固相萃取-UPLC-MS/MS同時測定水中16種磺胺類抗生素殘留

王運(yùn)儒 孟祥至 秦玉燕 鄧有展

摘 要：建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-UPLC-MS /MS）同時檢測水中16種磺胺類抗生素的分析方法。水中的磺胺類抗生素經(jīng) HLB凈化柱富集純化后經(jīng)Acquity UPLC HSS T3 柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測模式（ MRM） 進(jìn)行定性定量分析。流動相由乙腈和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）組成，梯度洗脫。該方法的檢出限：1.0～5.0 μg/kg;加標(biāo)回收率范圍：78.6 %～103.2 %;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍：1.1 %～12.8 %。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，適用于水中 16 種磺胺類藥物殘留檢測。

關(guān)鍵詞：磺胺類抗生素 固相萃取 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號：TS201.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Determination of 16 Kinds of Sulfonamides Residues in Water by Solid Phase Extraction-UPLC-MS/MS

WANG Yunru1，2，3*， MENG Xiangzhi4，QIN Yuyan1，2，3*，DENG Youzhan1，2，3

（1Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China;2 Laboratory of Quality Risk Assessment for Agro-products （Nanning） Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;3 Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanning， Guangxi 530001， China;4 Shandong Benyuan Environmental Technology Co. Ltd.，Jinan， Shandong 250100， China）

Abstract： A method was developed for simultaneous determination of 16 sulfonamides antibiotics in surface water by solid-phase extraction with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（SPE-UPLC-MS/MS）. The sulfonamides in water was enriched and purified by HLB solid phase extraction column， and separated by Acquity UPLC HSS T3 column with a gradient elution of acetonitrile and 0. 1% formic acid （v：v）， then the qualitative and quantitative analysis was performed under the multiple reaction monitoring（MRM） mode. The detection limit was 1.0～5.0 μg/kg， recovery rate was 78.6%～103.2% and the relative standard deviations was 1.1%～12.8%. The method with high sensitivity， good precision and accuracy is suitable for detection of 16 sulfonamides residues in water.

Key words： Sulfonamide antibiotics; solid phase extraction; ultra high performance liquid chromatography tandem mass

磺胺類抗生素藥物（Sulfonamides，SAs）是我國目前應(yīng)用最多，使用量最大的抗生素之一，具有抗菌譜廣、低成本、高穩(wěn)定性和較強(qiáng)的親水性等特征[1-3]?；前奉惪股赝ㄟ^干擾細(xì)菌的葉酸合成從而使細(xì)菌生長和繁殖受到抑制，被廣泛用于醫(yī)療、畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等，屬于少有的人類、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)共同使用的藥物。據(jù)統(tǒng)計，在2013年，SAs 在我國的使用量達(dá)到了7920 t，其中用于獸藥的占76 %，用于醫(yī)藥的占11 %[4]。目前磺胺類抗生素污染的來源主要是藥物生產(chǎn)過程中排放的廢水、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、畜牧業(yè)和人類醫(yī)療用藥?；前奉惪股匾蚓哂泻芨叩姆€(wěn)定性，在環(huán)境中降解速度慢，人畜服用后磺胺類藥物后大部分在體內(nèi)沒有代謝就直接以原藥的形式排入環(huán)境中，會長時間殘留在土壤環(huán)境和水環(huán)境中，嚴(yán)重影響人類的健康[5-6]。因此，近幾年來磺胺類抗生素的濫用造成的環(huán)境污染和風(fēng)險隱患，成為了研究的熱點(diǎn)。

目前磺胺類抗生素的殘留檢測方法有高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） [7]、紫外可見分光光度法（Ultraviolet–Visible spectroscopy，UV-Vis） [8]、毛細(xì)管電泳法（ Capillary Electrophoresis，CE） [9-10]、電化學(xué)法[11-12]、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[13]、熒光偏振免疫分析法[14]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（High performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]等?，F(xiàn)有的檢測方法如ELISA方法特異性不高無法準(zhǔn)確定性、檢測復(fù)雜基質(zhì)時可能出現(xiàn)假陽性;高效液相色譜法存在分離度不好，定性困難的缺點(diǎn)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ，UPLC-MS/MS）因分析效率高、靈敏度高等優(yōu)勢，成為抗生素殘留分析的主流檢測方法。已有的檢測方法存在操作繁瑣、耗時較長、檢測抗生素種類或數(shù)量相對較少、不適于水樣品快速篩查分析等缺點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的對水中殘留的磺胺類抗生素進(jìn)行了分析檢測，本研究以O(shè)asis HLB固相萃取柱富集和凈化，UPLC-MS/MS測定水中16種磺胺類抗生素的殘留，為水中抗生素的快速篩查提供參考。

磺胺類抗生素結(jié)構(gòu)通式：

圖1 磺胺類抗生素結(jié)構(gòu)通式

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：UPLC（LC-20AD）超高壓液相色譜儀（日本島津公司）; API3200 質(zhì)譜儀（美國AB公司）;T18高速均質(zhì)儀（德國IKA公司）;純水儀（上海洋淪精密設(shè)備科技有限公司）;小型旋渦混勻儀（德國IKA公司）;色譜柱為島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 ×75 mm;2.2 μm）、Waters Acquity UPLC TSS T3色譜柱（100 ×2.1 mm，1.8 μm）。

