培養(yǎng)組學在人體腸道微生物研究中的應用

姚彩青，鄂晶晶，王俊國

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點實驗室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特 010018）

人體腸道復雜的微生物環(huán)境對于維持機體健康具有重要作用，采用多組學技術(shù)研究人類腸道微生物區(qū)系以及微生物與宿主相互作用的機制已成為趨勢[1]。其中宏基因組學以通量高，方法成熟且能快速得到樣品微生物組成而被廣泛應用。在基于宏基因組測序的研究過程中發(fā)現(xiàn)接近80%的細菌是未被培養(yǎng)的，且此方法具有嚴格的檢測閾值，只能檢測到每克樣品中含量≥106的微生物，漏檢了臨床上一些重要的潛在致病菌[2-3]。例如：與胃腸疾病密切相關(guān)的產(chǎn)毒素大腸桿菌以及腹瀉病例中的彎曲桿菌和沙門氏菌，存在因含量低而檢測不到的問題[4-5]。純培養(yǎng)方法作為最早應用于微生物研究的手段，具有較低的檢測閾值，同時讓更多之前被認為是不可培養(yǎng)的微生物得以培養(yǎng)，截至2018年，采用多種培養(yǎng)方法從人體分離得到的細菌已達2 776 種，其中很大一部分來自人體腸道[6]。純培養(yǎng)方法在解析腸道微生物區(qū)系方面帶來的巨大貢獻，使這一技術(shù)被重新應用起來。

起初微生物學家依靠培養(yǎng)來研究定居在人體腸道內(nèi)的微生物，發(fā)現(xiàn)同一樣品顯微計數(shù)得到的微生物數(shù)量遠高于平板上培養(yǎng)的數(shù)量，證明樣品中存在大量未培養(yǎng)的微生物[7]。宏基因組測序能夠快速了解人體腸道微生物組成以及微生物與不同生理狀態(tài)宿主的潛在聯(lián)系，然而，只有培養(yǎng)得到特定的細菌，才能明確細菌在維持宿主健康或者導致患病所發(fā)揮的作用。同時，經(jīng)培養(yǎng)得到的菌種可以確定作為活體對宿主產(chǎn)生影響，而分子手段不能區(qū)分菌種的死活，容易出現(xiàn)誤以為死菌起作用的假陽性結(jié)果[3，8]。由多種培養(yǎng)條件與細菌的快速鑒定相結(jié)合的培養(yǎng)組學在全面描述人類腸道微生物區(qū)系中發(fā)揮了重要作用，在一定程度上填補了宏基因組測序技術(shù)的空白[9-10]。研究表明：非培養(yǎng)的宏基因組學與培養(yǎng)組學僅有15%檢測到的菌種是相同的，兩種技術(shù)在方法學上的差異為研究人員解析腸道微生態(tài)的可培養(yǎng)菌群與總體菌群多樣性之間的差異帶來挑戰(zhàn)。表1列出兩種方法的差別。本文結(jié)合最新研究成果，重點介紹培養(yǎng)組學及其在人體腸道微生物研究中的應用，同時探索培養(yǎng)組學今后的研究重點。

表1 非培養(yǎng)宏基因組學與培養(yǎng)組學在解析人類腸道微生物區(qū)系的差異Table 1 Differences between culture-independent metagenomic methods and culture-based methods in the analysis of human intestinal microbiota

