紅脂大小蠹幼蟲和成蟲耐寒能力及耐寒物質(zhì)的研究

董亞新，裴佳禾，邵鈺瑩，宗世祥，侯澤海*

(1. 北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083；2. 山東省濰坊市自然資源和規(guī)劃局，山東濰坊 261000)

關(guān)鍵字：紅脂大小蠹；越冬；耐寒性；過冷卻點；冰點

紅脂大小蠹DendroctonusvalensLeConte屬鞘翅目Coleoptera小蠹科Scolytidae大小蠹屬Dendroctonus，是我國重要的林業(yè)檢疫性害蟲。1998年侵入我國山西陽城、沁水，隨后大面積爆發(fā)且呈逐步擴增趨勢，現(xiàn)已擴散至陜西、河南、河北、北京、遼寧、內(nèi)蒙等地。其危害特性發(fā)生變化，最初危害衰弱木和受傷木，之后轉(zhuǎn)移到活立木危害；寄主也發(fā)生改變，起初危害油松，后逐漸危害白皮松等其他松類林木。2018年，在新入侵地內(nèi)蒙古自治區(qū)首次發(fā)現(xiàn)樟子松受害，且受害重于油松(趙建興等, 2009; 潘杰等, 2011; 劉漪舟, 2019)。隨著紅脂大小蠹危害面積的不斷擴增，有學(xué)者對其潛在適生區(qū)做出了預(yù)測，結(jié)果表明，在歷史氣候條件下，該蟲在我國的適生區(qū)域非常廣泛，其主要適生區(qū)為華南和中東部地區(qū)，分布邊界也很廣泛，可從云南分布至吉林；而在未來氣候條件下，其適生區(qū)域逐步北移，東北地區(qū)適生面積呈逐步擴大趨勢，溫室效應(yīng)更有利于其繁殖生存(秦春英等, 2011; 王濤等, 2018; 崔驍芃等, 2019)。

昆蟲屬于變溫動物，越冬是昆蟲必須要經(jīng)過的環(huán)節(jié)，耐寒能力的高低決定著昆蟲能否安全越冬(Leatheretal., 1993)。通常采用過冷卻點和冰點來衡量昆蟲耐寒能力的強弱，昆蟲的過冷卻現(xiàn)象是指溫度降至0℃以下仍能保持體液不結(jié)冰，而維持體液過冷卻狀態(tài)時的最低溫度就稱之為該蟲的過冷卻點(Supercooling point, SCP)；當達到體液結(jié)冰的最低溫度時，昆蟲體液因結(jié)冰便會放出熱量，使蟲體內(nèi)溫度回升到近0℃，即為冰點(景曉紅和康樂, 2004; 霍鳴飛等, 2016)。昆蟲在遇到低溫環(huán)境或者進入越冬過程中，一般會停止取食以降低自身的代謝速率。因此，昆蟲越冬需要消耗一些自身在越冬前積累的能量物質(zhì)滿足越冬期的生理生化代謝。已有研究表明，昆蟲體內(nèi)的水分、脂肪、糖類、蛋白質(zhì)及低分子糖醇等物質(zhì)在昆蟲越冬過程中發(fā)揮重要作用，其中最重要的是糖原和脂肪兩種物質(zhì)(歐陽芳和戈峰, 2014)。楊海博等(2019)研究表明重陽木錦斑蛾HistiarhodopeCrarner幼蟲體重和脂肪含量在越冬期間逐漸下降，總蛋白質(zhì)含量在越冬期間呈先升高后降低的趨勢；韓瑞東等(2005)認為赤松毛蟲DendrolimusspectabilisButler越冬幼蟲體內(nèi)抗寒物質(zhì)為小分子碳水化合物類(山梨醇、海藻糖、葡萄糖)、糖蛋白以及氨基酸類；而紅珠絹蝶ParnassiusbremeriBremer幼蟲和青楊脊虎天牛XylotrechusrusticusL.幼蟲的主要耐寒物質(zhì)為甘油(Lietal.2014; Parketal.2017)。因此，明確越冬昆蟲的耐寒能力以及與耐寒相關(guān)的生理生化指標，可為來年種群發(fā)生趨勢的準確預(yù)測以及制定科學(xué)的防治措施提供理論基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于紅脂大小蠹耐寒性的研究報道較少。趙建興等(2009)對山西地區(qū)紅脂大小蠹的耐寒能力進行了測定，結(jié)果表明，紅脂大小蠹越冬幼蟲的平均過冷卻點為-11.98±2.55℃，是一種耐冰凍的昆蟲，但并未明確影響紅脂大小蠹越冬的耐寒保護物質(zhì)。本研究通過測定紅脂大小蠹越冬期幼蟲和成蟲的過冷卻點、冰點以及越冬期與非越冬期體內(nèi)水分、脂肪、糖原、蛋白質(zhì)、甘油、海藻糖和山梨醇的含量，探究越冬期紅脂大小蠹幼蟲和成蟲的耐寒能力以及主要耐寒物質(zhì)，為其防治提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與環(huán)境溫度

