鹿血的酶解工藝優(yōu)化及其抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性評價(jià)

杜小琴, 夏 炎, 張小琴, 張萬超, 梁正杰，呂君江, 吳中寶*

鹿血的酶解工藝優(yōu)化及其抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性評價(jià)

杜小琴1, 夏 炎1, 張小琴1, 張萬超1, 梁正杰1，呂君江2, 吳中寶1*

(1. 重慶市藥物種植研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南川 408435；2. 重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 401331)

對鹿血酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對鹿血酶解液進(jìn)行液相色譜分析及抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性評價(jià)。以氨基酸態(tài)氮含量、干燥失重為指標(biāo)，研究動(dòng)物蛋白酶的添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度對鹿血酶解效果的影響；以小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、血尿氮含量、肝糖原含量為指標(biāo)，研究鹿血及酶解液的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性。結(jié)果表明，動(dòng)物蛋白酶的添加量為4 g·L-1，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為55 ℃為較優(yōu)條件，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量為0.63 g·100 mL-1，干燥失重為60.0%。高效液相色譜圖顯示鹿血酶解液色譜峰明顯，而鹿血粉在該色譜條件下色譜峰較少。與空白組相比，鹿血酶解液給藥可極顯著（＜0.01）提高小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、肝糖原含量和降低小鼠血尿氮含量；鹿血粉給藥可極顯著（＜0.01）提高小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，顯著（＜0.05）降低小鼠血尿氮含量，但對肝糖原含量影響較小。鹿血具有較強(qiáng)的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，鹿血酶解液的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性優(yōu)于鹿血粉。

鹿血；酶解；高效液相色譜；運(yùn)動(dòng)疲勞

鹿血是鹿科動(dòng)物梅花鹿（）或馬鹿（）的膛血或茸血。鹿血在我國有較長的食用歷史，2012年國家衛(wèi)生部將梅花鹿血作為普通食品（衛(wèi)監(jiān)督函〔2012〕8號）。鮮鹿血中水分含量占80%左右，有機(jī)成分占16%～17%，其中蛋白質(zhì)含量占13％以上[1]，是鹿血中的主要成分，主要含有17種氨基酸[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，鹿血具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞、降血壓[3]、增強(qiáng)免疫力[4]等生理活性。

運(yùn)動(dòng)疲勞是指機(jī)體不能將它的功能保持在某一特定水平或不能維持某一預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[5]，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)時(shí)能量體系輸出功率和肌肉力量的下降或內(nèi)臟器官功能的下降而不能維持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。關(guān)于鹿血的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)鹿血肽能顯著增加小鼠斷頭喘氣時(shí)間、爬桿時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間及顯著降低游泳后血乳酸的增加量[6-7]。尹曉平等[8]進(jìn)一步研究不同水解程度鹿血肽的抗疲勞活性，發(fā)現(xiàn)水解程度越高其抗疲勞效果越明顯，抗疲勞肽的相對分子量分布在500 ～25 000之間。另有人認(rèn)為相對分子量小于1 000 D的鹿血多肽具有較好的抗疲勞效果[9]。在木瓜蛋白酶酶解的鹿血肽中，必須氨基酸含量為總氨基酸的55.34%，是一種理想的運(yùn)動(dòng)蛋白，支鏈氨基酸為總氨基酸的21.9%[10]，有助于延緩疲勞的出現(xiàn)[11]。

鹿血肽的分子量、含量及水解氨基酸含量及結(jié)構(gòu)影響其抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，然而目前對此還知之甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)對鹿血粉進(jìn)行超微粉碎處理，以氨基酸態(tài)氮、干燥失重為考察指標(biāo)優(yōu)化其酶解條件，并進(jìn)行液相色譜分析及抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性評價(jià)，以期為鹿血的合理利用及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹿血為梅花鹿（）膛血的真空冷凍干燥粉，吉林省吉鹿源生物科技有限公司提供；動(dòng)物蛋白酶（活性為1 500 U·g-1），南寧龐博生物工程有限公司；糧食酒基，重糧酒業(yè)有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性昆明小鼠，4～6周齡，體重20～25 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；血尿氮試劑盒C013-1-1、肝糖原試劑盒A043-1-1，南京建成生物工程研究所有限公司。