1 培養(yǎng)組學

1.1 培養(yǎng)組學概述

培養(yǎng)組學也被稱作高通量的細菌分離培養(yǎng)，是采用多種培養(yǎng)方式，同時結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS） 和16S rRNA 基因測序技術(shù)分離鑒定細菌的方法，目的是盡可能多的從樣品中獲得不同微生物，尤其是一些難培養(yǎng)的細菌[16]。培養(yǎng)組學最先是由環(huán)境微生物學家和臨床微生物學家所提出并應用，之后應用到研究人體腸道微生物[17-18]。多種培養(yǎng)方法的使用使得在不到5年的時間里從腸道中分離出531種先前從未培養(yǎng)的微生物，其中包括數(shù)百種新細菌，總的菌種數(shù)量較之前翻了一倍[19]。法國Lagier教授團隊在培養(yǎng)組學研究上取得了很大成就，2012年該團隊采用212 種培養(yǎng)方法對兩名非洲人和一名肥胖歐洲人的糞便進行培養(yǎng)，并結(jié)合質(zhì)譜和16S rRNA 基因測序技術(shù)對獲得的32 500 個單菌落進行鑒定，獲得了174 種在人體腸道首次培養(yǎng)的細菌包括31 個潛在新種。研究中所使用的培養(yǎng)方法類型豐富，從212 種方法中確定出70 種有效方法，可以培養(yǎng)出全部的細菌，其中20 種可以培養(yǎng)到73%的細菌[3]。此研究不僅首次培養(yǎng)出許多腸道中難培養(yǎng)的細菌，同時對于培養(yǎng)方法的摸索為今后研究中減少方法的數(shù)量做出巨大貢獻。2014年該團隊從20 個方法中選擇出18 個最佳方法，有效減少了培養(yǎng)工作量，并在2016年用于37 份糞便樣品的培養(yǎng)，其中63 種首次被培養(yǎng)細菌、58 種非腸道細菌、65 種非人類細菌和89 種未知細菌得以培養(yǎng)[16，19]。2016年加拿大Lau 等[1]采用33 種培養(yǎng)基分厭氧、非厭氧共66 種培養(yǎng)條件對5份新鮮糞便樣品進行分離，同時采用分子技術(shù)對樣品16S rRNA 基因V3 區(qū)擴增測序，結(jié)合兩種方法共鑒定到糞便中含量大于0.1%的全部微生物的95%，且培養(yǎng)方式鑒定到大多數(shù)的細菌，總共分離到79 個菌種純培養(yǎng)物，包括12 個人類微生物組計劃（Human microbiome project’s，HMP）最想獲得的菌種。

非培養(yǎng)的宏基因組測序方法在研究腸道微生物區(qū)系的貢獻不可忽視，近些年培養(yǎng)組學的優(yōu)勢也十分突出，結(jié)合兩種方法深入研究人體腸道菌群多樣性將是未來的研究趨勢。分子測序結(jié)果可指導用于恢復難培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基設(shè)計，同時通過分析健康與疾病宿主微生物的差異可以明確哪些菌株值得培養(yǎng)[20]。而經(jīng)培養(yǎng)獲得的純培養(yǎng)物更利于單菌株特殊基因功能的發(fā)掘，同時補充了基因組數(shù)據(jù)庫，為通過宏基因組測序鑒定微生物提供方便。丹麥Rettedal 等[21]以培養(yǎng)腸道低豐度細菌為出發(fā)點，在培養(yǎng)基中加入不同類型抗生素用于選擇培養(yǎng)一些難培養(yǎng)的微生物，進而對獲得的單菌株進行耐藥表型分析，成功確定了人類腸道微生物區(qū)系中16 種抗生素耐藥表型的分類。微生物表型研究不僅包括菌株耐藥性，還包括對膽鹽，高或低pH 值等的耐受性，這些表型指標在獲得菌株純培養(yǎng)物后很容易測得，且表型數(shù)據(jù)是細菌能否作為益生菌所必須篩查的。培養(yǎng)組學的應用加快了具有潛在健康益處的新菌種的獲得，在一定程度上促進了新型益生菌補充劑的開發(fā)利用。

1.2 不同策略用于難培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)

由多種培養(yǎng)方法與細菌的快速鑒定相結(jié)合的培養(yǎng)組學最重要的就是培養(yǎng)方法的設(shè)計，合適的培養(yǎng)策略決定獲得難培養(yǎng)微生物的數(shù)量。起初腸道中未被培養(yǎng)出來的這些微生物被稱作不可培養(yǎng)微生物，直到純培養(yǎng)技術(shù)被重新啟用才逐漸將其稱作難培養(yǎng)。所有難培養(yǎng)的微生物只要得到適合自身的培養(yǎng)方法都可以被培養(yǎng)[2]。營養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境、溫度和培養(yǎng)時間的選擇是培養(yǎng)條件中最基礎(chǔ)的點，此外培養(yǎng)策略的確定一方面基于基因組學分析的結(jié)果，依據(jù)對菌株代謝特性的預測，找到抑制或者適合菌株生長的添加物。另一方面，保證收集到的樣品能快速被培養(yǎng)，人體腸道中厭氧菌豐富，一些嚴格厭氧菌暴露在空氣中太久就會因接觸氧氣而失活，不利于后續(xù)的分離培養(yǎng)[22]。

