噴霧冷凍干燥技術(shù)制備乳雙歧桿菌Probio-M8微膠囊制劑

徐鵬飛，王昊乾，鄭新飛，郭 帥，包秋華，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

益生菌是一種活的微生物，以適當(dāng)水平使用時(shí)，會(huì)給宿主帶來(lái)益處[1]。隨著微生物相關(guān)研究技術(shù)的成熟，對(duì)雙歧桿菌的研究也更加深入，并將雙歧桿菌作為有益微生物用于食品中。大量研究表明，雙歧桿菌因?qū)θ梭w健康的重要影響而被視為重要的腸道益生菌之一，其能夠在人體腸道內(nèi)定植[2]。雙歧桿菌在現(xiàn)代食品及食品添加劑中被廣泛應(yīng)用，具有調(diào)整腸道菌群，增強(qiáng)免疫功能[3]，促進(jìn)消化吸收，緩解便秘[4]和改善神經(jīng)調(diào)節(jié)[5]等益生功能。乳雙歧桿菌Probio-M8 是分離自健康婦女母乳中的優(yōu)良乳源益生菌，具有改善免疫應(yīng)答功能[6]與較好的耐酸耐膽鹽等特性，在功能性食品和醫(yī)療行業(yè)具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

微生物在加工、貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中的存活率和穩(wěn)定性是影響其產(chǎn)品品質(zhì)的主要因素[7]。雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧的微生物，在生產(chǎn)利用的每個(gè)環(huán)節(jié)都可能受到氧化損傷。微膠囊化是生產(chǎn)菌制品工藝中最常用的方法[8]，可使敏感細(xì)菌避免高溫[9]、高壓，氧氣損傷，酸性環(huán)境，冷凍過(guò)程以及通過(guò)胃腸道的影響[10-11]。噴霧干燥和冷凍干燥技術(shù)的出現(xiàn)為益生菌用于食品及醫(yī)療行業(yè)提供了有效的生產(chǎn)方式。目前大部分雙歧桿菌制品的生產(chǎn)都是利用冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)的，在冷凍干燥過(guò)程中不可避免地造成部分雙歧桿菌損傷甚至死亡。噴霧冷凍干燥（Spray-freeze-drying，SFD）是一種新型的干燥方式，結(jié)合了噴霧干燥及冷凍干燥的優(yōu)點(diǎn)[12]，可以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品，在產(chǎn)品品質(zhì)、結(jié)構(gòu)、生物活性及化合物保有率等方面，噴霧冷凍干燥技術(shù)比其它干燥技術(shù)更具優(yōu)勢(shì)[13-14]。

本研究采用噴霧冷凍干燥技術(shù)制備微膠囊，以乳雙歧桿菌Probio-M8 干燥后的存活率、水分含量和水分活度為指標(biāo)，進(jìn)行噴霧冷凍干燥工藝優(yōu)化，篩選適合乳雙歧桿菌Probio-M8 的噴霧冷凍干燥工藝條件，研究膠囊粉末形態(tài)特征、干燥前、后脂肪酸變化及胃、腸液耐受能力，旨在為雙歧桿菌Probio-M8 工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Probio-M8（Bifidobacterium animalis subsp.lactis Probio-M8，Bifidobacterium lactis Probio-M8），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌資源庫(kù)（Lactic Acid Bacteria Collection Center，LABCC）。

