本视频| 亚洲第一电影网av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美中文综合在线视频| svipshipincom国产片| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av熟女| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄频高清免费视频| 18禁美女被吸乳视频| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女高潮的动态| 久久性视频一级片| 日本 欧美在线| 国产成人精品无人区| 色播亚洲综合网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲 国产 在线| 激情在线观看视频在线高清| 91九色精品人成在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲在线自拍视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 99国产精品99久久久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人三级做爰电影| 在线播放国产精品三级| 日本黄色片子视频| 久久这里只有精品19| 日本黄色片子视频| 色av中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 日本在线视频免费播放| 黄色片一级片一级黄色片| 国产黄a三级三级三级人| 一进一出好大好爽视频| 亚洲,欧美精品.| 午夜免费观看网址| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人国产综合亚洲| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久99久视频精品免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 日韩欧美免费精品| 97超视频在线观看视频| 精品人妻1区二区| av福利片在线观看| 色综合婷婷激情| 国产精品永久免费网站| 亚洲人与动物交配视频| 久久亚洲真实| 淫秽高清视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 免费看a级黄色片| 色哟哟哟哟哟哟| 激情在线观看视频在线高清| 一级毛片高清免费大全| 在线播放国产精品三级| 美女高潮的动态| 一级作爱视频免费观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 麻豆国产97在线/欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆成人午夜福利视频| av片东京热男人的天堂| 一进一出抽搐动态| 十八禁人妻一区二区| 欧美激情在线99| 国产伦人伦偷精品视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜激情欧美在线| 精品日产1卡2卡| 国产单亲对白刺激| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 黑人欧美特级aaaaaa片| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲av成人av| 国产三级在线视频| 久久久久久九九精品二区国产| 一区二区三区高清视频在线| 午夜免费成人在线视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲激情在线av| 国产成人福利小说| av欧美777| 日韩欧美精品v在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本五十路高清| 国产三级在线视频| 丰满的人妻完整版| 一个人免费在线观看的高清视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲精华国产精华精| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 丝袜人妻中文字幕| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品456在线播放app | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 在线观看午夜福利视频| 免费看十八禁软件| 精品一区二区三区视频在线 | 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 校园春色视频在线观看| 国产视频内射| 亚洲成人久久爱视频| 国产淫片久久久久久久久 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人欧美大片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产毛片a区久久久久| 黄色成人免费大全| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲国产欧美网| 国产激情欧美一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 高清在线国产一区| 99热这里只有精品一区 | 亚洲成av人片在线播放无| 天堂网av新在线| 亚洲国产欧美网| 在线a可以看的网站| 日韩人妻高清精品专区| 久久精品国产清高在天天线| 麻豆国产97在线/欧美| 精品乱码久久久久久99久播| 久久99热这里只有精品18| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲精华国产精华精| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 操出白浆在线播放| 级片在线观看| 手机成人av网站| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲精品色激情综合| 亚洲美女视频黄频| 色吧在线观看| а√天堂www在线а√下载| 午夜精品在线福利| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 少妇的逼水好多| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久伊人香网站| av黄色大香蕉| 国产成人精品久久二区二区免费| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲色图av天堂| 男女午夜视频在线观看| 亚洲av美国av| cao死你这个sao货| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产极品精品免费视频能看的| 在线观看一区二区三区| 岛国视频午夜一区免费看| 欧美日韩乱码在线| 亚洲黑人精品在线| 青草久久国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文字幕久久专区| 欧美日韩精品网址| 国产野战对白在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 日日干狠狠操夜夜爽| 视频区欧美日本亚洲| 69av精品久久久久久| 国产美女午夜福利| 国产综合懂色| 精品福利观看| 999久久久精品免费观看国产| www.自偷自拍.com| 国产野战对白在线观看| 精品国产三级普通话版| www.999成人在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一夜夜www| 久久久久九九精品影院| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 99久久精品一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲,欧美精品.| 国产精品九九99| 国产精品av久久久久免费| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费看十八禁软件| 好男人在线观看高清免费视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产单亲对白刺激| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久国产精品人妻蜜桃| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日本视频| 亚洲色图av天堂| 日本黄大片高清| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 美女免费视频网站| 午夜免费观看网址| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 偷拍熟女少妇极品色| 91久久精品国产一区二区成人 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲美女视频黄频| 亚洲,欧美精品.| 老鸭窝网址在线观看| 日本黄色片子视频| 人人妻人人看人人澡| 成人av一区二区三区在线看| 91av网一区二区| 1024香蕉在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美极品一区二区三区四区| 又黄又粗又硬又大视频| 男女午夜视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 黄色片一级片一级黄色片| 国产v大片淫在线免费观看| 免费在线观看日本一区| av福利片在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 日本a在线网址| 老司机午夜福利在线观看视频| 两个人看的免费小视频| 脱女人内裤的视频| 黑人操中国人逼视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲欧美98| 亚洲av成人一区二区三| 嫩草影视91久久| 精品国产三级普通话版| 国产av不卡久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 俺也久久电影网| 亚洲avbb在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 最近视频中文字幕2019在线8| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 波多野结衣高清无吗| 中文字幕熟女人妻在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品久久久久久精品电影| 嫁个100分男人电影在线观看| 中出人妻视频一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲欧美在线一区二区| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲av成人精品一区久久| 黄色 视频免费看| 久久久久久大精品| 成年免费大片在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产午夜精品论理片| 一区二区三区高清视频在线| 床上黄色一级片| 一级作爱视频免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品98久久久久久宅男小说| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久99热这里只有精品18| 免费大片18禁| 好男人在线观看高清免费视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产主播在线观看一区二区| 观看美女的网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美不卡视频在线免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲九九香蕉| 国产淫片久久久久久久久 | 国产激情欧美一区二区| 日本成人三级电影网站| 丁香欧美五月| 九九热线精品视视频播放| 免费观看的影片在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 91在线观看av| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品久久久久久精品电影| 午夜亚洲福利在线播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 黄色 视频免费看| 国产精品一及| 91久久精品国产一区二区成人 | 日韩三级视频一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 动漫黄色视频在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 91av网站免费观看| 亚洲精品456在线播放app | 91九色精品人成在线观看| 国产三级中文精品| 亚洲,欧美精品.| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 99久久综合精品五月天人人| 国产伦在线观看视频一区| 少妇丰满av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 成在线人永久免费视频| 欧美3d第一页| 日韩国内少妇激情av| 午夜福利欧美成人| 丝袜人妻中文字幕| netflix在线观看网站| 日韩欧美精品v在线| 久久久久九九精品影院| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本五十路高清| 久久久水蜜桃国产精品网| 日韩高清综合在线| 人妻久久中文字幕网| 欧美乱色亚洲激情| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本黄大片高清| 天天添夜夜摸| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 真人做人爱边吃奶动态| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久成人免费电影| 母亲3免费完整高清在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日韩综合久久久久久 | 成人av一区二区三区在线看| a级毛片a级免费在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人永久免费在线观看视频| 精品国产三级普通话版| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 哪里可以看免费的av片| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲七黄色美女视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 此物有八面人人有两片| 亚洲av电影在线进入| 日韩有码中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 嫩草影院精品99| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 999久久久国产精品视频| 久久亚洲真实| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利在线在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 色av中文字幕| 欧美日韩综合久久久久久 | 老汉色∧v一级毛片| 色综合站精品国产| 99久久精品国产亚洲精品| 天天一区二区日本电影三级| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 十八禁人妻一区二区| 人人妻人人看人人澡| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 日韩有码中文字幕| 特级一级黄色大片| 最新中文字幕久久久久 | 成年免费大片在线观看| 超碰成人久久| 一区福利在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品一区二区免费欧美| 精华霜和精华液先用哪个| 十八禁人妻一区二区| 免费观看精品视频网站| 亚洲 国产 在线| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 成人国产综合亚洲| 1024香蕉在线观看| 久久久色成人| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产97色在线日韩免费| 婷婷亚洲欧美| 在线免费观看的www视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av成人一区二区三| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本免费一区二区三区高清不卡| 淫秽高清视频在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产高清视频在线播放一区| 免费观看人在逋| 日本一本二区三区精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久色成人| 激情在线观看视频在线高清| 色综合站精品国产| 99热这里只有是精品50| 一a级毛片在线观看| 亚洲国产精品999在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| www.熟女人妻精品国产| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美乱妇无乱码| 亚洲av五月六月丁香网| 成在线人永久免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品影院久久| 在线观看午夜福利视频| 99国产精品99久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 免费观看的影片在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 国产一区二区在线av高清观看| svipshipincom国产片| 色在线成人网| 午夜激情欧美在线| 精品国产亚洲在线| 欧美黑人巨大hd| 黑人操中国人逼视频| 亚洲av免费在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜两性在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲在线观看片| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩一级在线毛片| 一二三四在线观看免费中文在| or卡值多少钱| 一级毛片精品| 在线免费观看的www视频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产三级在线视频| 久99久视频精品免费| 成年女人看的毛片在线观看| 成人午夜高清在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 一a级毛片在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 精品电影一区二区在线| 香蕉国产在线看| 精品福利观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日本三级黄在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲成av人片免费观看| 免费无遮挡裸体视频| av在线天堂中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 后天国语完整版免费观看| 99国产精品99久久久久| 精品国产三级普通话版| 欧美zozozo另类| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产成人系列免费观看| 一级作爱视频免费观看| 亚洲中文字幕日韩| 中国美女看黄片| 国产乱人伦免费视频| 黄频高清免费视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲片人在线观看| av片东京热男人的天堂| 三级国产精品欧美在线观看 | 国产高清三级在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲电影在线观看av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 色播亚洲综合网| 日韩国内少妇激情av| 久久久久久国产a免费观看| 最新美女视频免费是黄的| 精华霜和精华液先用哪个| 久99久视频精品免费| 精品不卡国产一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 99热精品在线国产| 免费av毛片视频| 欧美一级毛片孕妇| 波多野结衣高清无吗| 青草久久国产| 精品福利观看| 午夜亚洲福利在线播放| 国产1区2区3区精品| 美女黄网站色视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 最好的美女福利视频网| 国产真实乱freesex| 国产精品99久久99久久久不卡| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 18禁观看日本| 国产真实乱freesex| 日本黄大片高清| 国产亚洲精品久久久com| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 午夜福利免费观看在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久,| 无人区码免费观看不卡| 两个人的视频大全免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜免费激情av| 成年女人看的毛片在线观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲成人久久性| 99riav亚洲国产免费| 成人特级黄色片久久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 又紧又爽又黄一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 99热6这里只有精品| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 天堂动漫精品| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产激情偷乱视频一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 一本一本综合久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美精品综合久久99| 一进一出好大好爽视频| 国产探花在线观看一区二区| 90打野战视频偷拍视频| 757午夜福利合集在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024手机看黄色片| 免费看a级黄色片| 欧美中文日本在线观看视频| 国产高清激情床上av| 在线播放国产精品三级| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲专区字幕在线| cao死你这个sao货| 国产视频一区二区在线看| 午夜精品久久久久久毛片777| 午夜福利在线在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 看免费av毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 青草久久国产| 嫩草影视91久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99久久精品热视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久精品国产综合久久久| 欧美激情在线99| 成年女人看的毛片在线观看| 在线看三级毛片| 亚洲美女视频黄频| 国产探花在线观看一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 国产毛片a区久久久久|