綠豆皮對高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠糖脂代謝的改善作用

侯殿志，陳博睿，王 晗，陳昶宇，沈 群*

（1北京工商大學食品與健康學院 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100048 2中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室 北京 100083）

糖尿病是一種復雜的代謝綜合征，其特征是持續(xù)的高血糖和異常的脂質代謝[1]。如果得不到嚴格的控制，最終就會引發(fā)嚴重的并發(fā)癥，例如：動脈粥樣硬化、冠心病、中風和腎功能衰竭[2]。目前，市場上的一些藥物對糖尿病患者普遍具有局限性和不耐受性，并且長期服用可能會引發(fā)多種副作用[3]。除了使用藥物外，飲食管理和體力活動被認為是控制血糖，改善胰島細胞敏感性和降低膽固醇水平的首要選擇[4]。其中，膳食干預因在治療和管理糖尿病方面潛在的健康益處而受到廣泛的重視。近年來，豆類豐富的營養(yǎng)物質和低能量密度，在糖尿病的預防和治療中引發(fā)研究者濃厚的興趣[5]。

綠豆（Vigna radiata L.）是亞洲國家，特別是中國大多數(shù)家庭經(jīng)常食用的一種豆類。綠豆種子主要由胚（子葉和胚軸）和種皮組成，根據(jù)之前的研究，大多數(shù)酚類物質和膳食纖維被證明存在于種皮中[6]。本實驗室研究人員先前開展的動物實驗，通過比較全綠豆和去皮綠豆對高脂喂養(yǎng)誘導的肥胖小鼠糖脂代謝的研究表明，相比去皮綠豆，全綠豆可有效緩解肥胖小鼠的體重，并且顯著的改善肥胖小鼠的糖脂代謝和腸道菌群紊亂[7]。在相同添加量的條件下，通過比較全綠豆和去皮綠豆干預效果，說明綠豆皮在其中發(fā)揮著重要的作用。另外，除諸多研究表明膳食纖維在糖尿病的治療中發(fā)揮著巨大的作用外[8-9]，富含多酚的綠豆皮提取物通過體內外實驗也證實其對糖脂代謝具有顯著的健康益處[10-11]。然而，去除豆皮是生產(chǎn)豆類淀粉、分離豆類蛋白以及改善一些特殊食品風味的必要工序[12]。如果在確定綠豆皮對糖脂代謝改善作用的基礎上，將其應用到新穎、營養(yǎng)和健康功能食品的開發(fā)上，就會增加豆類的附加值，并避免原料浪費。目前，一些豆類種皮，例如：豌豆種皮和羽扇豆種皮，已被用于高纖維面包和肉制品的加工[13-14]。

本研究通過評估綠豆種皮對高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的生理、組織學和生化參數(shù)的變化，確定綠豆種皮對糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂的改善作用，旨在為綠豆皮健康價值的開發(fā)及其在功能食品中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

明綠豆，山西東方物華農業(yè)科技有限責任公司。

4 周齡雄性C57/BL6J 小鼠，體重（16±2）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司。高脂飼料（D12492，60%的能量來自脂肪，提供5.24 kcal/g能量） 和低脂飼料（D12450J，10%的能量來自脂肪，提供3.85 kcal/g 能量），美國Research Diets 公司。

鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma 公司；無菌生理鹽水，上海源葉生物科技有限公司；血糖、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血糖、谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）檢測標準試劑，北京周天華楓醫(yī)療儀器有限公司；胰島素超敏試劑盒，美國ALPCO 公司；糖化血清蛋白（GSP）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

高速多功能食品粉碎機，南京科益機械設備有限公司；超低溫冰箱，青島海爾特種冰柜有限公司；低速離心機，美國Eppendorf 公司。電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；拜耳血糖試紙及血糖儀，上海健臻醫(yī)療科技有限責任公司；血生化儀，日立3100 自動血生化儀；酶標儀，美國Thermo Fisher科技公司。

