廣聚螢葉甲取食對豚草揮發(fā)物組分的影響

崔少偉，馬 超，張 燕，白 強, 3，陳紅松，臧連生，周忠實*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；3. 云南農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，昆明 650201；4.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，廣西農(nóng)作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室，南寧 530007)

豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.，隸屬于菊科Asteraceae，系一年生直立草本植物，原產(chǎn)于北美，是一種世界性惡性雜草(Crockett, 1977; Kovalev, 1989)。上個世紀30年代豚草入侵我國(Zhouetal., 2010)，現(xiàn)已擴散至我國大部分省市(趙晨晨等, 2017)。在我國，已知的外來入侵植物已超過百種，豚草是其中影響最大、分布最廣的生態(tài)入侵植物之一(王建軍等, 2006)。在入侵地，該草因逃離了天敵等生物因子的制約，種群快速發(fā)展，并暴發(fā)成災(zāi)(周忠實等, 2015)。豚草植株高大，遮擋陽光，壓抑作物，阻礙農(nóng)業(yè)操作，并與農(nóng)作物爭奪水肥，嚴重影響作物產(chǎn)量；且該草植株可產(chǎn)生化感物質(zhì)，抑制本地植物與農(nóng)作物生長(強勝和曹學(xué)章, 2000; Brückneretal., 2001)；其混雜在牧草里，畜禽取食后會降低肉、蛋的質(zhì)量(趙敏, 2003)，對農(nóng)牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失(Clewisetal., 2001)。同時，該草極易在入侵生境中形成單優(yōu)勢種群，影響當(dāng)?shù)厣锒鄻有?，破壞自然生態(tài)平衡(劉靜玲等, 1997)；豚草花粉能引起人類的過敏反應(yīng)-枯草熱，嚴重時，會引起并發(fā)性肺氣腫、肺心病，甚至導(dǎo)致死亡(Gerberetal., 2011)，嚴重威脅人類健康(Chalchatetal., 2004)。在我國豚草生物防治研究過程中，研究人員偶然發(fā)現(xiàn)了廣聚螢葉甲OphraellacommunaLesage，該葉甲屬于鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae，原產(chǎn)于北美(孟玲和李保平, 2005)，其整個生活史都在豚草上完成，以幼蟲和成蟲群集取食豚草，嚴重時可將整株葉片取食殆盡(孟玲和李保平, 2005; 孟玲等, 2007)。目前，在美國、加拿大、墨西哥、日本、韓國、意大利、法國和中國，該葉甲可明顯地抑制豚草的種群數(shù)量(Chenetal., 2018)，是豚草重要的專一性有效生防天敵(Zhouetal., 2014)。