供試幼蟲和成蟲采自內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣黑里河鎮(zhèn)的人工油松林，采集時間為2019年1月19日(越冬期)和2019年5月10日(非越冬期)。采集時，把幼蟲(選用老熟幼蟲)和成蟲單頭裝入2 mL離心管中(離心管用針扎孔，保證其呼吸順暢)避光保存，從采集地帶回實驗室不超過48 h。所有環(huán)境溫度數(shù)據(jù)均通過中國氣象科學(xué)數(shù)據(jù)共享網(wǎng)(http://www.cma.gov.cn/)獲得。

1.2 測定方法

1.2.1過冷卻點和冰點

采用“熱電偶-高低溫試驗箱-過冷卻點數(shù)據(jù)記錄儀”連接設(shè)備測定紅脂大小蠹幼蟲和成蟲的過冷卻點及冰點(邵鈺瑩等, 2017)。首先，用封口膜包裹紅脂大小蠹幼蟲和成蟲蟲體將其固定在過冷卻點探針上。然后，將固定好的蟲體和探針共同放入-40℃至150℃的高低溫試驗箱(北京雅士林試驗設(shè)備有限公司)中設(shè)置恒溫-30℃，并用保護材料(脫脂棉)包裹蟲體，使蟲體保持緩慢的速率(約1℃/min)持續(xù)降溫。最后，由昆蟲過冷卻點測試系統(tǒng)通過計算機軟件記錄紅脂大小蠹幼蟲與成蟲體表溫度的變化，測出1月幼蟲和成蟲的過冷卻點以及冰點。幼蟲和成蟲各測定30頭。

1.2.2含水率

用電子天平(AB204-S，METTLER TOLEDO，精確至0.0001 g)分別測定單頭幼蟲和成蟲鮮重(FW)，然后將單頭幼蟲和成蟲放入2 mL離心管中，之后放入60℃的烘箱中干燥72 h至恒重，再分別測定其干重(DW)。含水量計算公式為：(FW-DW)/FW×100%。

1.2.3脂肪含量

采用氯仿-甲醇法測定總脂肪的含量(Ouyangetal., 2011)。將烘干后的幼蟲和成蟲分別置于2 mL離心管中稱重(DM)，用研磨棒將其研磨成粉末，加入1 mL氯仿-甲醇混合液(chloroform∶methanol=2∶1)混勻，2 600 g低速離心10 min，移除上清液。再加入1 mL氯仿-甲醇混合液，重復(fù)兩次。剩余物放入60℃烘箱中干燥72 h至恒重(LDM)?？傊竞坑嬎愎綖椋?DM-LDM)/DM× 100%。

1.2.4糖原含量

采用蒽酮比色法測定糖原含量。利用強堿性提取液提取糖原，在強酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定糖原含量，反應(yīng)后的溶液在620 nm處有最大吸收值。