1.3 方法

1.3.1 綠豆皮的制備及特種飼料加工 將綠豆種子于室溫下蒸餾水中浸泡8 h，手動揉搓并收集種皮，然后冷凍干燥。使用研磨機將干燥的綠豆種皮研磨成細粉（80 目），于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

參照高脂飼料配方，將6%的綠豆皮（水分10.27%，灰分2.1%，脂肪0.6%，蛋白質8.01%，膳食纖維79.03%）以等宏量營養(yǎng)素和等熱量的形式配比到高脂飼料中。具體的配比由飼料公司專業(yè)技術人員和本單位研究人員結合專業(yè)知識，參考相關文獻共同商議完成。特種飼料的加工委托常州鼠一鼠二生物科技有限公司完成。

1.3.2 模型建立與分組 將C57/BL6J 小鼠以低脂飼料進行環(huán)境適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機選取8只小鼠作對照實驗組（NC），繼續(xù)以低脂飼料飼養(yǎng)。其余小鼠經(jīng)4 周的純高脂飼料飼養(yǎng)后，經(jīng)隔夜禁食，注射100 mg/kg 的STZ[15]。在第5 周和第6周通過尾靜脈取血測定小鼠的空腹血糖。將2 次空腹血糖水平均不低于11.1 mmol/L 的小鼠視為造模成功的糖尿病小鼠。再根據(jù)空腹血糖水平將其隨機分為模型組（n=8，DC）和干預組（n=8，MBC）。模型組繼續(xù)純高脂飼養(yǎng)，干預組改為含綠豆皮的高脂飼料飼養(yǎng)，連續(xù)干預8 周。整個飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級，溫度控制20～25 ℃，相對濕度45%～65%，12 h 光照交替，4 只小鼠1 籠，可自由取食和取水。每周測定小鼠體重1 次。

1.3.3 口服葡萄糖耐受實驗（OGTT） 參考實驗室前期的研究方法[7]，在實驗結束的最后1 周，6 h禁食后，灌胃小鼠25%葡萄糖溶液（2 g/kg 體重），用血糖儀測定小鼠尾尖0，30，60，90，120 min 時的血糖水平。本研究中，通過計算血糖曲線下面積（AUC）來表征葡萄糖耐受量的變化。

1.3.4 血生化、胰島素及糖化血清蛋白的測定小鼠干預實驗完成后，隔夜禁食，由專業(yè)技術人員對小鼠進行摘眼球取血，收集小鼠血液樣品。待血樣凝固，3 000 r/min 4 ℃離心10 min 得小鼠血清樣品。采用自動血生化儀對小鼠的空腹血糖、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）以及谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）進行檢測。胰島素和糖化血清蛋白的測定按照試劑盒說明書操作步驟進行。

1.3.5 肝組織的病理切片觀察 將麻醉處死后的小鼠進行解剖處理，得到的肝和胰腺組織迅速固定在4%的多聚甲醛中，石蠟包埋，穩(wěn)定后切片，厚度5～7 μm，用蘇木精-伊紅染色后在顯微鏡下觀察胰腺和肝組織病理形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件分析處理和繪圖，采用單因素方差分析及Tukey 事后檢驗，對2 組及2 組以上的數(shù)據(jù)進行比較和分析。實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”（±s）表示，以P ＜0.05 表示差異顯著，以P ＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 綠豆皮對糖尿病小鼠體重的影響

由圖1可知，干預實驗開始后，持續(xù)的高脂飼料飼養(yǎng)使得模型組（DC）小鼠的體重顯著高于對照組（NC）。對于干預組（MBC）小鼠，雖然在1～6周與對照組（NC）相比表現(xiàn)出顯著的差異，但是在第7 周和第8 周無顯著性差異。整個干預階段，干預組（MBC）小鼠的體重與模型組（DC）不存在顯著性差異，體重增加速度相對緩慢，表明綠豆皮在抑制小鼠體重的增加方面有積極的作用。

圖1 綠豆皮對糖尿病小鼠體重的影響（n=8）Fig.1 Effects of mung bean seed-coat on body weight of diabetic mice（n=8）

