苯并芘誘導(dǎo)Balb/c小鼠的生理損傷和腸道菌群失調(diào)

于雷雷，張凌宇，張 灝，翟齊嘯，田豐偉，陳 衛(wèi)

（江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122）

食品在熏制和烘烤過程中，會產(chǎn)生大量的多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），危害人體健康[1-2]。其中，苯并芘是多環(huán)芳烴中最具特征和毒性的成員[3]，在水、大氣和土壤[3-5]中廣泛存在。據(jù)Phillips[6]報道苯并芘的攝入主要來自食品，尤其是加工不當(dāng)?shù)哪咎繜臼称?。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International agency for research on cancer，IARC）已將苯并芘歸為人類Ⅰ類致癌物，其主要損傷機(jī)制是通過產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和DNA 損傷。苯并芘本身毒性不大，然而，當(dāng)其被細(xì)胞酶系P450 代謝時，可轉(zhuǎn)化為具有高度致癌性的物質(zhì)7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并芘（7，8-dihydroxybenzopyrene-9，10-oxide，BPDE），其與DNA 結(jié)合會對人體造成嚴(yán)重?fù)p害。

暴露不同劑量的外源化合物對機(jī)體的損害程度也不同。苯并芘是一種在體內(nèi)反應(yīng)較為復(fù)雜的化合物，關(guān)于苯并芘單一劑量對生物體損害的研究很多，并在動物模型中證實其可誘發(fā)肺癌和結(jié)腸癌[7-10]，對人類造成遺傳毒性。苯并芘對腦、肺和結(jié)腸的氧化應(yīng)激也有報道[11-12]。通過飲食暴露苯并芘必定會對腸道菌群產(chǎn)生不利影響。腸道菌群在調(diào)節(jié)宿主健康中起著重要作用[13]，其產(chǎn)生的丙酸和丁酸可以很好地抑制炎癥[14-16]。然而，關(guān)于苯并芘對腸道菌群的影響鮮有研究報道。此外，苯并芘對生物體損害的劑量效應(yīng)研究較少，因此研究二者的關(guān)系具有重要意義。

本研究選擇不同苯并芘暴露劑量，研究其對Balb/c 小鼠造成生理損傷劑量效應(yīng)關(guān)系，并探究其損傷機(jī)制是否導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

總超氧化物歧化酶（SOD） 試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、總蛋白含量（TP）試劑盒、甘油三酸酯（TG）試劑盒、高密度脂蛋白（HDL）試劑盒、低密度脂蛋白（LDL）試劑盒、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒，南京建成生物研究所；苯并芘，美國Sigma 公司；FastDNA Spin Kit for Feces 細(xì)菌基因組提取試劑盒，美國MPbio 公司；TIANgel Mini Purification Kit 試劑盒，天根生化科技有限公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 試劑盒，美國Thermo 公司；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit、Miseq Reagent Kit，美國Illumina 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；MLS-3750 型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO 公司；SWCJ-1CV 型微生物操作超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；BC-5000 Vet 型全自動生化分析儀，深圳邁瑞醫(yī)療有限公司；MiSeq 第二代高通量測序儀，美國Illumina 公司。

1.3 動物實驗設(shè)計

雄性成年Balb/c 小鼠（8 周），上海斯萊克公司。在12 h/12 h 的明暗循環(huán)中，將小鼠飼養(yǎng)在溫度（22±1）℃、濕度55%±10%可控的籠中，可以自由獲取食物和水。根據(jù)體重將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只小鼠，并在實驗開始前使其適應(yīng)環(huán)境1周。實驗程序如下：第1 組（對照組）給予脫脂乳和玉米油；第2～5 組（干預(yù)組）分別給予以12.5，62.5，125，250 mg/kg 體重溶解于玉米油中的苯并芘。連續(xù)灌胃7 d，每天1 次。處死前禁食12 h，通過注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后處死，采集的血液在3 000×g 下離心15 min，吸出上清液并保存在-80 ℃進(jìn)行血清生化分析。解剖后立即用0.9%生理鹽水清洗肝、肺和結(jié)腸組織，均質(zhì)并貯存在-80 ℃，用于隨后的指標(biāo)檢測。

1.4 血液生化指標(biāo)測定

小鼠血清中的生化參數(shù)，包括總膽固醇（TC）、總蛋白含量（TP）、甘油三酸酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、堿性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），使用自動生化分析儀進(jìn)行測定。

1.5 氧化還原指標(biāo)測定

肝臟、肺和結(jié)腸中丙二醛（MDA）的水平和超氧化物歧化酶（SOD）的活性氧化應(yīng)激水平使用南京建成生物研究所的ELISA 試劑盒并根據(jù)其說明書進(jìn)行測定。

1.6 小鼠糞便微生物總DNA 的提取和腸道菌群高通量測序

參照Wang 等[17]的方法使用Fast DNA Spin Kit for Feces 試劑盒從糞便中提取總DNA，并使用通用引物（341F 和806R）對16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。之后從2.0%瓊脂糖凝膠上切下PCR 產(chǎn)物，按照TIANgel Mini Purification Kit試劑盒說明進(jìn)行純化，并通過Qubit dsDNA HS Assay Kit 試劑盒進(jìn)行定量。使用TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit 試劑盒制備文庫，并使用MiSeq Reagent Kit 試劑盒在Illumina MiSeq PE300 平臺上進(jìn)行測序。