傳統(tǒng)商業(yè)化的非選擇性培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，往往將樣品中生存能力強且含量較高的菌群培養(yǎng)出來，而研究目的是培養(yǎng)腸道中含量低于106未被宏基因組學檢測到的“暗物質(zhì)”，故需要通過不同培養(yǎng)方式或在培養(yǎng)基中添加特定成分確保達到選擇性培養(yǎng)的目的，也被稱為 “殺死贏家策略”[9]。Rettedal 等[21]在加入環(huán)丙沙星、磺胺甲惡唑和紅霉素等不同抗生素組合的平板上分離到了HMP 最想獲得的12 種微生物，并結(jié)合表型數(shù)據(jù)，進一步明確哪種抗生素組合對應分離得到哪種類型的微生物，此研究不僅為低豐度物種的培養(yǎng)提供了借鑒思路，同時明確了不同抗生素用于腸道細菌培養(yǎng)可獲得的具體菌種。臨床微生物學家發(fā)現(xiàn)膽汁提取物、伊紅、亞甲基藍、檸檬酸鈉和硫代硫酸鈉等物質(zhì)同抗生素一樣也有助于較低豐度腸道細菌的分離[23]。Lagier 團隊采用直徑為0.2～5 μm 不等的無菌濾膜過濾樣品中的主要菌群，通過在培養(yǎng)基加入大腸桿菌的特異性噬菌體T1 和T4 降低糞便中易培養(yǎng)的大腸桿菌含量，這兩種方法的使用極大的提高了低豐度細菌的首次培養(yǎng)[16]。另一些技術(shù)包括對樣品不斷的稀釋來培養(yǎng)少數(shù)菌群，也稱為“稀釋到滅絕”技術(shù)，或使用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，在一定程度上也能阻止優(yōu)勢菌群的生長[24-25]。以上所用方法均是為了培養(yǎng)腸道中豐度較低或者在存活競爭中處于劣勢的菌群，這些條件的使用有效避免了與傳統(tǒng)商業(yè)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的相同菌群，加快了腸道中一些低豐度新菌種的分離。

血培養(yǎng)瓶預培養(yǎng)是培養(yǎng)難培養(yǎng)微生物的另一個重要手段，通過此方法分離的新菌種達56%[19]。預培養(yǎng)可以將樣品中一些不易存活的菌種給予適宜條件使之生長起來再進行分離。Lagier 等[10，26]在將樣品接種到不同的瓊脂培養(yǎng)基之前，將糞便預先在有氧及厭氧血培養(yǎng)瓶中預培養(yǎng)1，5，10，14，21，26，30 d，采用此方法培養(yǎng)獲得了50 種新細菌。培養(yǎng)腸道細菌常用的是在培養(yǎng)基中加入綿羊血，還可依據(jù)樣品特點加入不同生長因子。研究人員在培養(yǎng)環(huán)境微生物時盡量讓培養(yǎng)條件接近自然環(huán)境，分離發(fā)酵乳中的乳酸菌時會在培養(yǎng)基中加入無菌酸馬奶上清液，目的也是為了更接近細菌的原始生存環(huán)境[27]。故為了模擬腸道環(huán)境，在培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.2 μm 無菌濾膜過濾后的糞便上清，促進了腸道中古細菌和厭氧菌的生長，Goodman等[11]通過此方法極大提高了培養(yǎng)糞便樣品中細菌的效率。此外，還可在培養(yǎng)基中加入無菌瘤胃液、動物組織液、脂類物質(zhì)和抗壞血酸或者是幾種促生長物質(zhì)的混合物，這些方法實現(xiàn)了許多難培養(yǎng)微生物的體外培養(yǎng)[16]。研究表明，添加瘤胃液可分離的新菌種占40%，添加綿羊血可分離的新菌種占25%，加上血培養(yǎng)瓶預培養(yǎng)的方法被認為是3個分離新細菌所必須的策略[19]。培養(yǎng)方法復雜多樣，且數(shù)量過多，嚴重限制了培養(yǎng)組學的發(fā)展，研究者需要不斷對培養(yǎng)方法進行歸類以減少數(shù)量，在培養(yǎng)腸道細菌時可以按照營養(yǎng)豐富、寡營養(yǎng)、特殊營養(yǎng)以及不同菌種對不同物質(zhì)的耐受性（酸、鹽、乙醇和熱等）幾大類型來設(shè)計培養(yǎng)條件，最終使培養(yǎng)組學更易操作，更加高效。