2.2 綠豆皮對糖尿病小鼠空腹血糖、胰島素和糖化血清蛋白的影響

如圖2a 所示，持續(xù)的高脂飼養(yǎng)以及STZ 誘導致模型小鼠（DC）的空腹血糖顯著高于正常對照組（NC）小鼠。經(jīng)過8 周的干預實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組（DC）小鼠相比，干預組（MBC）小鼠的空腹血糖水平顯著降低。STZ 注射會導致小鼠胰島β 細胞損傷，甚至凋亡，進而出現(xiàn)胰島素分泌不足的現(xiàn)象。由圖2b 可看出經(jīng)STZ 處理，模型組（DC）小鼠和干預組（MBC）小鼠的空腹胰島素分泌量均顯著低于正常對照組（NC）小鼠。然而，綠豆皮的干預卻使糖尿病小鼠的空腹胰島素水平顯著上升。糖化血清蛋白作為糖尿病干預效果的一個評價指標，可有效反映糖尿病小鼠短期內血糖水平的變化。圖2c 顯示，模型組（DC）小鼠的糖化血清蛋白水平顯著高于正常對照組（NC）小鼠，提示模型組小鼠的血糖水平始終處于高水平狀態(tài)。綠豆皮的干預使糖尿病小鼠的糖化血清蛋白水平顯著降低，提示干預組（MBC）小鼠的血糖在短期內相比于模型組處于顯著降低的狀態(tài)，這與空腹血糖水平的變化相一致。

圖2 綠豆皮對糖尿病小鼠空腹血糖（a），胰島素（b）和糖化血清蛋白（c）的影響（n=8）Fig.2 Effects of mung bean seed-coat on fasting blood glucose（a），insulin（b） and glycated serum protein（c） in diabetic mice（n=8）

2.3 綠豆皮對糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

如圖3a 所示，與正常對照組（NC）小鼠相比，模型組（DC）和干預組（MBC）小鼠在給予葡萄糖后血糖濃度迅速上升，并均在給予葡萄糖30 min后升至最大值，隨后緩慢降低。與模型組（DC）小鼠相比，干預組（MBC） 小鼠的血糖濃度在120 min 內各時間點均表現(xiàn)出下降趨勢，并在0 min 和60 min 時顯示出顯著差異。圖3b 的糖耐量曲線下面積（AUC）結果顯示，干預組（MBC）小鼠的AUC顯著低于模型組（DC）小鼠，表明綠豆皮可有效減緩糖尿病小鼠餐后血糖水平的迅速升高。

圖3 綠豆皮對糖尿病小鼠口服糖耐量（a）和糖耐受量曲下面積（b）的影響（n=8）Fig.3 Effects of mung bean seed-coat on oral glucose tolerance（a） and AUC（b） of diabetic mice（n=8）

2.4 綠豆皮對糖尿病小鼠血脂水平的影響

糖尿病由于長期處于高血糖狀態(tài)，往往伴隨著血脂代謝異常。TC、TG、HDL-C 和LDL-C 是評價血脂水平的重要指標。結果顯示，模型組（DC）和干預組（MBC）小鼠的血脂4 項水平均顯著高于正常對照組（NC）。與模型組（DC）相比，綠豆皮的補充顯著降低了糖尿病小鼠的血清TC、TG 和LDL-C 水平。

圖4 綠豆皮對糖尿病小鼠TC（a），TG（b），HDL-C（c）和LDL-C（d）的影響（n=8）Fig.4 Effects of mung bean seed-coat on TC（a），TG（b），HDL-C（c） and LDL-C（d） in diabetic mice（n=8）

