發(fā)酵肉制品中葡萄球菌的分離、鑒定及其對(duì)肉蛋白的降解能力

田 媛，呂重陽，張玲玲，徐幸蓮，王虎虎

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210095）

發(fā)酵肉制品是以畜禽肉為原料，在自然或人工控制條件下，利用微生物的發(fā)酵作用，經(jīng)腌制、發(fā)酵、干燥等工藝制得的一類具有獨(dú)特風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的肉制品[1]。自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵是生產(chǎn)發(fā)酵肉制品的2 種方式。隨著肉類消費(fèi)的迅速增長，前者因產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差，受季節(jié)制約，發(fā)酵周期長等弊端逐漸被人工接種發(fā)酵替代[2]。我國是肉制品產(chǎn)銷大國，根據(jù)中國統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)預(yù)測，到2020年，我國肉類產(chǎn)量將達(dá)到9 412.05 萬t[3]。篩選具有優(yōu)良性能的菌株作為發(fā)酵劑，是生產(chǎn)高品質(zhì)發(fā)酵肉制品的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的野生菌株可作為分離、篩選優(yōu)良菌株的來源。許多微生物發(fā)酵劑篩自發(fā)酵肉制品，例如：Hwanhlem 等[4]從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵魚的不同發(fā)酵階段篩選出4 株可用于生產(chǎn)發(fā)酵魚的乳酸菌；Li 等[5]從中國哈爾濱干香腸中分離出木糖葡萄球菌和戊糖片球菌，該木糖葡萄球菌對(duì)未添加亞硝酸鹽的生肉糜有良好的發(fā)色作用，該菌株可為肉制品中亞硝酸鹽的替代提供解決方案。

傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品主要分為發(fā)酵香腸、火腿及腌臘肉制品，其中薩拉米香腸、金華火腿、中式臘肉等是廣富盛名的代表性產(chǎn)品。乳酸菌、葡萄球菌、微球菌以及酵母菌和霉菌是目前發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的微生物發(fā)酵劑，上述菌種可被研制為單一菌種發(fā)酵劑或復(fù)合菌種發(fā)酵劑投入使用[6]。為確保發(fā)酵肉制品的產(chǎn)品質(zhì)量與食用安全性，有必要使用具有理想發(fā)酵性能且安全穩(wěn)定的發(fā)酵菌株。有選擇性地添加優(yōu)良發(fā)酵劑，可顯著改善發(fā)酵肉制品的品質(zhì)及風(fēng)味，滿足消費(fèi)者對(duì)發(fā)酵肉制品食用安全性和感官品質(zhì)的要求。優(yōu)質(zhì)微生物發(fā)酵劑的開發(fā)有助于發(fā)酵肉制品實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

葡萄球菌是發(fā)酵肉制品生產(chǎn)的主要發(fā)酵菌種之一。有益葡萄球菌可還原硝酸鹽，促進(jìn)產(chǎn)品發(fā)色[7]，亦可降解蛋白質(zhì)及脂肪，協(xié)調(diào)風(fēng)味形成。木糖葡萄球菌、肉球葡萄球菌、腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢葡萄球菌，前兩者更是商業(yè)化肉品發(fā)酵劑研發(fā)的重要菌株來源[8]。篩選優(yōu)良菌株作為肉制品發(fā)酵劑，可改進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，進(jìn)而有效控制產(chǎn)品品質(zhì)及安全性，對(duì)高品質(zhì)發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從發(fā)酵肉制品中分離出54 株菌，經(jīng)16S DNA 測序鑒定及耐鹽性分析，選取其中8 株耐鹽葡萄球菌做血漿凝固酶試驗(yàn)。取血漿凝固酶陰性菌株胞外蛋白酶粗酶液作用于肌肉蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試驗(yàn)分析胞外蛋白酶對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解能力。本試驗(yàn)通過分離、鑒定發(fā)酵肉制品中的有益葡萄球菌并對(duì)其蛋白降解能力進(jìn)行研究，旨在篩選優(yōu)質(zhì)肉制品發(fā)酵菌株，以期為肉制品發(fā)酵劑研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵肉制品（8 份，樣品信息如表1所示），南京麥德龍超市；TSA 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基、碘化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈉、西林瓶，三河陸橋質(zhì)檢科技公司；注射器，常州醫(yī)療器械有限公司；0.22 μm 濾膜，南通天驕過濾材料公司。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information

分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰Airtech 公司；高壓滅菌鍋，日本Hirayama 公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；自動(dòng)影像分析菌落計(jì)數(shù)儀、拍擊式均質(zhì)器，法國Interscience 公司；恒溫恒濕箱，德國Memmert公司；臺(tái)式恒溫振蕩器，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)，美國Beckmen 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 無菌條件下將樣品切碎，各稱取20 g 分別置于盛有180 mL 無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，擊拍式均質(zhì)器拍打2 min，均質(zhì)液待用。