脫脂乳、改良MRS 培養(yǎng)基（MRS＋0.5% L-半胱氨酸鹽酸鹽），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯仿（分析純）、甲醇（分析純）、甲醇鈉（分析純）、正己烷（分析純）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽，天津市匯杭化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀（Technologies 6850），安捷倫科技有限公司；智能水分活度測(cè)量?jī)x（HD-3A 型），無(wú)錫市華科儀器儀表有限責(zé)任公司；掃描電鏡（TM4000PLUS），日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5424R 型），德國(guó)Eppendorf AG；離心機(jī)（DL-6M 型），湖南湘儀試驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；噴霧冷凍干燥器（YC-3000），上海雅程設(shè)備有限責(zé)任公司；智能安全型超凈工作臺(tái)（ZHJH-C 型），上海智城分析儀器有限公司；厭氧工作站（DG250），英國(guó)DWS 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及增殖培養(yǎng) 將冷凍保存（-80℃） 的乳雙歧桿菌Probio-M8 菌種接種于改良的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化完成后，用移液槍以2%（體積分?jǐn)?shù)） 的比例接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，按5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（800 mL）中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.3.2 菌懸液制備 培養(yǎng)完成后的增殖培養(yǎng)液離心15 min（4 ℃，4 000 r/min），棄上清，取沉淀，用無(wú)菌磷酸緩沖液（PBS）洗滌并重新懸浮，上述操作重復(fù)3 次。以10%脫脂乳溶液復(fù)溶至原體積，充分混勻后噴霧冷凍干燥制備微膠囊。

1.3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化因素的最佳水平 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分析，利用Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)3 因素3 水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析。

1.3.4 活菌計(jì)數(shù)及存活率計(jì)算 準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g 噴霧干燥后收集的粉末，使用稀釋平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。選取3 個(gè)稀釋梯度的菌液1 mL 打入平板，傾入改良MRS 瓊脂培養(yǎng)基，混勻后37 ℃倒置培養(yǎng)72 h。記錄培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)量（CFU），菌落數(shù)以CFU/g 表示。菌體存活率計(jì)算公式：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface test

式中，N——干燥后樣品單位體積的活菌數(shù)（CFU/g）；N0——干燥前樣品單位體積活菌數(shù)（CFU/g）。

1.3.5 水分含量及水分活度測(cè)定 選取水分含量測(cè)定儀測(cè)定樣品的水分含量。稱(chēng)取樣品3.00 g，測(cè)定，做3 次平行。選取智能水分活度儀測(cè)量樣品的水分活度，取適量脫脂乳均勻鋪平托盤(pán)，測(cè)定并預(yù)熱。稱(chēng)取適量樣品，均勻鋪平托盤(pán)，平行測(cè)定3 次。

1.3.6 脂肪酸甲酯化提取及含量測(cè)定 脂肪酸提取采用Bligh&Dyer 法[15]。將菌體復(fù)溶，離心，用無(wú)菌磷酸緩沖液（PBS）洗滌2 次，稱(chēng)取0.5 g 菌體，加入1.9 mL 氯仿-甲醇（體積比1∶2）溶液，振蕩15 min，加入0.625 mL 氯仿，加入0.625 mL 去離子水，振蕩15 min，4 ℃，5 000×g 離心10 min，吸取下層相，用氮?dú)獯蹈?，加? mL 甲醇鈉-甲醇溶液，置冰中1 min，振蕩5 min，加600 μL 正己烷，振蕩5 min，4 ℃，5 000×g 離心5 min，取上層相，置氣相瓶中，進(jìn)行氣-質(zhì)譜分析。

脂肪酸含量測(cè)定采用GC/MS 法。色譜條件：氣相色譜條件：PEG 毛細(xì)管填充柱（30 m×0.22 mm 柱內(nèi)徑，0.25 μm 膜厚，Restek）；載氣：氦氣；流速：29.6 mL/min；總流量：0.5 mL/min；柱壓：63.4 kPa；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；柱溫升溫程序：起始溫度100 ℃，保持1 min，隨后以4 ℃/min 速率增至250 ℃并在250 ℃保持5 min。計(jì)算脂肪酸各峰的峰面積、保留時(shí)間及質(zhì)譜范圍，根據(jù)標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì)（37 種sigma 脂肪酸和C19cyc11的標(biāo)樣），對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

脂肪酸含量采用歸一化法，所有組分出峰之和按100%計(jì)算，各脂肪酸相對(duì)含量為該脂肪酸峰面積與總體脂肪酸峰面積和的比值。

1.3.7 形態(tài)觀(guān)察 使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀(guān)察微膠囊化樣品的形態(tài)特征。將樣品粉末安裝在樣品架上，鍍金，在15 kV 和真空下放大500 倍觀(guān)察。