植物可通過多種途徑向周圍環(huán)境釋放信號，而通過釋放揮發(fā)性有機化合物(VOCs, volatile organic compounds)是其中最為重要的方式(Snoerenetal., 2007)。植物VOCs在植物-草食性昆蟲-天敵3個層次的營養(yǎng)關(guān)系、植物-植物相互作用中的揮發(fā)性信號以及植物適應(yīng)性變化中具有極其重要的作用。VOCs可直接影響草食動物寄主選擇、產(chǎn)卵和求偶時的行為(Weietal., 2008)。同時，在植物與植食性昆蟲長期協(xié)同進化過程中，植物在受植食性昆蟲的為害脅迫時逐步形成了誘導(dǎo)性防御反應(yīng)(穆丹等, 2010)，即當(dāng)植物遭受植食性昆蟲的進攻時，會釋放蟲害誘導(dǎo)的VOCs，稱為蟲害誘導(dǎo)物(HIPVs, herbivore-induced plant volatiles)(Kim and Felton, 2013)。HIPVs組分不但可以阻止害蟲取食為害，而且能作為互利素引誘捕食性或寄生性天敵，達到間接防御的目的(Mccormicketal., 2012; Menzeletal., 2014)。研究發(fā)現(xiàn)，植食性昆蟲的為害是HIVPs產(chǎn)生的必要條件，且其釋放具有明顯的滯后反應(yīng)，如棉花在被甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲或美洲棉鈴蟲Helicoverpazea幼蟲為害后第2天才大量釋放HIVPs(許再福, 2000)，勞氏粘蟲Mythimnaloreyi和直紋稻苞蟲Parnaraguttata在為害水稻后的第2天和3天顯著釋放HIPVs(Sobhyetal., 2017)，但并非所有植食性昆蟲的取食都能引致植物釋放HIPVs，如小麥癭蚊Mayetioladestructor的幼蟲取食小麥后，小麥釋放的VOCs并未發(fā)生改變(Tooker and De, 2007)。諸多研究表明，大多數(shù)植物VOCs和HIPVs還對昆蟲的性信息素以及聚集信息素具有增效作用(王香萍等, 2010)。植物VOCs和HIPVs影響植食性昆蟲的寄主選擇、求偶、產(chǎn)卵以及進食等，而植食性天敵昆蟲的這些行為則直接影響其對雜草的防控效果，因此，研究入侵雜草VOCs和HIPVs具有極其重要的意義。然而，目前對蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物的研究主要集中于農(nóng)作物、植食性害蟲以及害蟲天敵之間的關(guān)系(Turlingsetal., 1990; 婁永根和程家安, 1996; Rapusasetal., 1996; Fatourosetal., 2008)，對生防天敵昆蟲為害影響雜草VOCs和HIPVs組分的研究卻鮮有報道。

本研究采用動態(tài)頂空收集裝置收集了不同處理的豚草植株揮發(fā)物，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對揮發(fā)物進行定性和相對定量分析，以期為利用豚草揮發(fā)物提高廣聚螢葉甲對豚草的防治效果奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試植物與昆蟲

豚草種子采自廣西壯族自治區(qū)來賓市興賓區(qū)蒙村鎮(zhèn)，將種子播撒于營養(yǎng)缽內(nèi)育苗，待幼苗生長至高5 cm左右移栽到塑料花盆(10 cm×10 cm)，置于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所網(wǎng)室內(nèi)集體栽培，待其生長至高40 cm左右時，選取健康、長勢良好的植株帶回實驗室(26±1℃、L∶D=14 h∶10 h)，置于養(yǎng)蟲籠(60 cm×50 cm×80 cm)內(nèi)用于飼養(yǎng)試蟲和揮發(fā)物的提取。

廣聚螢葉甲成蟲于2019年6月采自廣西壯族自治區(qū)來賓市象州縣金雞鎮(zhèn)野外豚草植株上，帶回實驗室在體視解剖鏡下辨別雌雄，后飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲籠籠罩的豚草植株上，每個蟲籠放置6株豚草，每株豚草接3對成蟲，待成蟲產(chǎn)卵后，移出帶卵豚草，放入新的豚草，每株豚草保留40粒卵，放置于新養(yǎng)蟲籠內(nèi)飼養(yǎng)至化蛹，將老熟的蛹剪下置于養(yǎng)蟲盒內(nèi)集中羽化，如此飼養(yǎng)至第5代。羽化的成蟲立即分辨雌雄，分開飼養(yǎng)至4～5日齡，挑選健康、個體大小一致、活躍的葉甲用于試驗，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度26±1℃，相對濕度70%±10%，光周期L∶D=14 h∶10 h。