1.2.2 細(xì)菌分離 配制MRS 培養(yǎng)基及添加5%氯化鈉的MRS 培養(yǎng)基，采用涂布儀將樣品均質(zhì)液均勻涂布至培養(yǎng)基表面，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。每份樣品挑選出3～8 株長勢良好的典型菌落，于TSA平板劃線分離獲得單菌落。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察 觀察記錄TSA 固體培養(yǎng)基上純化的單菌落形態(tài)，形態(tài)特征包括菌落顏色、形狀、隆起度、邊緣、光澤、質(zhì)地、透明度、大小等。

1.2.4 菌種鑒定 采用16S DNA 測序，委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.5 血漿凝固酶測試 具體步驟參考于忠娜等[9]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)，挑取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24 h 至生長對(duì)數(shù)期，將對(duì)數(shù)期菌懸液離心（10 000×g，12 min，4 ℃），棄上清，用無菌生理鹽水反復(fù)洗滌3 次，制得待檢液。在西林瓶內(nèi)加入0.5 mL 無菌生理鹽水輕微搖晃至凍干血漿溶解完全，然后加入0.2 mL 待檢液，將西林瓶置于（36±1）℃培養(yǎng)，在1，3，6 h 共3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察反應(yīng)結(jié)果，如若傾斜或倒置時(shí)出現(xiàn)凝塊或凝固體積大于原體積的50%，即判定為陽性。

1.2.6 肌肉蛋白提取 豬肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的提取參考Mauriello 等[10]的方法，稱取2 g新鮮豬瘦肉與20 mL PB 緩沖液（0.02 mol/L，pH 6.5）混合，勻漿后離心（13 000×g，20 min，4 ℃），上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌得到肌漿蛋白；向上一步沉淀中加入20 mL 含0.1% Triton X-100的PB 緩沖液（0.03 mol/L，pH 7.4）勻漿后離心，重復(fù)上述步驟3 次以除去組織蛋白酶；將沉淀與PB緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）以1∶9 的體積比混合，加入0.7 mol/L 的KI 溶液后勻漿并離心，將上清液稀釋5 倍以減小KI 對(duì)細(xì)菌的影響，使用0.22 μm 濾膜過濾稀釋后的上清液即得肌原纖維蛋白。采用牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)曲，根據(jù)BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得肌漿蛋白提取液、肌原纖維蛋白提取液蛋白質(zhì)量濃度分別為6.11，5.89 mg/mL，用PB 緩沖液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量濃度至4 mg/mL。

圖1 BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 BSA standard curve

1.2.7 SDS-PAGE 電泳 通過SDS-PAGE 檢測6株葡萄球菌的胞外蛋白酶活性，參考王光宇[11]的方法，將篩選所得6 株血漿凝固酶陰性葡萄球菌分別接種至TSB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)，取生長對(duì)數(shù)末期菌懸液1 mL 離心（10 000×g，5 min，4 ℃），上清液即為葡萄球菌胞外蛋白粗酶液。取上述各粗酶液200 μL 分別與1 mL 的肌漿蛋白、肌原纖維蛋白混合，于25 ℃條件下孵育20 h，取孵育后蛋白溶液及2×SDS 上樣緩沖液各200 μL 混合，95 ℃水浴5 min。肌漿蛋白采用12%Bio-Rad 預(yù)制膠，肌原纖維蛋白采用10%Bio-Rad 預(yù)制膠，樣品上樣量20 μL，標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣量為8 μL，使用110 V 電壓工作90 min。電泳結(jié)束后使用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色1.5 h，用洗脫緩沖液脫色8 h，洗脫過程中定時(shí)更換脫色液，洗脫結(jié)束后置凝膠于Typhoon 掃描儀中獲得電泳圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，應(yīng)用Origin 8.5 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

本次篩選共分離出54 株菌，觀察記錄TSA平板上生長的單菌落形態(tài)，菌落形態(tài)呈現(xiàn)多樣化差異：顏色分為白色、黃色與淺黃色3 種；形狀以圓形為主；隆起度呈微隆、平和低凹3 種；邊緣存在整齊與不整齊2 種情況；表面形態(tài)以光滑為主，絕大部分菌落有光澤；質(zhì)地有溫潤、奶油狀和透明3 種狀況；透明度分為半透明和透明2 種；大小呈小、中2 種。

2.2 基因檢測

將54 株菌進(jìn)行16S DNA 測序，樣品檢測結(jié)果如表2所示。

表2 樣品檢測結(jié)果信息表Table 2 Sample test result information

2.3 血漿凝固酶試驗(yàn)

