即食鮑魚特定腐敗菌的鑒定及其致腐能力研究

鄭瑞生，鄒菊琴，金興玨，李 露，，王丹妮，，蘇昆輪，林松丁

（1泉州師范學(xué)院 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室 福建泉州 362002 2安記食品股份有限公司 福建泉州 362000 3福建正港食品有限公司 福建泉州 362013）

鮑魚屬單殼軟體動物，含有豐富的蛋白質(zhì)，味道鮮美，是中國傳統(tǒng)的名貴食材，位居四大海味之首。即食鮑魚因食用方便，營養(yǎng)美味而深受廣大消費者的喜愛。然而，鮑魚易受環(huán)境微生物污染，加工過程殺菌不徹底等因素影響，容易導(dǎo)致即食鮑魚在貯藏過程發(fā)生黑變、惡臭、脹袋、流汁及軟化等腐敗現(xiàn)象，縮短產(chǎn)品的保質(zhì)期[1]。有研究認(rèn)為大多數(shù)情況下食品中只有部分微生物參與腐敗過程[2]。Dalgaard[3]提出特定腐敗菌（Specific spoilage organism，SSO）的概念，在相同地理條件下，同類型水產(chǎn)品中只有一種或幾種微生物以腐敗菌形式出現(xiàn)，甚至特定腐敗菌可能只有1 種[4]，而且隨著棲息水域、種類、捕獲方式、季節(jié)、加工環(huán)境和貯藏條件的不同，其特定腐敗菌也不同[5]。

即食鮑魚在貯藏過程中，優(yōu)勢腐敗菌降解鮑魚蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生一些腐敗物質(zhì)，如胺、吲哚、硫醇、有機酸等，導(dǎo)致鮑魚在感官上發(fā)生明顯的變化[6]。通過某些生化指標(biāo)可以有效判斷鮑魚產(chǎn)品的特性。如：揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）是判斷水產(chǎn)品鮮度的重要指標(biāo)，在酶和細(xì)菌的作用下，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生具有揮發(fā)性的氨氮等堿性化合物；pH 值的高、低也是評判水產(chǎn)品酸敗程度的指標(biāo)，腐敗酸敗的水產(chǎn)品pH 值偏低，味道刺鼻；酚類化合物會在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌類化合物，發(fā)生黑變現(xiàn)象等[7]。

據(jù)本課題組前期研究即食鮑魚加工過程殘留菌的變化結(jié)果[8]，篩選合適的培養(yǎng)基、分離出即食鮑魚特定腐敗菌，采用16S rDNA 和細(xì)菌生化鑒定試劑盒進行鑒定。然后，將SSO 接種于即食鮑魚中，研究即食鮑魚黑變、流汁、軟化、酸敗、脹袋等腐敗成因。進一步驗證導(dǎo)致即食鮑魚腐敗的SSO，有針對性地采取控制措施，減緩即食鮑魚腐敗變質(zhì)，確保食品質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai），泉州市某水產(chǎn)批發(fā)市場。

甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）、多黏菌素B、胰酪胨大豆羊血瓊脂基礎(chǔ)（TSSB）、脫纖維羊血、酪蛋白瓊脂、3%H2O2、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂、0.5%堿性復(fù)紅、革蘭氏染色液試劑盒、蠟樣芽孢桿菌生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

營養(yǎng)瓊脂（NA）、營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基，杭州微生物有限公司；鹽酸、氯化鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；高氯酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，上海金鹿化工有限公司；領(lǐng)苯二酚，阿拉?。籐-脯氨酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純級。

1.2 設(shè)備與儀器

XHF-D 型高速分散器（內(nèi)切式勻漿機）、15-07 型勻質(zhì)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHP-150 型生化培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；GHP-9080 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R 型立式蒸汽滅菌器、BSD-YX2200 型搖床，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Sup G6R 型Supcre 系列菌落計數(shù)/篩選/抑菌圈測量聯(lián)用儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；GL-20G-H 型高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-120 型紫外-可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；STARTER3100 型實驗室pH 計，上海奧豪斯儀器有限公司；K9840 型自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器有限公司；ADCI 系列全自動色差計，北京辰泰克儀器技術(shù)有限公司。