1.2.5蛋白濃度

采用Bicinchoninic acid法(BCA法)測定蛋白質(zhì)濃度。堿性條件下，蛋白將Cu2+還原成Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，562 nm處有最大吸收峰，根據(jù)吸光度與濃度成正比，通過測吸光度即可計算待測蛋白的濃度。

1.2.6甘油濃度

采用甘油含量測試盒測定甘油濃度。在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫；在過氧化氫酶作用下生成底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，光密度值與甘油濃度成正比。

1.2.7海藻糖含量

采用蒽酮比色法進行測定。在強酸性條件下利用蒽酮顯色劑測定海藻糖含量，反應(yīng)后的溶液在620 nm處有最大吸收值。

1.2.8山梨醇含量

采用分光光度法測定山梨醇含量。山梨醇在堿性溶液中與銅離子形成藍色絡(luò)合物，在655 nm波長有特殊吸收峰。

以上各物質(zhì)測定每組幼蟲10個重復(fù)，每頭為一個重復(fù)；成蟲5個重復(fù)，每頭為一個重復(fù)。其中糖原、海藻糖和山梨醇含量采用分光光度法試劑盒(蘇州科銘生物有限公司)進行測定；蛋白和甘油濃度采用微量酶標法試劑盒(南京建成生物工程研究所)進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 21進行獨立樣本t檢驗，并采用Graph Pad 7作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境氣溫的季節(jié)性變化

采集地點月平均氣溫及月平均最低氣溫如圖1所示(2018年9月至2019年5月)。1月(紅脂大小蠹越冬期)平均氣溫為-12.1℃，1月平均最低氣溫-18.7℃，為全年最低。5月(非越冬期)平均氣溫為18.7℃，5月平均最低氣溫為11.2℃(圖1)。

圖1 紅脂大小蠹采集地的月平均溫度及月平均最低溫度Fig.1 Mean monthly temperature and mean monthly minimum temperature at the collection site of Dendroctonus valens

2.2 過冷卻點和冰點

結(jié)果表明，1月幼蟲和成蟲的過冷卻點差異不顯著(t=0.359，df=53，P>0.05)，幼蟲和成蟲過冷卻點的極差值分別為6.1℃和11.1℃。1月幼蟲的冰點顯著高于成蟲(t=7.279，df=53，P<0.05)，幼蟲和成蟲冰點的極差值分別為9.7℃和13.6℃(表1)。

表1 越冬期紅脂大小蠹成蟲和幼蟲的過冷卻點和冰點

2.3 不同越冬時期幼蟲和成蟲體內(nèi)物質(zhì)含量

越冬期(1月)幼蟲和非越冬期(5月)幼蟲體內(nèi)甘油(t=12.038，df=10，P<0.05)(圖2-A)、海藻糖(t=4.091，df=12，P<0.05)(圖2-B)、山梨醇(t=2.812，df=12，P<0.05)(圖2-C)、脂肪(t=4.365，df=16，P<0.05)(圖2-D)含量均存在顯著差異。甘油濃度從越冬期的1 031.67±80.20 μmol/L降至非越冬期的64.27±5.18 μmol/L；海藻糖含量從52.99±5.93 mg/g降至28.19±1.28 mg/g；山梨醇含量從25.60±3.84 mg/g降至15.82±0.98 mg/g；脂肪含量從1.49%±0.14%降至0.71%±0.11%。然而，糖原(t=1.292，df=16，P>0.05)(圖2-E)、蛋白質(zhì)(t=1.525，df=15，P>0.05)(圖2-F)、水分(t=-1.841，df=18，P>0.05)(圖2-G)含量在越冬期和非越冬期幼蟲中差異不顯著。