1.2 試驗方法

1.2.1不同處理豚草揮發(fā)物的收集

豚草植株的處理方法：(1)健康植株：株高40 cm完好無損的盆栽豚草植株；(2)機械損傷植株：在揮發(fā)物收集24 h前，用甲醇洗過的解剖剪在健康植株上剪傷6個葉片，每個葉片周圍剪出5個 1 cm長的切口，并在揮發(fā)物提取之前再損傷一次(Dickensetal., 2002)；(3)葉甲取食植株：將廣聚螢葉甲雌、雄蟲各取25頭接于健康植株上取食為害1 d，并在收集揮發(fā)物前清除葉甲及其糞便。各處理豚草揮發(fā)物的收集采用動態(tài)頂空吸附法，吸附裝置連接順序為：送氣泵-干燥塔(凈化空氣)-流量計-洗氣瓶(凈化、濕潤空氣)-玻璃缸(直徑20 cm, 高45 cm)-吸附柱(內(nèi)徑0.8 cm, 長12 cm，內(nèi)填充200 mg Porapak Q吸附劑)-流量計-抽氣泵，各部分之間用醫(yī)用膠管連接，玻璃缸進氣口氣流為400 mL/min，出氣口氣流為400 mL/min，裝置具體情況如圖1。

圖1 動態(tài)頂空收集裝置Fig.1 Dynamic headspace collection device注：①，送氣泵；②、③，干燥塔(內(nèi)裝活性炭)；④、⑤，流量計；⑥、⑦，洗氣瓶；⑧、⑨，玻璃缸/玻璃罐；⑩、，吸附柱；、，流量計；，抽氣泵。 Note: ①, air pump; ② and ③, drying tower; ④ and ⑤, flowmeter; ⑥ and ⑦, gas washing bottle; ⑧ and ⑨, glass jar; ⑩ and , adsorption column; and , flowmeters; , suction pump.

揮發(fā)物收集前，先將各處理盆栽植株的花盆部用2層錫箔紙包被，后置于玻璃缸內(nèi)，分別收集健康植株，機械損傷植株、取食損傷植株損傷后1 d、2 d、3 d的揮發(fā)物；在整個收集過程中，收集裝置置于豚草栽培環(huán)境中；各處理下?lián)]發(fā)物均收集24 h，每8 h換一次吸附柱，每個處理重復(fù)3次；將換下的吸附柱用1 mL色譜純正己烷洗脫，接入2 mL接樣瓶中；將得到的洗脫液在氮吹儀下濃縮，每個樣品由3 mL濃縮至1 mL；保存于-20℃，用于鑒定。

1.2.2豚草蟲害誘導(dǎo)物的GC-MS分析

采用島津6890N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS, gas chromatography-mass spectrometry)對收集的揮發(fā)物樣品進行組分分析。取2 μL收集的樣品注入島津氣相色譜儀(GC)進行分析，GC配備有Rtx-5MS毛細管柱(交聯(lián)PH為5%，薄膜厚度0.25 m，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm)和火焰離子化檢測器(FID)。氣相色譜條件為：進樣口溫度250℃，無分流進樣，升溫程序為：50℃保持2 min，以10℃/min升溫至220℃，再以3℃/min上升到250℃，保持2 min。進樣量為3 μL，載氣N23 mL/min，電離能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍 50～600 amu。

利用島津GC-MS再解析軟件，通過核對NIST14譜庫，對揮發(fā)物的離子譜圖的峰進行定性分析；采用峰面積歸一化法進行相對定量分析，得出各揮發(fā)性組分的相對強度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

豚草受損后不同時期揮發(fā)物相對含量之間的差異顯著性用單因素方差(ANOVA)分析法以及Duncan多重比較法分析各組間的配對比較，差異顯著水平為P<0.05；采用獨立樣本t檢驗分析兩種損傷方式揮發(fā)物相對含量之間的差異顯著性，差異顯著水平為P<0.05。利用Excle 2010計算各揮發(fā)物的相對含量；使用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對不同處理豚草植株揮發(fā)物進行分析，獲得色譜圖，健康植株與機械損傷后1 d、2 d、3 d和取食損傷后1 d、2 d、3 d植株間所含物質(zhì)種類和含量均存在差異(圖1)。