1.3 即食鮑魚加工工藝流程

鮮活鮑魚→開殼、取肉→清洗、瀝干→調(diào)味→腌制→高溫烘烤→低溫冷卻→真空包裝→成品冷藏。

1.4 特定腐敗菌的分離、純化、鑒定

根據(jù)本課題前期DGGE 研究結(jié)果，參照GB 4789.14-2014[9]方法，利用MYP 選擇性培養(yǎng)基【甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP）+多黏菌素B+卵黃】對即食鮑魚特定腐敗菌進行分離、純化，最終形成單一菌落，利用16S rDNA 進行鑒定。

1.4.1 特定腐敗菌16S rDNA 鑒定 按“Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒”操作步驟提取鮑魚細(xì)菌總DNA。通用引物：27F-AGTTTGATCMTG GCTCAG；1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，長度1 500 bp 左右。PCR 反應(yīng)體系：0.5 μL Template（基因組DNA 20～50 ng/μL），2.5 μL 10×Buffer（含Mg2+），1 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.2 μL Taq 酶，0.5 μL 27F，0.5 μL 1492R，加 雙 蒸H2O 至25 μL，PCR 反應(yīng)條件：在94 ℃下進行5 min 預(yù)變性，隨后循環(huán)擴增30 個循環(huán)（包括94 ℃變性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸60s），最后在72 ℃下延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收純化，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將拼接后的測序結(jié)果輸入https：//www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST 軟件，將測定得到的基因序列與Genbank 數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，并進行同源相似性比較。

1.4.2 特定腐敗菌的生化鑒定

1）生化鑒定 參照“DBI-07 蠟樣芽孢桿菌干制生化鑒定試劑盒”進行操作。

2）溶血試驗 挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落接種于TSSB 瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h。

3）蛋白質(zhì)毒素晶體檢測試驗 挑取單個可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落于載玻片上，干燥，固定。加甲醇作用30 s 后傾去，再通過火焰干燥，滴0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱1～2 min，移去火焰。更換染色液，再次加溫染色30 s，傾去染液用無菌水沖洗、晾干后鏡檢。

1.5 特定腐敗菌接種于即食鮑魚的研究

1.5.1 特定腐敗菌的接種試驗 取即食鮑魚置于超凈臺，用紫外殺菌1 h，期間用無菌鑷子翻面1次，即為無菌即食鮑魚。取35 ℃培養(yǎng)18～20 h 的特定腐敗菌用NB 稀釋至105～106CFU/mL，取1 μL該菌懸液，用無菌注射器注射到（30±5）g 的即食鮑魚表面，用無菌包裝袋包裝，放置于35 ℃培養(yǎng)箱中貯藏18 d。每隔3 d 取樣進行各項理化指標(biāo)檢測。

1.5.2 pH 值的測定 稱取5 g 鮑肉試樣（精確至0.01 g），加蒸餾水45 mL，絞碎，搖勻，取懸浮液于50 mL 燒杯中（分置2 杯），用酸度計測定pH 值。1.5.3 TVB-N 的測定 參照《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》（GB 5009.228-2016）[10]方法測定。

1.5.4 汁液流失率的測定

汁液流失率（%）=（貯藏前鮑魚質(zhì)量－貯藏后鮑魚質(zhì)量）/貯藏前鮑魚質(zhì)量×100

1.5.5 菌落總數(shù)的測定 菌落總數(shù)的測定參照GB 4789.2-2016[11]規(guī)定的方法進行測定。

1.5.6 PPO 的測定 參考林婷[12]的方法并稍作修改，10 g 鮑魚加入0.067 mol/L 磷酸鈉緩沖液（pH 7.2 左右）25 mL 進行均質(zhì)。將濾液8 000 r/min 離心30～40 min。取0.8 mL 的上清液，加入0.5 mol/L 鄰苯二酚和L-脯氨酸各0.4 mL，再加入0.067 mol/L 磷酸鈉緩沖（pH 7.2）4.4 mL，混勻，于37 ℃水浴10 min，測定530 nm 波長處的OD 值。

1.5.7 亨特白度值的測定 取鮑魚腹足部位，運用ADCI 系列全自動測色色差計進行白度測定，測9 次取平均值。

1.5.8 感官指標(biāo)的判斷 采用描述性評價法[13]分析即食鮑魚感官變化，主要判斷指標(biāo)有：組織形態(tài)是否富有彈性，有無流汁；色澤富有光澤，是否出現(xiàn)黑變；是否存在固有的烘烤香味，有無酸敗或其它異味產(chǎn)生；有無脹袋；汁液流失現(xiàn)象是否嚴(yán)重等。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 軟件繪圖和數(shù)據(jù)處理，用SPSS 評判

顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食鮑魚特定腐敗菌的分離、純化、鑒定結(jié)果

2.1.1 16 S rDNA 鑒定即食鮑魚特定腐敗菌 本課題組前期研究即食鮑魚加工過程菌群的變化，分析出腐敗即食鮑魚的優(yōu)勢腐敗菌。選取最亮的條帶，比對出相應(yīng)的疑似菌株，利用MYP 培養(yǎng)基對即食鮑魚殘留腐敗菌進行分離、純化，提取該腐敗菌的DNA，進行PCR 擴增，得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的特異性條帶，片段長度在1 500 bp 左右，見圖1。

圖1 特定腐敗菌16S rDNA 的PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA amplified products of SSO PCR

PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后進行核苷酸序列分析，將獲得的有效序列提交到NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），通過Blast 程序與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進行相似性比對。分離到的菌株序列與GenBank 中最接近細(xì)菌的同源性達(dá)到100%，初步確定該細(xì)菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），見表1。

表1 特定腐敗菌的鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of SSO

2.1.2 生化鑒定特定腐敗菌 利用DBI-07 生化鑒定試劑盒對SSO 進行生化鑒定，鑒定結(jié)果如表2所示。

根據(jù)分離純化出的SSO 進行生化鑒定，由表2可知，動力性、溶菌酶耐性、葡萄糖利用、V-P、硝酸鹽還原、明膠液化、檸檬酸鹽利用、過氧化氫酶和溶血試驗均呈陽性；甘露醇產(chǎn)酸和蛋白質(zhì)毒素晶體反應(yīng)均呈陰性；符合GB 4789.14-2014[9]中蠟樣芽孢桿菌的生化特征，確定分離出的腐敗菌為蠟樣芽孢桿菌。

表2 特定腐敗菌各項生化鑒定結(jié)果判斷Table 2 Results of biochemical identification of SSO

2.2 SSO 接種于即食鮑魚后的理化指標(biāo)變化

用蠟樣芽孢桿菌接種于經(jīng)滅菌的即食鮑魚，將接種與未接種的即食鮑魚放置在37 ℃培養(yǎng)，每隔3 d 檢測染菌鮑魚（接種）及自然腐敗鮑魚（未接種）的各項理化指標(biāo)，詳見表3。

表3 鮑魚的各項指標(biāo)比較Table 3 Comparison of various indexes of abalone

2.2.1 pH 值的變化 如表3所示，貯藏期間染菌鮑魚的pH 值低于自然腐敗鮑魚，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。即食鮑魚初始pH 值為6.62，貯藏前9 d，染菌和自然腐敗鮑魚的pH 值均呈先下降后上升的趨勢，第9 天達(dá)到最大值6.27 和6.52。這是由于在蠟樣芽孢桿菌的作用下，鮑魚蛋白分解成含氮化合物，有氨態(tài)氮及甲胺、尸胺等，導(dǎo)致pH值上升。隨后腐敗菌降解糖類化合物、脂肪等進一步分解產(chǎn)生有機酸，如甲酸、乙酸、丙酮酸等，形成酸敗氣味，導(dǎo)致pH 值下降[14]。

2.2.2 TVB-N 的變化 如表3所示，貯藏期間TVB-N 值基本呈上升趨勢，且染菌鮑魚的TVB-N高于自然腐敗鮑魚，差異達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。即食鮑魚初始TVB-N 為9.04 mg/100 g，貯藏第18 天時，自然腐敗鮑魚與染菌鮑魚分別達(dá)到最大值91.84，362.32 mg/100 g，嚴(yán)重超過國家標(biāo)準(zhǔn)值[15]，可見，蠟樣芽孢桿菌能分解鮑魚蛋白產(chǎn)生胺類化合物，甚至是吲哚及硫醇等含氮含硫物質(zhì)；同時蠟樣芽孢桿菌能利用鮑魚中的糖類物質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生有機酸、丙酮酸等化合物，同時產(chǎn)生H2S、CO2等惡臭氣味，形成脹袋現(xiàn)象[16]。

2.2.3 汁液流失率的變化 如表3所示，鮑魚汁液流失率的變化均呈升高趨勢，且染菌鮑魚的汁液流失率高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01），主要由于蠟樣芽孢桿菌能分泌蛋白酶（胞外酶），分解動物蛋白（明膠）生成小分子物質(zhì)，出現(xiàn)液化現(xiàn)象，加劇即食鮑魚汁液流失。