1.3.8 胃、腸液耐受能力 評(píng)估膠囊化粉末在胃腸道條件耐受性，配制pH 2.5 的滅菌磷酸緩沖液，加入除菌的胃蛋白酶制成模擬人工胃液；配制pH 8.0 的滅菌磷酸緩沖液，加入除菌的胰蛋白酶和1.8%膽鹽制成模擬人工胰液。

將收集膠囊化粉末加入5.0 mL 磷酸緩沖液，混勻，作為原菌液，稀釋?zhuān)?jì)數(shù)，作為0 h 的數(shù)值。取原菌液0.5 mL 置4.5 mL 人工胃液試管中，37℃厭氧培養(yǎng)3 h，計(jì)數(shù)。取3 h 培養(yǎng)的0.5 mL 菌液置4.5 mL 腸液試管中，37 ℃厭氧培養(yǎng)4 h 和8 h，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 SFD 工藝條件對(duì)微膠囊品質(zhì)的影響

在干燥過(guò)程中，細(xì)菌受到很多干燥壓力，即熱、氧化和脫水等。菌體細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、核糖體和DNA 在熱沖擊下受到影響，導(dǎo)致細(xì)菌活力喪失[16]。干燥熱的沖擊會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌膜和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能完整性發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化，這些基本功能和結(jié)構(gòu)的保存對(duì)于細(xì)菌的生存及其功能的保持至關(guān)重要。此外，殘留水分含量應(yīng)足夠低，以防止在儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)品變質(zhì)。益生菌粉的水分含量太低也會(huì)造成傷害。水分含量低于2%會(huì)增加細(xì)菌細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸氧化的風(fēng)險(xiǎn)，并破壞脂肪酸周?chē)乃蠁挝籟17]，影響細(xì)菌活力。

2.1.1 干燥溫度對(duì)Probio-M8 微膠囊品質(zhì)的影響在進(jìn)料速度15 mL/min，噴嘴直徑1.0 mm 條件下噴霧冷凍干燥，測(cè)定乳雙歧桿菌M8 微膠囊品質(zhì)，研究干燥溫度對(duì)微膠囊品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在噴霧冷凍干燥過(guò)程中，不同干燥溫度的菌株存活率存在差異，40 ℃時(shí)最高，存活率為72.92%。溫度過(guò)低時(shí)干燥所需能量不足，隨干燥時(shí)間延長(zhǎng)，菌體脫水時(shí)間逐漸增加，菌體受損，進(jìn)而導(dǎo)致死亡。溫度過(guò)高，超出菌體生長(zhǎng)最適溫度，破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致存活率下降。隨著溫度升高，水分含量和水分活度下降，而水分含量都保持在2%以上，在此溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞膜不飽和脂肪酸被氧化的風(fēng)險(xiǎn)降低，同時(shí)說(shuō)明菌體的水結(jié)合能力也在變化，并且低水分含量和低水分活度在微膠囊后續(xù)貯藏過(guò)程中起積極作用[18]。

圖1 干燥溫度對(duì)雙歧桿菌M8 微膠囊品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of drying temperatures on the quality of Bifidobacterium M8 microcapsules

2.1.2 進(jìn)料速度對(duì)Probio-M8 微膠囊品質(zhì)的影響制備M8 益生菌懸浮液，在干燥溫度40 ℃，噴嘴直徑1.0 mm 條件下噴霧冷凍干燥，測(cè)定M8 微膠囊的品質(zhì)，研究進(jìn)料速度對(duì)微膠囊品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，不同的進(jìn)料速度對(duì)于菌體存活率及微膠囊的水分含量及水分活度影響不明顯。這是因?yàn)樗眉?xì)菌屬?lài)?yán)格厭氧菌，進(jìn)料速度緩慢，細(xì)菌懸液暴露在空氣的時(shí)間稍長(zhǎng)，菌體氧化損傷，影響菌體存活率。加快進(jìn)料速度，縮短了噴霧冷凍干燥的時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。

圖2 進(jìn)料速度對(duì)雙歧桿菌M8 微膠囊品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of the feed rates on the quality of Bifidobacterium M8 microcapsules