2.5 綠豆皮對糖尿病小鼠肝和胰腺組織的影響

由圖5a 可見，正常組（NC）小鼠肝組織的肝小葉結構完整，肝竇無病理性缺損，細胞核形態(tài)正常。然而模型組（DC）小鼠的肝細胞縫隙接連通道變寬、胞質空泡化，肝細胞出現(xiàn)壞死和自溶現(xiàn)象。經(jīng)綠豆皮干預后，糖尿病小鼠的肝組織空泡化數(shù)量明顯減少，肝細胞損傷明顯降低，肝核消失癥狀減弱，肝細胞形態(tài)較完整。小鼠血清中AST 和ALT 的水平也證實了這一點。從圖5c 和5d 可以看出，干預組（MBC）小鼠血清的AST 和ALT 水平顯著低于模型組（DC）小鼠。另外，如圖5b 所示，正常對照組（NC）小鼠的胰島結構保持完整，胰島β 細胞數(shù)量豐富且清晰可見。對于模型組（DC）小鼠，STZ 注射直接導致糖尿病小鼠胰島出現(xiàn)明顯萎縮，胰島細胞嚴重壞死，β 細胞數(shù)量顯著減少。綠豆皮干預使糖尿病小鼠胰島壞死的情況得到明顯減輕，胰島β 細胞損傷顯著降低，且數(shù)量有所增加。

圖5 綠豆皮對糖尿病小鼠肝組織（a），胰腺組織（b），血清AST（c）和ATL（d）的影響（n=8）Fig.5 Effects of mung bean seed-coat on liver tissue（a），pancreatic tissue（b），serum AST（c）and ATL（d） in diabetic mice（n=8）

3 結論與討論

糖尿病是一種嚴重威脅人類健康的代謝性疾病。從膳食角度，探究功能性食品對糖尿病的預防和治療具有重要意義。盡管綠豆皮中富含豐富的多酚類物質和膳食纖維，然而在淀粉、蛋白質以及一些特殊食品的制備過程中經(jīng)常被丟棄。為了避免功能成分的浪費，擴大綠豆皮的應用價值，本研究以高脂飼料聯(lián)合STZ 誘導的糖尿病小鼠為模型，研究綠豆皮對糖尿病小鼠糖脂代謝的改善作用。結果顯示，綠豆皮干預顯著降低了糖尿病小鼠的血糖濃度，增加了胰島素分泌，更重要的是有效減緩了糖尿病小鼠餐后血糖水平的迅速升高。糖尿病小鼠的血脂異常和肝組織病理情況也得到了顯著改善。先前的研究報道顯示，通過連續(xù)灌胃4周的綠豆皮乙醇提取物（3 g/kg），可顯著降低糖尿病KK-Ay小鼠的血糖和血脂水平，改善其糖耐量和胰島素免疫反應的能力[10]。相似的實驗結果也在其它研究中證實，綠豆皮乙醇提取物不僅可有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，而且可顯著降低糖尿病db/db 小鼠血糖水平，提高其胰島素敏感性[11]。這些也是與本實驗的研究結果相一致的。除了綠豆皮中的多酚物質，其豐富的膳食纖維也發(fā)揮著重要的功效。膳食纖維對人體健康有重要作用，其在調節(jié)餐后血糖，升高血清胰島素水平以及維持血糖平衡和功能方面得到諸多研究的證實[16-17]。佐兆杭等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，通過連續(xù)灌胃42 d的雜豆纖維（綠豆、黑豆和蕓豆混合膳食纖維），高脂飼養(yǎng)聯(lián)合STZ 誘導的糖尿病大鼠的血糖水平得到顯著控制，并且這種機制可能與修復胰島組織細胞氧化損傷有關。除此之外，也有研究表明通過在高脂飼料中添加一定比例的豌豆種皮，可以通過增加胰島細胞敏感性和改變肝臟脂質代謝來逆轉高脂誘導肥胖小鼠的高血糖狀態(tài)，其中豌豆纖維被認為在其中發(fā)揮著重要的作用[19-20]。綜合來看，綠豆皮功效的發(fā)揮可能是其含有的膳食纖維和多酚等成分通過不同的機制共同作用的結果。

綜上所述，綠豆皮可顯著改善高脂飼料聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的血糖和血脂水平，降低其糖化血清蛋白水平，增加其胰島素分泌，同時其緩解肝和胰島損傷。綠豆皮的有效利用不僅避免了副產(chǎn)物的浪費，而且為輔助降血糖功能性食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)，其具體作用機理還有待深入研究。