1.3 MALDI-TOF MS 用于微生物鑒定

最初微生物鑒定采用表型鑒定的方法，雖然鑒定結(jié)果準確，但操作繁瑣，所花費的時間較長，需要耗費大量的人力、物力。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA 基因擴增和測序成為細菌鑒定的黃金標準，特別是在沒有光譜的情況下[28]。然而采用分子手段鑒定細菌至少需要24 h，這種方法既耗時又昂貴，限制了它在高通量培養(yǎng)組學中的應用。MALDI-TOF MS 在1980年發(fā)展起來，通過將細菌特定的蛋白質(zhì)質(zhì)譜與參考庫進行比對，進而確定菌株所屬的種屬，近年來這種依靠細菌本身特定生物標記物來識別細菌逐漸成為鑒定的方法之一[29-30]。除了有較高的準確性外，它最大的優(yōu)點是能夠在很短時間內(nèi)完成細菌鑒定，具有操作簡便、鑒定迅速、準確率高和成本低的特點，尤其在價格上比16S rRNA 基因鑒定便宜100 倍。培養(yǎng)組學得以迅速發(fā)展很大原因基于MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)的支持。2009年，研究表明MALDI-TOF 質(zhì)譜鑒定細菌的正確率為95.4%，其中有84.1%可以鑒定到種水平，11.3%可以鑒定到屬水平[31]。該質(zhì)譜鑒定方法有效節(jié)省了時間和成本，鑒定結(jié)果的重復性較好，使得MALDI-TOF 質(zhì)譜成為培養(yǎng)組學中細菌鑒定的有效方法。如果沒有快速鑒定細菌的技術(shù)，培養(yǎng)組學獲得成千上萬菌落的鑒定，對于時間、成本和人工都是巨大考驗，這一突破使設(shè)計復雜培養(yǎng)方法、探索人類腸道微生態(tài)系統(tǒng)成為可能[32]。

2 培養(yǎng)組學在人體腸道微生物研究中的應用

2.1 可培養(yǎng)細菌數(shù)據(jù)庫的增加

近10年，隨著宏基因組學在微生物研究中的應用，人類對腸道微生物區(qū)系的認識似乎已經(jīng)到了平臺期，隨著培養(yǎng)組學的發(fā)展，腸道中的一些“暗物質(zhì)”逐漸被揭開。一些通過分子手段鑒定不到的“Unclassified”逐漸被培養(yǎng)鑒定，不斷有新培養(yǎng)得到的細菌基因組數(shù)據(jù)被收入人類腸道細菌數(shù)據(jù)庫。據(jù)統(tǒng)計，截至2018年，通過培養(yǎng)方式首次分離得到的菌種已經(jīng)由2015年統(tǒng)計的2 172 種增加到2 776 種，所增加的604 種細菌中，有372 種分離自腸道[6，33]。Lagier 等[3]在2012年首次采用培養(yǎng)組學分離鑒定到174 個以前在人類腸道中從未培養(yǎng)過的細菌，并對其中31 個新細菌的基因組測序，產(chǎn)生了約1 萬個新的未知基因，這不僅擴充了細菌數(shù)據(jù)庫，同時有助于細菌基因功能的深入發(fā)掘。該團隊從2012年到2015年共發(fā)現(xiàn)新種121種，其中有91 種是通過培養(yǎng)得到，占比達75%。假設(shè)細菌與最接近它的標準菌株的相似性小于98.65%則被定義為疑似新種，那么使用培養(yǎng)方法每周就能確定1～25 個疑似新種[16，32]。到2017年，該團隊共從人體中分離培養(yǎng)出329 個新細菌，使已知的人類細菌庫增加了29%，且首次從人體內(nèi)分離到4 種古生菌，其中包括2 個新菌種。通過培養(yǎng)組學增加人類微生物資源庫，有助于研究人員從發(fā)現(xiàn)的新細菌中開發(fā)安全有效的適用于人體的益生菌[34]。人體腸道細菌參考基因組對于分析細菌基因功能十分重要，華大基因Zou 等[35]收集了來自健康人糞便中分離出的6 000 多個細菌中產(chǎn)生的基因組數(shù)據(jù)，并將其命名為可培養(yǎng)基因組參考集（Culturable genome reference），這是一個由1 520 個非冗余的、高質(zhì)量的基因組草圖組成的集合，覆蓋人類腸道所有主要細菌門和屬，其中還包括了264 個現(xiàn)有參考基因組目錄中沒有的基因組。可培養(yǎng)參考基因組數(shù)量的增加很大程度依賴于高通量的微生物培養(yǎng)，增加的數(shù)量越多使測序獲得的基因序列與數(shù)據(jù)庫比對的速度越快，同時也提高了對人體腸道微生物基因組的分辨率，進而能更加準確剖析單個菌株的基因功能?？膳囵B(yǎng)基因組參考集的建立，極大的推動了基因組學在腸道微生物中的應用。