2.1.3 噴嘴直徑對(duì)Probio-M8 微膠囊品質(zhì)的影響制備M8 益生菌懸浮液，在干燥溫度40 ℃，進(jìn)料速度15 mL/min 條件下噴霧冷凍干燥，測(cè)定M8 微膠囊品質(zhì)，研究進(jìn)料速度對(duì)微膠囊品質(zhì)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同噴嘴直徑對(duì)雙歧桿菌M8 微膠囊品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of different nozzle diameters on the quality of Bifidobacterium M8 microcapsules

由圖3可知，噴嘴直徑1.5 mm 時(shí)菌體存活率最高，達(dá)73.41%。噴嘴直徑對(duì)微膠囊的水分含量和水分活度影響不顯著，微膠囊水分含量均小于5%。在試驗(yàn)噴霧階段，1 mm 噴嘴偶有堵塞現(xiàn)象，影響?zhàn)ざ冗^(guò)大的懸浮液，在選擇噴嘴時(shí)需綜合考量。

益生菌產(chǎn)品須具有較好的益生特性和貯藏穩(wěn)定性，并且益生功能的發(fā)揮是建立在高存活率益生菌的基礎(chǔ)上，因此提高生產(chǎn)過(guò)程中益生菌的存活率是關(guān)鍵。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化噴霧冷凍干燥制備微膠囊工藝

在單因素條件對(duì)微膠囊品質(zhì)影響的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平共17 個(gè)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。用來(lái)估計(jì)誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design results of combined rotation center

采用Design Expert 8.0 軟件響應(yīng)面分析程序進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得3 種工藝參數(shù)與存活率的二次多項(xiàng)式回歸模型方程：

存活率=73.336-2.25A+0.92B-1.91C+0.07AB+0.45AC+1.03BC-7.27A2-2.65B2-4.00C2。

表3 二次多項(xiàng)式模型的系數(shù)及其方差分析Table 3 Coefficients and ANOVA for the developed quadratic polynomial model

對(duì)存活率的二次模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：二次項(xiàng)A2、C2對(duì)噴霧冷凍干燥制備M8 微膠囊的存活率影響極顯著（P<0.01），二次項(xiàng)B2對(duì)噴霧冷凍干燥制備M8 微膠囊的存活率影響顯著（P<0.05）。整體模型為極顯著（P<0.01）；失擬項(xiàng)的P 值為0.1576>0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著，無(wú)失擬因素存在，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)誤差小，回歸方程與實(shí)際情況基本符合，可用該回歸方程代替真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)做預(yù)測(cè)；變異系數(shù)C.V.（Coefficient of variation）為2.40%（小于5%），表明方程有良好的重現(xiàn)性。此方程模型的系數(shù)R2=0.9598，調(diào)整后Radj2=0.9081，說(shuō)明該回歸方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度為90.81%，具有較高的可信度。綜上所述，此回歸方程可用于噴霧冷凍干燥法制備Probio-M8 微膠囊存活率的預(yù)測(cè)。

由圖4a 可知，存活率隨干燥溫度的增加而上升，40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后溫度增加導(dǎo)致存活率下降。隨進(jìn)料速度的增加，存活率變化不顯著，而干燥溫度起積極作用，二者對(duì)提高存活率有交互作用。圖4b 顯示干燥溫度與噴嘴直徑對(duì)存活率的交互影響，兩者的增加對(duì)提高存活率有促進(jìn)作用，達(dá)到峰值后，兩者的增加導(dǎo)致存活率下降。由圖4c 可知，進(jìn)料速度與噴嘴直徑交互作用曲面的曲率無(wú)明顯差別，兩者之間交互作用不顯著。

圖4 因素交互作用響應(yīng)面圖及相應(yīng)的等高線(xiàn)圖Fig.4 Response surface plot and contour map of interactive effects of various factors

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果：干燥溫度40 ℃，進(jìn)料速度15 mL/min，噴嘴直徑1.5 mm，此時(shí)預(yù)測(cè)存活率為73.79%。為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，得到平均存活率為73.21%，與理論預(yù)測(cè)值相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 工藝條件對(duì)顆粒形態(tài)的影響