成蟲甘油(越冬期：631.77±112.65 μmol/L；非越冬期：89.99±12.25 μmol/L；t=4.781，df=4，P<0.05)(圖2-A)、海藻糖(越冬期：24.13±2.06 mg/g；非越冬期：9.03±0.73 mg/g；t=7.894，df=10，P<0.05)(圖2-B)和山梨醇(越冬期：37.38±1.82 mg/g；非越冬期：14.55±2.78 mg/g；t=5.802，df=6，P<0.05)(圖2-C)含量在越冬期也均顯著高于非越冬期。此外，成蟲糖原含量在越冬期顯著高于非越冬期(越冬期：21.55±1.93 mg/g；非越冬期：13.30±1.41 mg/g；t=3.456，df=8，P<0.05)(圖2-E)。然而，越冬期成蟲和非越冬期成蟲脂肪(t=-1.033，df=8，P>0.05)(圖2-D)、蛋白質(zhì)(t=-1.119，df=8，P>0.05)(圖2F)、水分(t=-0.184，df=17，P>0.05)(圖2-G)含量差異均不顯著。

圖2 紅脂大小蠹幼蟲和成蟲不同越冬時期體內(nèi)各物質(zhì)含量 Fig.2 Contents of various substances in the larvae and adults of Dendroctonus valens at different wintering periods注：(A)，甘油;(B)，海藻糖;(C)，山梨醇;(D)，脂肪;(E)，糖原;(F)，蛋白質(zhì);(G)，自由水。同一小圖內(nèi)不同大寫字母表示越冬期幼蟲和非越冬期幼蟲存在顯著差異(P < 0.05)；同一小圖內(nèi)不同小寫字母表示越冬期成蟲和非越冬期成蟲存在顯著差異(P < 0.05)。Note：(A)，Glycerol;(B)，Trehalose;(C)，Sorbitol;(D)，F(xiàn)at;(E)，Glycogen;(F)，Protein;(G)，Water. Different capital letters in the same small picture indicated that there were significant differences between overwintering larvae and non-overwintering larvae; Different lowercase letters in the same small picture indicated that there were significant differences between overwintering adults and non-overwintering adults.

3 結(jié)論與討論

3.1 過冷卻點與紅脂大小蠹耐寒性

生活在溫帶的昆蟲要經(jīng)歷漫長的冬季，越冬期昆蟲過冷卻點的高低是衡量昆蟲耐寒能力的重要指標(S?mmeetal., 1999)，過冷卻點越低，耐寒能力就越強，存活率就越高(Lee, 1991; 馮宇倩等, 2015)。花絨寄甲DastarcushelophoroidesFairmaire野生種群的過冷卻點平均為-23.9℃，最低可達到-27.3℃，表明花絨寄甲在我國大多數(shù)地區(qū)可以順利越冬(魏建榮等, 2010)。凹唇壁蜂OsmiaexcavataAlfken越冬成蟲滯育階段和非滯育階段的過冷卻點分別為-26.48℃和-18.4℃，表明凹唇壁蜂在我國北方大部分地區(qū)可安全越冬(魏永平等, 2001)。有研究表明沙蔥螢葉甲GalerucadauricaJoannis不同發(fā)育階段的過冷卻點存在顯著差異，卵的過冷卻點最低，為-29.8±0.88℃，解釋了其以卵進行越冬的原因(李浩等, 2014)。本研究結(jié)果表明，紅脂大小蠹越冬幼蟲的過冷卻點平均為-18.34±0.26℃，越冬成蟲的過冷卻點平均為-18.59±0.63℃，說明紅脂大小蠹越冬幼蟲和成蟲均通過降低其自身的過冷卻點來提高耐寒能力，且均可在最低環(huán)境氣溫下存活。趙建興等(2009)研究結(jié)果表明，山西地區(qū)的紅脂大小蠹越冬幼蟲的平均過冷卻點為-11.98±2.55℃，而本研究結(jié)果表明赤峰地區(qū)的紅脂大小蠹越冬幼蟲的過冷卻點可達-18.34±0.26℃，表明紅脂大小蠹赤峰種群比山西種群耐寒能力更強。