Agilent 1260（Ⅱ）高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；DXFT-12型精研混煉機(jī)，山東鼎信超微粉碎技術(shù)有限公司；AB145S 型電子天平，上海上天精密儀器有限公司；RE-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州凱祥儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鹿血粉處理 精研混煉機(jī)進(jìn)行超微粉碎，粉碎時(shí)間25 min，粉碎溫度–19 ～–13 ℃。

1.2.2 鹿血粉酶解 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上略作修改。鹿血粉中加入5倍重量的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍凑? g·L-1比例加入動(dòng)物蛋白酶，攪拌水浴（50 ℃）酶解6 h后90 ℃滅酶20 min，之后迅速冷卻至20 ℃，加入4倍重量57 ℃糧食酒基，攪拌均勻后常溫靜置24 h，真空抽濾，得鹿血酶解液，4 ℃保存。以未進(jìn)行超微粉碎鹿血酶解液為對照，以氨基酸態(tài)氮、干燥失重為考察指標(biāo)，評價(jià)鹿血酶解效果。氨基酸態(tài)氮測定方法參照GB5009.235食品中氨基酸態(tài)氮測定方法進(jìn)行，干燥失重計(jì)算方法見公式（1）。

1.2.3 鹿血酶解條件優(yōu)化 以鹿血超微粉為原料，以氨基酸態(tài)氮、干燥失重為指標(biāo)，考察添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度對鹿血酶解效果的影響，具體操作見1.2.2。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 鹿血酶解工藝因素水平

1.2.4 鹿血及酶解液HPLC成分分析 色譜條件：色譜柱Cosmosil PBr（4.6×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.05%三氟乙酸水溶液（A）- 80%乙腈/0.05%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～5 min 5% B，5～40 min 5% ～60% B，40～53 min 60%～100% B，53～60 min 100%～5% B，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長220 nm，進(jìn)樣量5 μL。供試品處理：鹿血酶解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去乙醇、水，低溫干燥得固體粉末。精密稱取粉末25 mg，置25 mL容量瓶中，加水至刻度搖勻，過濾，取濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾即得，同時(shí)以未酶解鹿血粉為對照。

1.2.5 鹿血及酶解液抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性測定 給藥：選用雄性昆明小鼠42只，分為3組，每組14只。第1組為鹿血粉給藥，第2組為鹿血酶解液給藥（以正交試驗(yàn)優(yōu)化條件制得），第3組為生理鹽水給藥。各組小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水2 d后開始給藥，第1、2組每天18:00灌胃給藥0.2 mL，灌胃劑量150 mg·kg-1，第3組灌胃給同劑量生理鹽水，并自由進(jìn)食和進(jìn)水，連續(xù)給藥10 d。末次給藥30 min后，每組取其中7只進(jìn)行強(qiáng)迫負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)，另外7只進(jìn)行強(qiáng)迫負(fù)重游泳15 min，測定血尿氮、肝糖原含量。

負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)：參照Liu等[12]的方法，略有改動(dòng)。末次給藥30 min后，小鼠尾部負(fù)重5%體重的鎖扣，置于25 ℃恒溫水域中游泳，并記錄游泳力竭時(shí)間。小鼠開始游泳至小鼠頭部完全沒入水面以下10 s不能浮出水面為游泳力竭時(shí)間。若小鼠浮在水面上不動(dòng)，用玻璃棒在其附近攪動(dòng)，使其運(yùn)動(dòng)。

血尿氮含量測定：末次給藥30 min后，將小鼠置于25 ℃恒溫水中游泳15 min，心臟取血，制備血漿（EDTA抗凝血，2 000 r·min-1、20 ℃離心20 min，得血漿），使用二乙酰-肟法測定血尿氮的含量（按試劑盒使用說明測定）。

肝糖原含量測定：未次給藥30 min 后，將小鼠置于25 ℃恒溫水中游泳15 min，取小鼠新鮮肝臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100 mg，使用試劑盒A043-1-1測定肝糖原含量（按試劑盒使用說明測定）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，所有數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以（`x±s）表示，以＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎處理對鹿血酶解效果的影響

如表2所示，經(jīng)超微粉碎處理后，鹿血酶解液干燥失重比對照組高62.2%，氨基酸態(tài)氮含量比對照組多2.1倍，差異均達(dá)到極顯著（＜0.01）。