機械損傷和廣聚螢葉甲取食損傷對豚草揮發(fā)性化合物的種類具有一定的影響。健康豚草植株釋放的揮發(fā)物中鑒定出24種化合物；受機械損傷后1 d、2 d、3 d釋放的揮發(fā)物中分別鑒定出25、16和21種化合物，隨機械損傷后時間的推移，揮發(fā)物的數(shù)量呈先減少后增多的趨勢；廣聚螢葉甲取食損傷后1 d的植株揮發(fā)物中鑒定出22種化合物，在損傷后3 d植株揮發(fā)物中鑒定出17種化合物。豚草健康及受損植株揮發(fā)物中所鑒定的化合物大多數(shù)為萜烯類化合物，另外還有少量醇類、醛類和酯類化合物(表1)。

實驗結(jié)果表明(如表1)，不同的損傷方式對豚草揮發(fā)物組分與相對含量具有顯著影響。與機械損傷相較，受取食損傷的豚草植株揮發(fā)物中增

圖2 不同處理下豚草植株揮發(fā)物色譜圖Fig. 2 TIC of volatiles from Ambrosia artemisiifolia plants under different damage treatments注：A，健康植株；B，機械損傷后1 d；C，機械損傷后2 d；D，機械損傷后3 d；E，取食損傷后1 d；F，取食損傷后2 d；G，取食損傷后3 d。Note: A,Healthy plants; B, 1 d after mechanical damage; C, 2 d after mechanical damage; D, 3 d after mechanical damage; E, 1 d after feeding damage; F, 2 d after feeding damage; G, 3 d after feeding damage.

加了檜烯、β-羅勒烯和香茅醇；在機械損傷植株揮發(fā)物中檢測到了十二醛、異龍腦和γ-木羅烯，而這些化合物并未在取食損傷植株中檢測到；圣亞麻三烯在機械損傷植株揮發(fā)物中的相對含量顯著高于取食損傷植株中的相對含量(F=0.967, df=4,P=0.02)，而大根香葉烯D在取食植株揮發(fā)物中的含量顯著高于機械損傷植株中的含量(F=3.286, df=4,P=0.049)；此外，揮發(fā)性化合物乙酸葉醇酯和(E)-β-法呢烯在健康植株揮發(fā)物中存在，但受損傷的植株中并未檢測到。

由實驗結(jié)果(表1)可知，豚草受相同方式的損傷(機械損傷或取食損傷)后的不同時間揮發(fā)物組分之間具有顯著差異。機械損傷下，化合物乙酸芳樟酯、十二醛、植物醇、β-波旁烯、γ-木羅烯只在機械損傷后1 d的植株揮發(fā)物中檢測到，并未在2 d、3 d的揮發(fā)物中檢測到；乙酸葉醇酯在植株受機械損傷后的相對含量顯著增大(F=2.634, df=2,P=0.001)，但癸醛(F=1.393, df=4,P=0.83)、乙酸龍腦酯(F=4.525, df=4,P=0.56)和(E)-β-法呢烯(F<0.001, df=4,P=0.99)在健康植株與損傷后1 d植株中的相對含量并無顯著變化，這4種化合物均未在損傷后 2 d 和3 d的植株揮發(fā)物中檢測到；揮發(fā)性化合物馬鞭烯醇、異龍腦、古巴烯，芳樟醇、反式α-香檸檬烯、石竹素只存在于受損后2 d、3 d的植株揮發(fā)物中，未在健康植株和受損后1 d植株揮發(fā)物中檢測到。取食損傷下，在損傷后的早期(1 d)，與健康植株相較，受損植株揮發(fā)物中增加了揮發(fā)性化合物檜烯、β-羅勒烯、γ-欖香烯、植物醇、β-波旁烯、β-欖香烯、古巴烯、石竹素；有一些化合物在植株受損后表現(xiàn)出滯后釋放，如乙酸芳樟酯、辛醛 、香茅醇存在于受損后2 d、3 d的植株揮發(fā)物中，并未在健康植株與受損后1 d的植株揮發(fā)物中檢測到。