噴霧冷凍干燥法制備的產(chǎn)品形態(tài)對(duì)其應(yīng)用有重要的影響，例如：品質(zhì)、流動(dòng)性、溶解性、貯藏時(shí)間等。使用掃描電鏡（SEM）對(duì)不同工藝條件制備的微膠囊粉末進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察。圖5a～5i 顯示，總體形態(tài)都存在近似球狀和不規(guī)則形狀的顆粒及聚集顆粒，而且顆粒表面存在機(jī)械裂縫，不同工藝條件產(chǎn)生的形狀存在差異。由圖5a、5b、5c 可知，不同干燥溫度導(dǎo)致顆粒狀態(tài)差別較大，圖5a 顯示：30℃時(shí)干燥能量低，干燥時(shí)間大大增加，顆粒皺縮嚴(yán)重，多顆粒聚集、黏附在一起，類(lèi)球體結(jié)構(gòu)損傷大，不能較好地包裹菌體；圖5c 顯示存在多種顆粒形態(tài)，部分顆粒皺縮聚集，其余顆粒表面存在塌陷與氣孔，相比圖5b 所示，40 ℃時(shí)產(chǎn)生的顆粒形態(tài)較為完整。不同噴嘴直徑產(chǎn)生的顆粒大小不同，如圖5d、5e、5f 所示，在相同干燥溫度下，使用1.5 mm的噴嘴制備微膠囊顆粒比其它2 種口徑的噴嘴更為完整，用其它噴嘴直徑制備的顆粒表面存在嚴(yán)重的皺縮與塌陷。圖5g、5h、5i 所示，不同進(jìn)料速度對(duì)顆粒形成的影響不明顯。

圖5 不同工藝條件下SEM 觀(guān)察的微膠囊顆粒形態(tài)Fig.5 Morphology of microcapsule particles observed by SEM under different process conditions

噴霧冷凍干燥產(chǎn)品的形態(tài)受工藝參數(shù)與保護(hù)性載體配方的影響[19]。有研究表明噴霧冷凍干燥制備的微膠囊形態(tài)大多為球形，顆粒形態(tài)基本一致，部分形狀不規(guī)則是由制備過(guò)程中多種因素相互作用產(chǎn)生的[20-21]。顆粒的大小與形態(tài)取決于載體溶液配方與工藝參數(shù)[21]。顆粒的形狀受多種載體溶液復(fù)合影響，特定的脫脂乳濃度、糖類(lèi)、溶液濃度帶來(lái)不規(guī)則的顆粒形狀，在工藝參數(shù)的影響下，顆粒表面出現(xiàn)變化及聚集現(xiàn)象[22-23]。這與許多研究結(jié)果一致，在冷凍干燥過(guò)程中大量的顆粒會(huì)聚集成團(tuán)[24]。此外，載體溶液的組成影響溶液的性能、黏度、分散性等，最終導(dǎo)致顆粒形態(tài)的不同[23]。

2.4 干燥前、后脂肪酸的變化

細(xì)胞膜脂肪酸組成對(duì)細(xì)菌抵抗外界不良因素有重要影響。外界環(huán)境變化時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜首先受到?jīng)_擊，細(xì)菌作出反應(yīng)，細(xì)胞膜脂肪酸組成發(fā)生改變，不飽和脂肪酸增加，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性[25]。在噴霧冷凍干燥過(guò)程中，細(xì)胞膜的流動(dòng)性與細(xì)胞膜中UFA/SFA（不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值）的比值有著緊密的聯(lián)系。表4列出干燥前、后菌體細(xì)胞膜脂肪酸組分的變化。