表2 超微粉碎處理對鹿血氨基酸態(tài)氮、干燥失重的影響

注: **為0.01水平上的顯著性差異。

2.2 鹿血酶解條件的優(yōu)化

如表3所示，極差分析結(jié)果表明在3個(gè)因素中，對鹿血酶解效果影響最大因素是酶添加量，其次是酶解時(shí)間，45～50 ℃時(shí)酶解溫度影響較小。氨基酸態(tài)氮含量、干燥失重2個(gè)指標(biāo)測定結(jié)果均表明較佳的酶解組合是A2B2C3，即動(dòng)物蛋白酶的添加量為4 g·L-1，酶解時(shí)間為6 h，酶解溫度為55 ℃，此時(shí)氨基酸態(tài)氮含量為0.63 g·100 mL-1，干燥失重為60.04%。

表3 鹿血酶解工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3 鹿血及酶解液HPLC成分分析

鹿血及鹿血酶解液HPLC色譜圖如圖1所示。鹿血粉在該色譜條件下色譜峰較少，僅出現(xiàn)2個(gè)較明顯的色譜峰，而鹿血酶解液色譜峰明顯。鹿血酶解液化學(xué)成分復(fù)雜，在220 nm條件下，可較好地分布在2.979～23.981 min的保留時(shí)間范圍內(nèi)，可清晰辨識2個(gè)部分的色譜峰，第1部分保留時(shí)間為2.979～3.661 min；第2部分保留時(shí)間為12.701～23.981 min。

圖1 鹿血（a）及鹿血酶解液（b）的HPLC色譜圖

Figure 1 HPLC chromatogram of dried deer blood () (a) and its hydrolysate (b)

表4 鹿血及酶解液給藥對小鼠游泳時(shí)間、血尿氮和肝糖原含量的影響

注: *和**分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異。

2.4 鹿血及酶解液抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性研究

由表4可知，以優(yōu)化后的鹿血酶解液連續(xù)給藥10 d后，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為(68.82 ± 10.78) min，比對照組的(15.83 ± 5.24) min多3.35倍，差異極顯著（＜0.01）；血清中尿素氮含量為(1 468.74 ± 238.41) mmol·L-1，比對照組少40.2%，差異極顯著（＜0.01）；肝糖原含量為(0.52 ± 0.23) mg·g-1，比對照組多1.9倍，差異極顯著（＜0.01）。對比第1和第2組時(shí)發(fā)現(xiàn)，以鹿血粉、鹿血酶解液連續(xù)給藥10 d后，均可極顯著（＜0.01）提高小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，但兩組之間差異不顯著（≥ 0.05）；在降低小鼠血尿氮含量方面，鹿血酶解液給藥組的效果顯著（＜0.05）優(yōu)于鹿血粉給藥組；在提高小鼠肝糖原含量方面，鹿血酶解液給藥組的效果極顯著（＜0.01）優(yōu)于鹿血粉給藥組。

3 討論與結(jié)論

研究表明，鹿血具有抗疲勞的生理活性，且大多與鹿血多肽的分子量、含量及水解氨基酸含量、構(gòu)成有關(guān)，市場上可見壓片糖果、飲料等鹿血功能性食品，但是對鹿血分子量分布與抗疲勞活性相關(guān)性的研究較少，導(dǎo)致產(chǎn)品功能與成分相關(guān)性模糊不清，難以制定具有科學(xué)依據(jù)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此有必要對此進(jìn)行研究。中藥超微粉是指中藥材經(jīng)超微粉碎設(shè)備處理后制得的超細(xì)粉末，其粒徑一般以達(dá)到微米級為主，部分可達(dá)到亞微米級和納米級[13]。對于大多數(shù)中藥材，其藥用成分主要分布于細(xì)胞內(nèi)，物料經(jīng)超微粉碎后，由于粒度更細(xì)，比表面積顯著增大，細(xì)胞破壁率明顯提高，有效成分可以穿過細(xì)胞壁直接與外部接觸，從而提高藥物的生物利用度，這在白術(shù)[14]、山銀花[15]等中藥材上已見相關(guān)報(bào)道，但對鹿血進(jìn)行超微粉碎處理還鮮見報(bào)道。

