功能調和油改善大鼠血壓、組織脂肪酸和氧化-還原穩(wěn)態(tài)的研究

楊紹軍，劉昌樹，王 賽，叢 洋，呂一品，唐 雪*，周 鵬

（1江南大學食品學院 江蘇無錫 214122 2佳格食品（中國）有限公司 江蘇蘇州 215000）

近年來，我國心血管疾?。–ardiovascular disease，CVD）患病率日益增加，已成為嚴重影響居民健康水平的慢性疾病之一[1]。CVD 是由多種不良因素長期綜合作用引起，主要包括遺傳、高血壓、血脂異常、超重/肥胖和不健康的膳食等[2]。研究發(fā)現，由長期高脂膳食引起的肥胖常常伴隨機體血脂異常、氧化應激和炎性反應，是CVD 患病風險增加的主要因素[3]，其中膳食脂肪酸組成及其比例具有十分重要的影響[4]。居民日常攝入的植物油脂肪酸成分過于單一，不能滿足營養(yǎng)均衡的要求，大量研究證實，過量攝入高比例飽和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）和含亞油酸（Linoleic acid，LA）的油脂會誘發(fā)機體炎癥反應、高血脂癥及動脈粥樣硬化等心血管疾病[5-7]。而α-亞油酸（α-Linolenic acid，ALA）具有抗炎、抗氧化的效果，可通過降低血漿LDL-C 水平，提高HDL-C 水平，減少心血管系統氧化應激反應來降低CVD 患病風險[8-10]。人群調查和動物研究發(fā)現，提高膳食油脂ALA 比例，降低LA 比例，可顯著改善血壓和血脂，維護心血管系統氧化-還原穩(wěn)態(tài)[11-12]。目前沒有一種天然的植物油能夠滿足營養(yǎng)學家所推薦的脂肪酸均衡要求[13]。本研究前期通過混合不同比例的植物油（芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄欖油），優(yōu)化ALA/LA 比例，研發(fā)出一款功能調和油。以大鼠為研究對象，通過比較3 種食用油（豬油、大豆油和功能調和油） 在不同能量水平下對血漿和組織脂肪酸組成、血脂、血壓及氧化還原穩(wěn)態(tài)的影響，明確功能調和油對心血管系統的調節(jié)作用，為相關產品的研發(fā)、優(yōu)化及市場推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油和大豆油在當地超市購買，功能調和油為佳格投資有限公司提供（專利申請?zhí)?01910414467.3）。過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒，南京建城生物工程研究所。

1.2 主要儀器與設備

5804R 臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific 公司；R686VLT 型超低溫冰箱，美國INVETRO 公司；BioTek Epoch 全波長酶標儀，美國Biotek 公司；Eppendorf 5430R 微量移液槍，德國Eppendorf 公司；M5 型酶標儀，美國Molecular Devices 公司；超凈臺，蘇州儀器四廠；Mettle Toledo AB204-N 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；BP-98A/B 鼠尾無創(chuàng)血壓儀，日本軟隆公司。

1.3 實驗動物及分組

90 只SPF 級Wistar 雄性大鼠【7 周齡，體重（183.29±11.32）g】，上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于江南大學實驗動物中心。實驗倫理審核編號：JN.No20180315W0900707[39]。采用12 h 光照（8：00-20：00），相對濕度40%～70%，相對溫度22 ～26℃，所有試驗操作都符合江南大學實驗動物福利、實驗動物護理和使用指南的指導原則。

預飼養(yǎng)1 周，隨機分組為豬油組（Lard oil，LO）、大豆油組（Soybean oil，SO）、功能調和油組（Blended oil，BO），每組分為低、中、高3 個能量水平。低脂組的6.7%能量來源于脂肪，相當于中國居民膳食指南推薦量25 g/d；中脂組的10.9%能量來源于脂肪，相當于中國居民實際攝入量41.4 g/d，高脂組的48.1%能量來源于脂肪，相當于過量攝入200 g/d。