2.2.4 菌落總數(shù)的變化 如表3所示，菌落總數(shù)呈先上升后下降的趨勢。即食鮑魚的初始菌落為2.04 lg（CFU/g），染菌鮑魚在第3 天達(dá)到最大值6.63 lg（CFU/g）；自然腐敗鮑魚在第6 天達(dá)到最大值5.64 lg（CFU/g）。隨后逐漸降低，自然腐敗鮑魚下降更為明顯，染菌鮑魚的菌落總數(shù)顯著高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01）。主要由于受密閉包裝環(huán)境影響，好氧微生物生產(chǎn)被抑制，雖出現(xiàn)下降趨勢，但兩者均超過國家標(biāo)準(zhǔn)[17]?？梢娤灅友挎邨U菌加快了即食鮑魚的腐敗菌的滋生。

2.2.5 PPO 變化情況 如表3所示，貯藏期間PPO 吸光度變化趨勢基本一致，呈上升趨勢。即食鮑魚初始PPO 的OD530nm為0.270，貯藏第18 天，染菌鮑魚達(dá)0.732，自然腐敗鮑魚為0.611。且染菌鮑魚的PPO 活性高于自然腐敗鮑魚（P＜0.01）。由于即食鮑魚中的酚類化合物會在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌類，形成黑變現(xiàn)象[18-19]，導(dǎo)致PPO 吸光度值一直呈上升趨勢?？梢姡灅友挎邨U菌促進即食鮑魚發(fā)生黑變現(xiàn)象。

2.2.6 亨特白度變化情況 貯藏期間，鮑魚的亨特白度值基本呈上升趨勢。自然腐敗鮑魚的亨特白度一直高于染菌鮑魚，這是由于染菌鮑魚的PPO 含量較高，促使鮑魚發(fā)生黑變。貯藏時間越長，染菌鮑魚黑變越顯著。

2.2.7 感官指標(biāo)變化情況 貯藏期間2 種鮑魚的感官評價均呈下降趨勢，染菌鮑魚的感官指標(biāo)明顯低于自然腐敗鮑魚。染菌鮑魚在第3 天時就出現(xiàn)明顯軟化、漲袋、汁液流失現(xiàn)象：貯藏第9 天，染菌鮑魚出現(xiàn)極其刺鼻的味道，組織軟化嚴(yán)重，鮑肉黑變明顯。而自然腐敗鮑魚感官變化相對緩慢。由此可見，蠟樣芽孢桿菌加劇鮑魚的腐敗變質(zhì)，尤其是組織形態(tài)軟化、黑變、流汁現(xiàn)象更為嚴(yán)重。

3 結(jié)論

根據(jù)DGGE 技術(shù)分析結(jié)果，利用16S rDNA技術(shù)和細(xì)菌生化鑒定試劑盒對即食鮑魚分離出的優(yōu)勢腐敗菌進行鑒定，確定即食鮑魚的SSO 為蠟樣芽孢桿菌。通過接種蠟樣芽孢桿菌試驗，對比天然腐敗鮑魚與染菌鮑魚的理化指標(biāo)，結(jié)果表明：在貯藏過程中，染菌鮑魚的pH 值、TVB-N、汁液流失率、菌落總數(shù)、亨特白度、PPO 活性等指標(biāo)均比自然腐敗鮑魚劣化更為嚴(yán)重。結(jié)合感官評價，染菌鮑魚出現(xiàn)明顯漲袋、汁液流失及黑變現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)極其刺鼻的氣味，組織軟化嚴(yán)重。而自然腐敗鮑魚感官變化相對緩慢。由此可見，蠟樣芽孢桿菌加快即食鮑魚中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和酚類化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的分解，產(chǎn)生腐敗性物質(zhì)，縮短了即食鮑魚的貯藏時間，促使即食鮑魚產(chǎn)生黑變、惡臭、脹袋、流汁及軟化等腐敗變質(zhì)現(xiàn)象。

本研究利用蠟樣芽孢桿菌接種于即食鮑魚，對其致腐能力進行綜合分析，進一步驗證了蠟樣芽孢桿菌作為真空包裝即食鮑魚特定腐敗菌的可能性。因此，有必要針對蠟樣芽孢桿菌采取有效的控制措施防止其滋生，延長即食鮑魚的貨架期。