前人研究發(fā)現(xiàn)，鹿血的抗疲勞效果隨著水解程度的增加而增加[8]，因此本實(shí)驗(yàn)在酶解之前對鹿血粉進(jìn)行超微粉碎處理，結(jié)果表明超微粉碎處理可極顯著（＜0.05）提高鹿血酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量及鹿血的干燥失重；HPLC色譜圖顯示鹿血酶解液出現(xiàn)較多明顯色譜峰，而鹿血粉在該色譜條件下色譜峰較少。由此說明鹿血經(jīng)超微粉碎、酶解后產(chǎn)生較多氨基酸（支鏈氨基酸）和肽類物質(zhì)。支鏈氨基酸一方面可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)的能量儲備和利用，另一方面能通過競爭性抑制而減少5-羥色胺的合成, 延緩疲勞的出現(xiàn)[16]，這可能是鹿血酶解液給藥組小鼠肝糖原含量極顯著（＜0.01）高于鹿血粉給藥組及對照組的原因。

血尿氮是蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，是評價(jià)機(jī)體運(yùn)動(dòng)疲勞的一個(gè)重要指標(biāo)，機(jī)體對運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的適應(yīng)能力越差，血尿氮增加越明顯，疲勞發(fā)生得越快[17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與鹿血粉給藥相比，鹿血酶解液給藥組可顯著（＜0.05）降低小鼠血尿氮含量，但在提高負(fù)重游泳時(shí)間上，差異不顯著（≥ 0.05），說明鹿血酶解液給藥可延緩小鼠疲勞的發(fā)生，但抗疲勞效果可能不會隨著酶解程度的增加而增強(qiáng)，這與尹曉平等[8]在酶解馬鹿茸血上的結(jié)果不一致，這可能與酶解程度不同有關(guān)，后期可對不同酶解程度鹿血抗疲勞效果進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了鹿血的酶解條件，并對酶解物進(jìn)行液相色譜分析及抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹿血具有較強(qiáng)的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性，鹿血酶解液的抗運(yùn)動(dòng)疲勞活性優(yōu)于原鹿血粉。

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Optimization of enzymatic hydrolysisprocess of dried deer blood() and evaluation of its anti-exercise fatigue activity

DU Xiaoqin1, XIA Yan1, ZHANG Xiaoqin1, ZHANG Wanchao1, LIANG Zhengjie1, LYU Junjiang2, WU Zhongbao1

(1. Bio-resource Research and Utilization Joint Key Laboratory of Sichuan and Chongqing, Chongqing Institute of Medical Planting Material, Nanchuan 408435; 2. Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 401331)

To optimize the enzymatic hydrolysis process of dried deer blood (), the components were analyzed by HPLC (High performance liquid chromatography) and its anti-exercise fatigue activity was further evaluated. An orthogonal experiment was carried out to optimize the parameters (the amount of enzyme, enzymolysis time and temperature) using amino acid nitrogen content and loss on drying as indexes. The anti-exercise fatigue activity was analyzed using swimming time under load, hematuria nitrogen content and muscle glycogen content of mice as indexes. Results indicated that the optimal parameters for enzymatic hydrolysis of dried deer blood were 4 g·L-1of enzyme content, 55 ℃hydrolysis for 6.0 h with 0.63 g·100 mL-1of amino acid nitrogen and 60.0% of loss on drying. HPLC analysis showed that the peak of dried deer blood () was basically few, while the peak of the hydrolysate was obvious. Compared with the control group, the hydrolysate of dried deer blood () could significantly＜0.01) increase the swimming time and the liver glycogen content, decrease the blood urea nitrogen content in the mice; dried deer blood () could increase the swimming time significantly (＜0.01), decrease the blood urea nitrogen content significantly (＜0.05) in the mice, but it had little influence on the liver glycogen content. In conclusion, the anti-exercise fatigue effects of dried deer blood () enhanced notably after being hydrolyzed.

dried deer blood () ; enzymolysis; HPLC; exercise fatigue

S825; TS251.93

A

1672-352X (2021)03-0518-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210706.015

2021-7-7 10:15:14

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210706.1648.030.html

2020-08-18

重慶市科技局項(xiàng)目（19KF10-2012）和重慶市企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專利導(dǎo)航項(xiàng)目（CQIPOS2020）共同資助。

杜小琴，助理研究員。E-mail：duxiaoqin1814@sina.com

吳中寶，副主任中藥師。E-mail：wuzhognbao7788@sina.com