葡萄球菌屬至少包括40 種，通常存在于動(dòng)物的皮膚及粘膜表面，它們大多數(shù)是無害的，然而只有凝固酶陰性葡萄球菌可作為安全的肉品發(fā)酵劑，賦予肉制品良好風(fēng)味、顏色及質(zhì)地[12]。為確保發(fā)酵肉制品的產(chǎn)品質(zhì)量與食用安全性，有必要使用具有理想發(fā)酵性能和安全穩(wěn)定的發(fā)酵菌株。

血漿凝固酶試驗(yàn)是一項(xiàng)經(jīng)典的細(xì)菌學(xué)生化試驗(yàn)，是否產(chǎn)血漿凝固酶是判斷葡萄球菌有無致病性的重要依據(jù)，致病性葡萄球菌產(chǎn)生凝固酶，凝固酶可使人體血液中纖維蛋白形成凝固層，導(dǎo)致血漿凝固，危害人體健康[13]。因此，凝固酶陰性是葡萄球菌作為肉制品發(fā)酵劑的前提條件。食品中葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)已被納入國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，然而國標(biāo)規(guī)定的增菌時(shí)間長，難以滿足快速高通量獲得檢驗(yàn)結(jié)果的需求[14]。西林瓶檢測法是為適應(yīng)上述需求發(fā)展而來的商業(yè)化檢測方法，相較于傳統(tǒng)檢測法可快速獲得結(jié)果。張玉鳳等[15]使用西林瓶檢測法對(duì)臨床分離的17 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，將細(xì)菌懸液置于西林瓶內(nèi)培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示17 株分離株均呈凝固酶陽性。王旭榮等[16]通過觀察6 h 內(nèi)金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物在含凍干兔血漿的西林瓶內(nèi)的凝集情況，得出5 株分離自牛乳房炎乳汁中的金黃色葡萄球菌均呈血漿凝固酶陽性的試驗(yàn)結(jié)果。上述實(shí)例表明，西林瓶檢測法適用于葡萄球菌血漿凝固酶陰、陽性的快速鑒定。

圖2 血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Plasma coagulase test results

本試驗(yàn)采用西林瓶快速檢測法，對(duì)分離篩選的8 株耐鹽葡萄球菌進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，菌株編號(hào)分別為29，31，33，37，39，46，53，54（其中33號(hào)金黃色葡萄球菌作陽性對(duì)照）。試驗(yàn)結(jié)果表明，除對(duì)照菌株外，僅46 號(hào)呈血漿凝固酶陽性，其余6 株為凝固酶陰性，可用于肉品發(fā)酵劑的開發(fā)。

46 號(hào)菌株為腐生葡萄球菌亞種，腐生葡萄球菌一般不致病，屬凝固酶陰性，導(dǎo)致試驗(yàn)現(xiàn)象與理論相悖的原因可能由于檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。高霞等[17]研究了不同抗凝劑對(duì)金黃色葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)的影響，結(jié)果表明采用試管法以EDTA K2抗凝人血漿為抗凝劑時(shí)，假陽性率為3.33%，而以枸櫞酸鈉抗凝人血漿為抗凝劑時(shí)，假陽性率為10%，二者相比試驗(yàn)結(jié)果存在顯著性差異（P<0.05）。王莧等[18]以玻片法檢測化妝品中分離的8株松鼠葡萄球菌及2 株腐生葡萄球菌，結(jié)果均呈凝固酶陽性，而8 株松鼠葡萄球菌中僅6 株產(chǎn)毒素。因此，為避免因方法自身局限性導(dǎo)致的假陽性現(xiàn)象對(duì)最終試驗(yàn)結(jié)果的判定，試驗(yàn)中如遇初檢為凝固酶陽性者，應(yīng)傳代培養(yǎng)后復(fù)檢再次確定。由此可見，僅以血漿凝固酶試驗(yàn)作為唯一標(biāo)準(zhǔn)用以評(píng)判葡萄球菌有無致病性并不合理，應(yīng)結(jié)合諸如溶血毒素試驗(yàn)、甘露醇分解能力等指標(biāo)作進(jìn)一步鑒定[18]。

表3 血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Plasma coagulase test results

2.4 胞外蛋白酶活性分析

血漿凝固酶陰性葡萄球菌胞外蛋白酶處理肌漿蛋白和肌原纖維蛋白后的SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖3、圖4所示，6 株葡萄球菌胞外蛋白酶對(duì)肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解能力不同。將肌肉蛋白與葡萄球菌胞外蛋白酶孵育20 h，肌原纖維蛋白沒有觀察到明顯降解現(xiàn)象，而肌漿蛋白均呈現(xiàn)一定程度的降解。在SDS-PAGE 圖譜中250 ku左右高分子質(zhì)量蛋白條帶的弱化模糊，以及較低分子質(zhì)量蛋白條帶的產(chǎn)生是肌漿蛋白發(fā)生降解的直觀表現(xiàn)，上述蛋白條帶變化表明6 株葡萄球菌胞外蛋白酶對(duì)肌漿蛋白有一定的降解能力。