功能調和油由芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄欖油按一定比例調和而成。3 種食用油的脂肪酸組成及比例如表2所示，豬油含42.21%OA（Oleic acid，OA）、13.91% LA、0.6% ALA，ALA/LA比值為1∶24；大豆油含30.80%OA、40.55%LA、4.36%ALA，ALA/LA 比值為1∶9；功能調和油含50.93%OA、31.73%LA、α-亞油酸5.41%ALA，ALA/LA 比值為1∶6。

表1 飼料配方Table 1 Nutrient composition of rat diets

表2 樣品油脂肪酸組成（%）Table 2 The fatty acid compositions of the oil samples（%）

（續(xù)表2）

1.4 處死動物及生化分析

經過12 周飼喂后，處死前12 h 禁食、不禁水，處死時注射1%的戊巴比妥溶液（0.6 mL/100 g），采用腹主動脈取血法，將血液收集到干凈的試管中，在4 ℃下3 000×g 離心10 min 分離出血漿，然后保存在-80 ℃的溫度下進行下一步分析。將新鮮肝臟或心臟組織（100 mg）用900 μL PBS 勻漿，將勻漿物以3 000 r/min 離心15 min 后取上清液備用。

1.5 脂肪酸成分分析

1.5.1 總脂肪酸的提取 取肝臟30 mg，加入0.5 mL 生理鹽水，0.3 mg 二十一烷酸甲酯（C21：0）內標于離心管中，低溫冰水浴內充分勻漿后轉移至玻璃管，加入3 mL 預混好的提取試劑甲醇-三氯甲烷（體積比1∶2），漩渦振蕩30 s 混勻，室溫下振蕩1 h，充分提取置于離心機中3 000 r/min 離心10 min，移液器移取下層于新的離心管中，重復提取，合并2 次提取液，氮氣吹干。

1.5.2 皂化甲酯化 加2 mL 0.5 mol/L 氫氧化鉀-甲醇，65 ℃下振蕩30 min 后，加入2 mL 三氟化硼-甲醇（體積比1∶3），70 ℃水浴5 min，依次加入2 mL 正己烷、飽和氯化鈉溶液，充分振蕩，靜置分層，取上層有機相至離心管中，加入無水硫酸鈉，10 000 r/min 離心3 min，取上層1.5 mL 左右過0.45 μm 有機濾膜，轉移至氣相樣品瓶中，準備上機進GC 測定分析，根據脂肪酸標品定性，樣品所產生的峰面積用歸一化法計算脂肪酸相對百分比含量。食用油可直接取200 μL 進行皂化甲酯化，脂肪取30 mg 勻漿后離心，取上清再進行皂化甲酯化。

1.6 血壓測量

采用無創(chuàng)尾套法測壓，將大鼠置于束縛器中，用40 ℃恒溫水浸泡鼠尾30 min，使鼠尾部血管組織充分擴張，擦干鼠尾，將其穿過加壓裝置并固定在鼠尾根部向下1 cm 處，啟動充氣按鈕，可以檢測收縮壓（Systolic blood pressure，SBP）、舒 張壓（Diastolic blood pressure，DBP）、平 均 壓（Mean blood pressure，MBP）、心率（HR）。

1.7 統計學處理

2 結果與分析

2.1 功能調和油對動物體重及臟器指數的影響

如圖1所示，低脂日糧飼喂大鼠12 周，LO、SO 和BO 組大鼠體重在各個時間點均無顯著性差異（P>0.05）。中脂日糧飼喂4 周、高脂日糧飼喂3 周后，豬油組和大豆油組的體重均顯著高于功能調和油組（P<0.05），3 組體重趨勢為：LO 組>SO組>BO 組。此外，隨著能量水平的提高，各組肝臟和脂肪質量均呈上升趨勢，而BO 高脂組的肝臟、脂肪質量顯著低于LO 和SO 高脂組（P<0.05），維持了較低的體脂率（P<0.05）（表2）。上述結果表明，與LO 和SO 相比，BO 可有效降低高脂日糧誘導肥胖大鼠的體重及體脂率，緩解肥胖的發(fā)生發(fā)展。