3 討論與結(jié)論

無論在適宜條件還是外界受脅迫下，植物都會釋放大量的VOCs(Doumaetal., 2019)。同時，植物VOCs的組分與含量還受到植物種類、發(fā)育階段、N素等以及環(huán)境因素(如光照、溫度、濕度等)的影響(李洪遠等, 2015)。當(dāng)植物遭受昆蟲取食時，其VOCs的組分以及釋放量均會受到較大的影響(李洪遠等, 2015)，并會有HIPVs釋放。HIPVs的組成十分復(fù)雜，通常有烷烴類、烯烴類、醇類、醛類、酮類、醚類、酯類以及羥酸類化合物等(D’Alessandro and Turlings, 2006)。根據(jù)產(chǎn)生方式的不同，HIPVs可分為3類：組成型、誘發(fā)型和新形成化合物(Degenhardt and Lincoln, 2006)。本研究發(fā)現(xiàn)，豚草在遭受機械損傷和廣聚螢葉甲取食損傷后釋放了一些新的化合物，與健康植株相較，機械損傷后早期(1 d)的植株揮發(fā)物成分中新出現(xiàn)了乙酸芳樟酯、桉樹醇、十二醛、γ-木羅烯，以及機械損傷和取食損傷均有的植物醇、β-波旁烯，這些化合物在受損后立即釋放，可能因其原本存在于豚草植株中，而葉甲取食也會造成機械損傷，表明這些化合物為組成型VOCs；在機械損傷2 d和3 d后，豚草揮發(fā)物中檢測到了馬鞭烯醇、異龍腦。研究發(fā)現(xiàn)，受損植物揮發(fā)物中的萜類化合物的種類和相對含量均高于健康植株的揮發(fā)物，而綠葉性物質(zhì)的相對含量變化則不明顯(婁永根和程家安, 2000)。豚草受損后，大多數(shù)存在于健康植株中的揮發(fā)性化合物的相對含量沒有明顯變化，只有揮發(fā)性化合物乙酸葉醇酯、D-檸檬烯、反式石竹烯、大根香葉烯D的相對含量在受損后增加，尤其是大根香葉烯D的相對含量在受廣聚螢葉甲取食損傷后顯著增加，表明大根香葉烯D為誘發(fā)型VOCs。相較于健康植株和機械損傷植株，廣聚螢葉甲取食損傷的豚草揮發(fā)物中增加了檜烯、β-羅勒烯、辛醛、香茅醇，表明這4種化合物是HIPVs組分。本研究中分析得到的這些HIPVs化合物皆屬于烯烴、醇、醛、酯類，與已鑒定類別相同。多種植食性昆蟲取食后，其寄主都能釋放(E)-β-羅勒烯、(E)-β-石竹烯、(E)-β-法尼烯等萜類化合物，對植食性昆蟲的天敵具有吸引作用(Degenhardtetal., 2003)。豚草經(jīng)廣聚螢葉甲取食后誘導(dǎo)產(chǎn)生了β-羅勒烯，其與(E)-β-羅勒互為異構(gòu)，或有相似的功能。