圖3 肌漿蛋白SDS-PAGE 圖Fig.3 SDS-PAGE results of sarcoplasmic protein

圖4 肌原纖維蛋白SDS-PAGE 圖Fig.4 SDS-PAGE results of myofibrillar protein

肌肉蛋白降解通常是肌肉內(nèi)源酶和微生物蛋白酶共同作用的結(jié)果，微生物發(fā)酵劑可使蛋白分解為小肽和游離氨基酸，氨基酸是肉制品的主要風(fēng)味前體物質(zhì)，可在發(fā)酵劑作用下進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為醛、酸、醇和酯等芳香化合物[20]。許慧卿等[21]以木糖葡萄球菌為發(fā)酵劑加工風(fēng)鴨，采用SDS-PAGE電泳試驗(yàn)研究該菌株在風(fēng)鴨加工過程中對(duì)肌肉蛋白的降解能力，結(jié)果顯示該木糖葡萄球菌有效促進(jìn)了肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的降解，顯著增加了總游離氨基酸含量，證明木糖葡萄球菌是一種優(yōu)良的發(fā)酵菌株，可促進(jìn)肉制品風(fēng)味的形成。

肌原纖維蛋白和肌漿蛋白是肌肉蛋白的2 種主要成分，肌原纖維蛋白決定肉品的質(zhì)地、嫩度與保水性，肌漿蛋白影響肉的色澤和代謝過程[22]。本試驗(yàn)篩選所得葡萄球菌胞外蛋白酶僅對(duì)肌漿蛋白有降解作用，肌漿蛋白占肌肉蛋白質(zhì)含量的30%～35%，是動(dòng)物肌肉特有的一類蛋白質(zhì)，易溶于水及低離子強(qiáng)度的中性鹽溶液，主要由肌溶蛋白、肌紅蛋白和肌漿酶等組成，是肉中最容易提取的蛋白質(zhì)[23]。發(fā)酵菌株蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的降解能力存在差異，Villani 等[24]以傳統(tǒng)意大利發(fā)酵香腸優(yōu)勢菌株乳酸菌、彎曲乳桿及清酒乳桿菌為發(fā)酵劑，考察發(fā)酵菌株胞外蛋白酶對(duì)肌肉蛋白的降解情況，試驗(yàn)結(jié)果表明上述3 種發(fā)酵劑對(duì)肌原纖維蛋白的降解能力遠(yuǎn)不如肌漿蛋白。Fadda 等[25]采用SDS-PAGE 分析了在內(nèi)源酶和乳酸菌共同作用下，阿根廷干發(fā)酵腸中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解程度，結(jié)合降解產(chǎn)物的質(zhì)譜分析，得出發(fā)酵肉制品中肌漿蛋白降解程度較肌原纖維蛋白更高的結(jié)論。

本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)論相符，葡萄球菌胞外蛋白酶對(duì)豬肉肌原纖維蛋白無顯著降解效果，而對(duì)肌漿蛋白有一定降解能力，本研究僅對(duì)篩選所得6 株有益葡萄球菌胞外蛋白酶降解肌肉蛋白的能力進(jìn)行初探。蛋白質(zhì)降解受多種因素影響，肌肉部位、蛋白質(zhì)類型、pH 值、溫度、均會(huì)引起蛋白質(zhì)降解速率的差異，可通過增設(shè)孵育時(shí)長、溫度及pH 值梯度等優(yōu)化反應(yīng)體系，以獲更好的蛋白質(zhì)降解效果。

3 結(jié)論

從發(fā)酵肉制品中篩選出54 株菌，經(jīng)16S DNA 測序鑒定及耐鹽性分析，選取其中8 株耐鹽葡萄球菌進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，將6 株凝固酶陰性葡萄球菌胞外蛋白酶與肌肉蛋白孵育后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳試驗(yàn)，電泳結(jié)果顯示上述菌株胞外蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白無明顯降解作用，而對(duì)肌漿蛋白在250 ku 處的大分子蛋白呈現(xiàn)一定程度的降解作用。本研究通過分離、鑒定發(fā)酵肉制品中的有益葡萄球菌，并對(duì)其蛋白降解能力初探，篩選出具有一定肌肉蛋白降解能力的葡萄球菌，后期將優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)一步探究上述菌種的發(fā)酵能力，以期篩選出可作為肉制品發(fā)酵劑的優(yōu)質(zhì)菌株。