3.2 體內(nèi)生化物質(zhì)與紅脂大小蠹耐寒性

越冬期昆蟲會貯藏大量營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足越冬需求。大多數(shù)昆蟲會通過降低體內(nèi)水分含量、儲存脂肪等增強抗寒能力，如華山松大小蠹DendroctonusarmandiTsai and Li、日本龜蠟蚧CeroplastesjaponicusGreen等(Worland, 2003; 徐麗榮等, 2012; 劉兆良等, 2017; Wangetal., 2017)。本研究結(jié)果表明，紅脂大小蠹幼蟲和成蟲在越冬期與非越冬期含水量均差異不顯著，但越冬期幼蟲平均含水量為58.43%±1.94%，非越冬期為63.84%±2.21%，說明越冬期含水量還是有一定的降低。此外，越冬期幼蟲體內(nèi)脂肪含量顯著高于非越冬期幼蟲，脂肪含量從越冬期的1.49%±0.14%下降至非越冬期的0.71%±0.11%，說明紅脂大小蠹幼蟲在越冬期積累脂肪進行代謝來維持生存。

糖原是昆蟲越冬期最直接的能量物質(zhì)，其含量隨溫度降低而逐漸增加(強承魁等, 2008; 楊海博等, 2019)。此外，總糖含量也可作為昆蟲耐寒能力強弱的指標，其含量在越冬前和越冬期均高于越冬后期(Bemanietal., 2012; Behroozietal., 2012; 劉兆良等, 2017; 楊海博等, 2019)。本研究結(jié)果表明，越冬期幼蟲與非越冬期幼蟲體內(nèi)糖原含量無顯著差異，而越冬期成蟲與非越冬期成蟲體內(nèi)糖原含量存在顯著差異，糖原含量從越冬期的21.55±1.93 mg/g降至非越冬期的13.30±1.41 mg/g，這可能是由于成蟲在越冬期代謝需要更多的能量，說明糖原在紅脂大小蠹成蟲越冬過程中起著非常重要的作用。

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是昆蟲越冬的重要耐寒物質(zhì)，例如重陽木錦斑蛾、赤松毛蟲等昆蟲在越冬前期蛋白質(zhì)含量較低，1月含量最高，隨后含量呈下降趨勢(韓瑞東等, 2005; 楊海博等, 2019)。而本研究結(jié)果表明，紅脂大小蠹幼蟲和成蟲在越冬期與非越冬期蛋白質(zhì)含量均無顯著差異，說明蛋白質(zhì)在紅脂大小蠹越冬過程中可能并沒有起到重要作用。

昆蟲在越冬期體內(nèi)會聚集大量小分子抗凍保護劑，目前已知的小分子抗寒物質(zhì)有甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇、葡萄糖、海藻糖、果糖以及一些氨基酸和脂肪酸(陳豪等, 2010; 史彩華等, 2016)。長角血蜱HaemaphysalislongicornisNeumann滯育卵越冬抗凍保護劑主要是山梨醇和甘油，二化螟ChilosuppressalisWalker越冬期主要抗寒物質(zhì)是甘油(徐淑等, 2009; Yuetal., 2014)。本研究結(jié)果表明，越冬期幼蟲和成蟲體內(nèi)甘油、海藻糖和山梨醇含量均顯著高于非越冬期幼蟲和成蟲。因此，甘油、海藻糖和山梨醇很可能是紅脂大小蠹越冬的主要耐寒物質(zhì)，在耐寒過程中發(fā)揮著重要作用。

本研究對采自油松的紅脂大小蠹過冷卻點及冰點進行測定，表明紅脂大小蠹幼蟲和成蟲均可忍受較低的溫度并安全越冬。此外，揭示了甘油、海藻糖和山梨醇可能是紅脂大小蠹的主要抗凍保護物質(zhì)；脂肪和糖原也可能分別在紅脂大小蠹幼蟲和成蟲越冬過程中發(fā)揮作用。紅脂大小蠹傳入我國以后，除了危害油松，也逐漸危害白皮松、樟子松等。不同寄主中紅脂大小蠹的耐寒能力及耐寒物質(zhì)是否存在差異，還有待深入探究。