植物在遭受蟲害后，HIPVs的釋放具有系統(tǒng)性，即植物受害后，無論受害部位還是未受害部位都會釋放HIPVs(Rodriguez-Saonaetal., 2001)，且植物的葉、花以及根部均可釋放(D’Alessandro and Turlings, 2006)。HIPVs對前來取食的昆蟲具有拒避、拒食以及毒殺作用，HIPVs亦可招引植食性昆蟲的天敵(Yan and Wang, 2006)，甚至對捕食性線蟲具有吸引作用(Rasmannetal., 2008; Rasmann and Turlings, 2011)。有研究發(fā)現(xiàn)，在一個商業(yè)啤酒花場中用水楊酸甲酯(MeSA)作為誘餌，啤酒花上二斑葉螨Tetranychusurticae的數(shù)量急劇下降，而5種捕食性昆蟲(Chrysopanigricornis,Hemerobiussp.,Deraeocorisbrevis,Stethoruspunctumpicipes,Oriustristicolor)的數(shù)量顯著增加(James and Price, 2004)，這樣降低了植物的受害程度，克服了植物無移動能力的限制。除了直接和間接的防御外，一些植物釋放HIPVs還具有在植株間傳遞傷害信息的功能(Vrkocˇová, 2000; Blanka, 2005; Timilsenaetal., 2020)，并可以在基因或代謝物水平上影響鄰近的組織或植物，這在擬南芥、煙草煙草和番茄中得到了驗證(Yaoetal., 2011; Sugimotoetal., 2014)。Sobhy等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，與機械損傷相比，經(jīng)勞氏粘蟲Mythimnaloreyi和直紋稻苞蟲Parnaraguttata口腔分泌物(OS, oral secretion)處理過的水稻釋放更多的HIPVs，說明HIPVs的釋放與昆蟲OS密切相關(guān)。也有研究表明，甜菜夜蛾SpodopteraexiguaOS導(dǎo)致了玉米揮發(fā)物生物合成中幾個關(guān)鍵基因表達的上調(diào)(Freyetal., 2000; Shenetal., 2000)。此外，植物遭受草食性動物攻擊時，還可誘導(dǎo)包括茉莉酸(JA, jasmonate acid)和乙烯在內(nèi)的植物激素的形成，而這些激素可以調(diào)節(jié)大量與植物防御反應(yīng)相關(guān)的基因，JA是植物釋放出的大部分HIPVs的誘導(dǎo)物質(zhì)，而JA通路則是HIPVs誘導(dǎo)最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Zengetal., 2017)。本研究結(jié)果證實，在廣聚螢葉甲取食之后，豚草揮發(fā)物中增加了檜烯、β-羅勒烯、辛醛、香茅醇4種HIPVs組分，然而，豚草HIPVs組分產(chǎn)生的機制以及其對豚草健康植株、廣聚螢葉甲以及葉甲的天敵有何影響，還有待進一步研究。

本研究結(jié)果也表明，豚草健康植株在受機械損傷后，植株揮發(fā)物中的揮發(fā)性化合物的種類先降低后增加，推測可能是豚草剛受損后代謝降低，后又很快恢復(fù)健康；而豚草受廣聚螢葉甲取食損傷后，隨損傷后時間的推移，揮發(fā)性化合物種類減少，可能與受損傷后光合作用及代謝能力短時間內(nèi)難以恢復(fù)正常有關(guān)，光合作用和代謝能力的減弱影響了揮發(fā)性化合物的合成(邱華龍等, 2017)。

研究豚草的VOCs和HIPVs組分對廣聚螢葉甲行為的影響，具有極其重要的意義。不僅能為更好地了解豚草-廣聚螢葉甲-葉甲天敵3層營養(yǎng)關(guān)系的相互作用奠定基礎(chǔ)，同時，也可為豚草VOCs和HIPVs應(yīng)用于廣聚螢葉甲防控豚草的生產(chǎn)實踐中提供理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中，可以關(guān)注豚草的VOCs和HIPVs組分在健康植株“預(yù)警”反應(yīng)中的功能，以及其對廣聚螢葉甲和葉甲天敵的具體行為活性，從而將豚草VOCs中的引誘組分應(yīng)用于廣聚螢葉甲大規(guī)模擴繁后的種群收集以及野外種群的助遷與監(jiān)測；并可進一步探究如何消除HIPVs中對廣聚螢葉甲具有趨避作用或?qū)θ~甲天敵具有招引作用的組分，以更好的發(fā)揮廣聚螢葉甲在豚草防控中的重要作用。