圖1 大鼠體重變化（±s，n=10）Fig.1 Body weight of rats（±s，n=10）

表3 大鼠生長性能和臟器指數Table 3 Growth performance and viscera index of rats

2.2 功能調和油對血脂和血壓的影響

如圖2所示，隨著日糧中油脂供能比例的提高，各組血漿甘油三酯（Triglyceride，TG）、游離脂肪酸（Free fatty acid，FFA）水平以及收縮壓、舒張壓和平均壓均有一定程度的上升，其中以LO 組最為顯著（P<0.05）。在高脂日糧條件下，與LO 組相比，大鼠飼喂BO日糧可顯著降低血漿TG 水平，維持較好的收縮壓、舒張壓和平均壓，表明BO 具有調節(jié)肥胖大鼠血脂及血壓作用。此外，在同一能量水平下，各組血漿總膽固醇（Total cholesterol，TC）和FFA 水平均無顯著性差異（P>0.05）。

圖2 大鼠血漿生化指標和血壓Fig.2 The serum lipid parameters and blood pressure of rats

2.3 血漿及組織脂肪酸組成

如表4所示，對3 種油脂高脂組血漿、肝臟和脂肪組織的脂肪酸組成進行分析發(fā)現，隨著飼料中α-亞麻酸比例的提高，BO 組血漿、肝臟和脂肪組織中ALA 的比例相較于LO 組具有明顯的提高（P<0.05）。在肝臟和脂肪組織，LO 組飽和脂肪酸所占比例顯著高于SO 組和BO 組（P<0.05）。通過計算ALA 和LA 的含量以及比值，LO 組、SO組和BO 組血漿ALA/LA 比例依次為1∶41，1∶26，1∶20，肝臟ALA/LA 比例為1∶90.5，1∶29，1∶24，脂肪組織ALA/LA 比例分別為1∶47，1∶21，1∶11。

表4 高脂組大鼠血漿、肝臟和脂肪脂肪酸組成分析Table 4 The fatty acid compositions of plasma，liver and adipose tissue lipids in high fat-fed rats

（續(xù)表4）

2.4 血漿和心臟組織氧化還原相關指標

抗氧化防御系統是保護組織免受自由基和活性氧（ROS） 氧化損害并預防慢性疾病的重要屏障。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和過氧化氫酶（CAT）可以抑制和清除ROS，平衡氧化還原穩(wěn)態(tài)。丙二醛（MDA）是衡量脂質過氧化產物的重要指標。如圖3所示，隨著飼料中脂肪能量占比升高，大鼠飼喂LO日糧使得血漿和心臟總抗氧化能力（T-AOC）和GSH-PX 活性進一步降低，MDA 和ROS 水平提高，引起組織氧化損傷。在高脂日糧條件下，與LO 組相比，SO 組和BO 組的血漿和心臟氧化還原穩(wěn)態(tài)相關指標有一定程度的改善，其中BO 可顯著提高血漿TAOC 水平、心臟GSH-PX 活性（P<0.05），降低血ROS 和心臟ROS、MDA 水平（P<0.05）。

圖3 血漿和心臟組織氧化還原相關指標Fig.3 Plasma and heart tissue redox related indicators

3 討論

心血管疾病和膳食油脂攝入有著密不可分的聯系。當機體攝入過多的脂肪特別是飽和脂肪酸，會引起血脂代謝異常，血漿TG 水平偏高，肝臟和脂肪組織脂代謝紊亂，最終導致動脈粥樣硬化及心血管系統疾病[14]。而不飽和脂肪酸則具有改善高血脂、高膽固醇和胰島素抵抗的功效。本研究所采用的功能調和油（BO）是由芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄欖油按一定比例調和而成，包含9.1%的SFA、37.13%的PUFA、53.77%的MUFA，其中ALA 和LA 比例為1∶6，α-亞麻酸所占比例明顯高于豬油和大豆油。研究結果顯示，高比例BO日糧飼喂大鼠12 周后，改變了血漿、肝臟和脂肪組織的脂肪酸組成，使ALA/LA 比例分別達到1∶20，1∶24，1∶11，相較于豬油（LO）組和大豆油（SO）組有顯著提高。上述結果表明，提高膳食油脂ALA 含量，可增加血漿和組織ALA 水平。