從表4數(shù)據(jù)可知，Probio-M8 細(xì)胞膜脂肪酸成分主要由C12：0（月桂酸）、C14：0（肉豆蔻酸）、C16：0（棕櫚酸）、C16：1（棕櫚油酸）、C18：0（硬脂酸）、C18：1w9c（油酸）、C18：3（亞麻酸）、C19cyc11（環(huán)丙烷脂肪酸）8 種脂肪酸組成，它們占總脂肪酸含量的87%以上，說(shuō)明這8 種脂肪酸是M8 主要脂肪酸。此外，還有部分脂肪酸被檢出，因含量較低且不能穩(wěn)定，檢測(cè)出而未做比較分析。干燥前、后，飽和脂肪酸含量下降7.42%（P<0.05），不飽和脂肪酸含量上升10.53%（P<0.05）。其中，不飽和脂肪酸C16：1、C18：1w9c、C19cyc11在干燥后顯著上升（P<0.05）。有研究表明，菌體所處環(huán)境變化，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，菌體產(chǎn)生環(huán)丙烷脂肪酸，影響細(xì)胞膜的彈性和伸縮性，增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞應(yīng)激能力，與本研究中，在干燥后C19cyc11（環(huán)丙烷脂肪酸）含量上升相符合[26-27]。干燥后UFA/SFA 的比值提高了0.37，可能是菌體為維持正常的生理代謝，細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性改變，提高自身的存活率。

表4 噴霧冷凍干燥前、后菌體膜脂肪酸相對(duì)含量Table 4 Relative content of fatty acids in the bacterial cell membrane before and after spray freeze drying

2.5 微膠囊胃、腸液耐受能力分析

為使益生菌充分發(fā)揮作用，必須確定益生菌可以抵抗胃腸道中低pH、胃蛋白酶和膽鹽等抑菌物質(zhì)，確保益生菌活著進(jìn)入胃腸道并發(fā)揮作用[13]。本試驗(yàn)選用的菌株具有良好的胃、腸液耐受性。

由表5可知，試驗(yàn)組微膠囊在經(jīng)模擬人體胃液3 h 與腸液8 h 消化后，活菌數(shù)保持的數(shù)量級(jí)不變，存活率達(dá)81.99%，與菌懸液對(duì)照組相比，存活率提高1.44%。微膠囊主要在人工胃液階段喪失部分活力，在人工腸液中存活率達(dá)93.93%，保持較好的耐受性。試驗(yàn)表明，Probio-M8 經(jīng)處理，菌體本身具有的優(yōu)良的胃、腸液耐受特性沒(méi)有改變，微膠囊化后耐受性未顯著提高。胃、腸液耐受性的提高可能是保護(hù)性載體的作用，在噴霧冷凍干燥制備過(guò)程中，益生菌被載體包裹，降低進(jìn)入胃腸道過(guò)程中胃酸、膽汁酸等帶來(lái)的侵害作用。有研究表明將殼聚糖摻入制劑中，可以顯著改善保護(hù)作用。在配方中使用腸溶性聚合物可以增強(qiáng)微膠囊技術(shù)對(duì)益生菌的保護(hù)能力。除了增加細(xì)胞的抗性外，這些聚合物還促進(jìn)雙歧桿菌在人體上層腸道更好的釋放，并提高了這些微生物在模擬胃腸道條件下的存活率[28]。

表5 噴霧冷凍干燥制備微膠囊的胃、腸液耐受性Table 5 Tolerance of microencapsulated gastrointestinal fluid prepared by spray freeze drying

3 結(jié)論

噴霧冷凍干燥法制備乳雙歧桿菌Probio-M8微膠囊結(jié)果表明：干燥溫度對(duì)微膠囊品質(zhì)起決定作用，適宜的溫度會(huì)賦予微膠囊高存活率、低水分含量與水分活度，并能基本維持菌體原有結(jié)構(gòu)與基本功能，對(duì)貯藏品質(zhì)與功能產(chǎn)生積極影響。在干燥溫度40 ℃，噴嘴直徑1.5 mm，進(jìn)料速度15 mL/min 條件下，以噴霧冷凍干燥法制備的Probio-M8微膠囊具有較為完整的顆粒形態(tài)及高存活率。噴霧冷凍干燥前、后菌體細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量顯著提高，菌體細(xì)胞做出適應(yīng)性改變，以保持菌體完整性。微膠囊化的益生菌M8 在模擬人工胃、腸液中具有良好的耐受能力，消化處理后存活率達(dá)81.99%。綜上，噴霧冷凍干燥法制備優(yōu)良微膠囊具有工業(yè)化應(yīng)用潛力。