2.2 與人體腸道細菌療法相關(guān)菌群的培養(yǎng)

結(jié)合宏基因組分析結(jié)果，目前發(fā)現(xiàn)的一些可能涉及到定植、急性或慢性感染的微生物被培養(yǎng)的比例很低[34]。雖然測序能認識到復雜的腸道微生態(tài)，卻不能明確微生物在宿主中發(fā)揮作用的機制，也無法拿到單菌株做驗證試驗。培養(yǎng)組學通過培養(yǎng)健康與患病個體腸道中的差異生物標志物，獲得細菌活體樣本，進而深入剖析細菌與疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系機制[32]。

腸道微生物區(qū)系的一個主要功能是提供抗定殖能力，其中病原體細菌被抑制或控制在感染水平以下。糞菌移植（FMT）已被廣泛用于治療由于致病或條件致病微生物過多而引起的胃腸道疾病，如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等[36-37]。這得益于腦腸軸的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT 還被證實可以有效緩解自閉癥[38]。而目前此方法仍存在很多問題，糞便捐獻者在捐贈糞便過程中可能將自身一些潛在致病菌傳染給被移植者，這是治療中很難避免的問題。一些腸道細菌與結(jié)直腸癌或肥胖相關(guān)[39-40]，據(jù)報道，F(xiàn)MT 治療后患者體重指數(shù)無故增加了8.5 個點[41]。人們希望確切地知道在治療過程中具體有哪些細菌被轉(zhuǎn)移給了患者。通過培養(yǎng)組學可以獲得健康人與患者腸道的關(guān)鍵差異細菌群，服用混合菌的方式有效避免了患者受捐贈者帶來的潛在致病菌的影響。艱難梭狀芽孢桿菌（Clostridium difficile）是由于患者在服用抗生素后，導致腸道菌群嚴重失調(diào)，進而引發(fā)從輕度腹瀉到偽膜性結(jié)腸炎的腸道疾病，該病具有高發(fā)病率、高致死率，老年人易患此類疾病。目前比較有效的治療方式是通過FMT 來抑制腸道中艱難梭狀芽孢桿菌的生長[42-43]，Amrane 等[44]通過對糞便捐贈者與艱難梭狀芽孢桿菌感染者的糞便進行培養(yǎng)，得到了3 株已經(jīng)被證明可以有效抑制艱難梭狀芽孢桿菌感染的細菌。Ghimire 等[45]通過培養(yǎng)組學分離得到102 種細菌，采用共培養(yǎng)法篩選出66 種對艱難梭狀芽孢桿菌有抑制作用的菌株，并依據(jù)表型數(shù)據(jù)（生長速率，短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，甘露醇、山梨醇或琥珀酸的利用） 選取66 種細菌中的部分菌株組成256 種組合，用以評估對艱難梭狀芽孢桿菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)菌種組成和比例對抑制效果都有影響，必須深入研究混合物中細菌之間以及其與宿主之間的相互作用，才能研制出有效抑制艱難梭狀芽孢桿菌的細菌混合制劑。無論是研究細菌表型還是獲得不同細菌的混合物都依賴于培養(yǎng)，此外培養(yǎng)物還可提供用于體外實驗的菌株，并通過動物模型確認特定細菌在疾病發(fā)病機制中的作用。總之，加快培養(yǎng)腸道中難培養(yǎng)的細菌，積極開展臨床治療試驗，是細菌療法治愈與人體腸道微生物相關(guān)疾病的關(guān)鍵。

3 結(jié)語與展望

培養(yǎng)組學的研究主要是基于培養(yǎng)方法的摸索，雖然菌落的鑒定已經(jīng)有MALDI-TOF 質(zhì)譜技術(shù)助力，但復雜策略培養(yǎng)得到的大量菌落的選取仍帶來很大工作量，與宏基因組測序技術(shù)相比，此研究確實是既耗費人工又耗費金錢的一項工作，但它仍是值得的。對于探明人體腸道微生物區(qū)系，明確疾病與腸道菌群的內(nèi)在關(guān)系，以及新型益生菌的開發(fā)都具有重要作用，培養(yǎng)組學是未來腸道微生物研究的發(fā)展方向。