攝入一定量的不飽和脂肪酸可顯著降低肥胖發(fā)生率，維持正常血脂水平和血壓，其作用機制涉及脂肪的合成與分解、腎素-血管緊張系統等多個方面[15]。本研究結果顯示，在中脂和高脂日糧條件下，BO 可顯著降低大鼠的體重，抵抗由高脂日糧攝入引起的肝臟質量和體脂比率上升，使肥胖大鼠維持較好的血脂和血壓，降低動脈硬化指數。這與Engler 等[16]報道一致。大量動物實驗證明，食用高比例的不飽和脂肪酸油會顯著降低TG 水平，一方面可能與抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸氧化，降低?；D移酶活性及增強脂肪酸向磷脂的轉化能力有關，另一方面可能與增強血脂的分解和清除有關[17]。腎素-血管緊張素系統在ALA 的降壓過程中起到一定作用，血管緊張素轉換酶（ACE）的活性降低，血管緊張素II 和TGF-β 的表達減少，同時副交感神經系統被eNO 激活[18-19]，自發(fā)性高血壓大鼠的血壓得以降低[20-21]。本研究發(fā)現，與LO組和SO 組相比，BO 可顯著降低肥胖大鼠的收縮壓、舒張壓和平均壓，這可能與BO 中功能成分降低血脂水平及調節(jié)腎素-血管緊張素系統有關。

機體發(fā)生氧化應激反應，會生成過量ROS，不但會降低一氧化氮酶的利用率，而且會氧化損傷血管內皮細胞，導致內皮功能障礙和心血管疾病[22-24]。本研究通過測定氧化還原相關指標，發(fā)現BO 可顯著降低高脂日糧飼喂大鼠的血漿和心臟組織ROS 水平和MDA 含量，在一定程度上提高T-AOC、GSH-PX 和CAT 的抗氧化酶活性。這與之前研究，添加ALA 飼喂的小鼠可降低血脂水平，提高抗氧化能力的結果一致[25]。PUFA 是細胞膜中磷脂膜的主要成分，氧自由基攻擊磷脂膜引起脂質過氧化?；ㄉ南┧幔ˋrochidonic acid，AA）氧化生成8-異前列腺素F2α（8-iso-ProstaglandinF2alpha，8-iso-PGF2α） 會促使單核細胞黏附微血管內皮細胞，導致內皮受損，改變細胞膜流動性，加重機體氧化應激[26-27]。而攝入一定劑量的ALA 會減少細胞膜中AA 的含量，改變細胞膜中脂肪酸的組成，從而減少8-iso-PGF2α 的產生[28-29]。ALA 中大量的不飽和雙鍵會導致體內脂質過氧化，超過機體代謝程度?？梢?，攝入合適比例的ALA 和LA，對心血管氧化還原系統具有重要影響。

膳食脂肪酸的構成比，尤其是ALA 和AA 的比例，對脂代謝和抗氧化調節(jié)的影響不同。對n-3PUFA 和n-6PUFA 的相關研究顯示，推薦ALA/LA 比值范圍為1∶4～1∶10。ALA 和LA 結構十分相似，可在體內相互轉化和代謝，而分子機制尚不清楚。本研究發(fā)現，含高飽和脂肪酸的LO，其中ALA和LA 的含量較少，大量攝入后引起大鼠體重增加，血脂血壓異常，顯著降低了心臟組織抗氧化能力。BO 和SO 的飽和脂肪酸占比較少，雖然含有近似相同水平ALA，但由于SO 含有較多LA，一定程度上限制了ALA 的功效。雖然BO 組和SO組的ALA/LA 比例在推薦范圍之內，但相較于SO，BO 具有更好的心血管保護作用，即在高脂膳食模式下，ALA/LA 比例為1∶6 時可明顯降低體重、體脂比率，維持正常的血脂血壓和氧化還原穩(wěn)態(tài)。

4 結論

本文探究了不同能量水平下功能調和油對大鼠心血管系統的影響。結果表明，與豬油和大豆油相比，長期飼喂功能調和油可更好地降低肥胖大鼠體重、體脂率，增加血漿、肝臟和脂肪組織ALA/LA 比值，通過改善血脂水平和血漿、心臟氧化還原穩(wěn)態(tài)，使大鼠維持了較好的血壓狀態(tài)。本研究結果可為功能調和油的研發(fā)、優(yōu)化及市場推廣提供有價值的理論依據。