試劑：乙腈（色譜級），德國默克公司;蒸餾水（娃哈哈純凈水）;固相萃取柱C18（Agela，3 mL/50 mg），HLB（Waters Oasis，3 mL/50 mg），標(biāo)準(zhǔn)品混合液（濃度100 mg/kg）由上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司。固相萃取小柱C18（500 mg/6 mL， Aglient）， Oasis HLB（500 mg/6 cc，Waters）、Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）。

1.2 溶液配置

標(biāo)準(zhǔn)品混合液（100 mg/kg）：準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為100 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mL于 5 mL 容量瓶中，用甲醇定容到5.00 mL，于-20 ℃冰箱避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：用流動相 0.1 %甲酸-乙腈溶液稀釋混合中間液，配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線為 0.005、 0.01、 0.05、 0.10、 0.20、 0.50 mg/L。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品提取

取500 mL采集到的樣品，固相萃取小柱先分別經(jīng)過10 mL甲醇、10 mL水活化后，再將 500 mL水樣上柱后以1 mL/min的流速真空抽干，再以10 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮?dú)獯抵两珊蠹尤?.0 mL 30 %甲醇溶液定容，過0.22 μm有機(jī)濾膜，超高壓液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 檢測條件

液相色譜條件：流動相由乙腈（A）和0.1 %的甲酸水溶液（V/V）（B）組成，梯度洗脫程序為：0～0.01 min，98 %A;0.01～5.0 min，98 %A～15 %A;5.0～8.5 min，15 %A;8.5～9.0 min，15 %A～98 %A;9.0～13.0 min，98 %A。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，整個分析時間為13.0 min，各化合物保留時間見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI），采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式采集數(shù)據(jù)。以全掃描、子離子掃描等方式優(yōu)化每種化合物母離子和子離子的強(qiáng)度。優(yōu)化后的質(zhì)譜分析條件：電噴霧電壓（IS）5500.0 V，離子源溫度（TEM）550℃，氣簾氣壓力（ CUR ） 55 psi，霧化氣壓力（Gas 1）55 psi，加熱氣（Gas 2） 55 psi。16種磺胺類抗生素的母離子及子離子見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)16種磺胺類抗生素的性質(zhì)，配制濃度為 1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇正離子模式掃描，對目標(biāo)化合物在合適的掃描范圍內(nèi)進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，選定各個化合物的母離子，通過優(yōu)化去簇電壓、碰撞能、噴霧電壓、離子源溫度等因素，選取2個離子豐度高及穩(wěn)定性好的特征碎片離子分別作為定量離子和定性離子。16種磺胺類抗生素種有2對同分異構(gòu)體化合物，分別是母離子為281.0的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對氧嘧啶和磺胺甲氧嗪，母離子為311.0的磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶。通過對色譜流動相的優(yōu)化，可以將其完全分開，總離子色譜圖見圖2。

比較了Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和島津Shim-pack XR-ODSⅡ（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）對16種抗生素的分離效果。結(jié)果顯示，經(jīng)Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱分離后16 種抗生素的峰形相對尖銳。這是由于HSS T3柱填充物是硅膠基質(zhì)，采用的是低密度封端技術(shù)，它不僅能保留和分離水溶性的極性小分子有機(jī)化合物，而且還能提供了更寬的pH值操作范圍，對于同時分析多種目標(biāo)物的效果相對較佳，各化合物色譜圖見圖3。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 凈化柱的優(yōu)化

比較了C18（500 mg/6 mL，Aglient）、Oasis HLB（500 mg/6cc，Waters）和Bond Elut-SAX（500 mg/6 mL，Aglient）3種固相萃取小柱對抗生素混合物的凈化效果。結(jié)果表明Oasis HLB凈化柱對目標(biāo)化合物的凈化回收效果明顯好于其他2種凈化柱（見圖4）?？赡苡捎赪aters Oasis HLB吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮2種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留機(jī)理為通過一個“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來增加對極性物質(zhì)的保留從而提供很好的水浸潤性，即使凈化柱柱床干涸，回收率也不受影響。

2.2.2 線性范圍、檢出限

根據(jù)每種抗生素的響應(yīng)值，配制系列質(zhì)量濃度的空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下進(jìn)行測定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以信噪比（S/N）為3所對應(yīng)的濃度作為本方法的檢出限（LOD），方法的線性范圍、LOD 結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，16種目標(biāo)抗生素在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，LOD 為1.0～5.0 μg/kg。

2.2.3 回收率及精密度

在空白水樣品中分別添加 5.0、20.0、100.0 μg/kg 3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照相同方法處理后進(jìn)行UPLC- MS/MS測定，每個水平重復(fù)測定5次，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

3 結(jié)論

本試驗建立了水中16種磺胺類抗生素殘留的檢測方法。樣品直接采用HLB固相萃取提取，以0.1 %甲酸溶液和乙腈作為流動相，經(jīng)UPLC-MS/MS測定。該方法靈敏度高、分離度好，操作簡單，以固相萃取技術(shù)富集水樣品，實(shí)現(xiàn)了水樣處理的自動化，可用于水樣環(huán)境中磺胺類抗生素的快速測定，為水環(huán)境中的污染物快速檢測提供技術(shù)依據(jù)。

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