1.7 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 和Graphpad 7 進(jìn)行統(tǒng)計分析。線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）使用在線網(wǎng)站（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）進(jìn)行分析。微生物群相關(guān)分析通過QIIME 和R（版本3.5.0）軟件進(jìn)行。使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 檢驗評估差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并芘暴露對小鼠體重的影響

暴露于不同苯并芘劑量組（12.5，62.5，125，250 mg/kg 體重）的小鼠體重在第7 天的變化量如圖1所示。與對照組相比，62.5 mg/kg 組的小鼠總體重顯著增加（P＜0.001），250 mg/kg 組顯著下降（P＜0.001）。

圖1 小鼠在不同劑量苯并芘暴露下的體重變化Fig.1 The alteration of body weight in mice exposed to different doses of benzopyrene

2.2 苯并芘暴露對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

如圖2所示，苯并芘暴露組與對照組相比，AST 和ALT 水平隨苯并芘濃度增加而增加，呈劑量依賴效應(yīng)，然而變化不顯著，僅在250 mg/kg 劑量組顯著增加（P<0.05，P<0.001）。如表1所示，HDL-C、LDL-C、TC、TG、ALP 和TP 水平在250 mg/kg 劑量下顯著降低（P < 0.05）。而在12.5，62.5，125 mg/kg 組則無顯著變化。

圖2 小鼠血液中的AST 和ALT 活性Fig.2 The activities of AST and ALT in the blood of the mice

表1 急性苯并芘暴露對小鼠的血液生化指標(biāo)的影響Table 1 Blood biochemical indexes of the mice fed by benzopyrene

2.3 苯并芘暴露對器官和組織中SOD 活性和MDA 水平的影響

如表2所示，苯并芘暴露對小鼠結(jié)腸的氧化還原狀態(tài)和炎癥生物標(biāo)志物的均無顯著性影響。苯并芘暴露組與對照組相比，僅在肝臟中250 mg/kg 劑量組的SOD 活性顯著增加（P < 0.05），而在肺中SOD 活性沒有顯著變化。且所有劑量組對肝臟和肺中的MDA 水平均無顯著影響。

表2 小鼠肝、肺和結(jié)腸中的SOD 和MDA 活性Table 2 SOD and MDA activities in the liver，lung and colon of the mice

2.4 苯并芘暴露對腸道菌群的影響

2.4.1 高劑量苯并芘對小鼠腸道菌群門水平相對豐度的影響 如圖3所示，在門水平，對照組小鼠的腸道菌群組成主要為疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。而250 mg/kg的苯并芘暴露劑量組，變形菌門和厚壁菌門的豐度顯著增加，擬桿菌門的豐度顯著降低。

圖3 不同組別小鼠腸道菌群的門水平豐度Fig.3 The composition of gut microbiota in different groups of mice at phylum level

2.4.2 高劑量苯并芘對小鼠腸道菌群科屬水平相對豐度的影響 實驗進(jìn)一步分析了250 mg/kg 的苯并芘暴露劑量組的屬水平（圖4）小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，對照組小鼠腸道菌群主要由阿克曼菌（Akkermansia）、S24-7、梭菌目（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和理研菌科（Rikenellaceae）構(gòu)成，分別占比20.99%，35.86%，13.21%，1.78%和3.30%。250 mg/kg 苯并芘劑量暴露組除了阿克曼菌仍為主要的優(yōu)勢屬外，S24-7、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃球菌屬和理研菌科的豐度顯著下降，結(jié)合LEfSe 和LDA分析（圖5）顯示腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和Allobaculum 的豐度顯著增加，分別占3.93%，9.59%，6.03%，10.50%。

圖4 不同組別小鼠腸道菌群的屬水平豐度Fig.4 The composition genus level of gut microbiota in different groups of mice at genus level

圖5 LEfSe 分析對照組和250 mg/kg 劑量組腸道菌群的組成Fig.5 LEfSe-based comparison of gut microbiota composition between control and 250 mg/kg dose groups

圖6 250 mg/kg 劑量組豐度顯著變化的菌Fig.6 The significant changes of species in 250 mg/kg group

3 討論

苯并芘是一種對生物體危害極大的環(huán)境致癌物，研究結(jié)果表明，高劑量的苯并芘（250 mg/kg）導(dǎo)致Balb/c 小鼠第7 天的總體重顯著降低，與Ajayi等[18]研究的250 mg/kg 苯并芘暴露劑量下體重變化的結(jié)果相一致。此外，在62.5 mg/kg 劑量下小鼠體重顯著增加，這可能是由于毒物興奮效應(yīng)導(dǎo)致[19]。毒物興奮效應(yīng)是生物體的一種適應(yīng)性反應(yīng)，即化學(xué)污染物在高劑量時對生物體表現(xiàn)為有害影響，而在低劑量時卻表現(xiàn)為刺激機(jī)體積極應(yīng)激反應(yīng)。

在動物模型的肝臟損傷研究中，AST 和ALT通常被作為考察脊椎動物肝臟功能的標(biāo)志性指標(biāo)[20-22]，本研究在最高劑量（250 mg/kg）下，AST 和ALT 水平顯著增加，在12.5，62.5，125 mg/kg 劑量下變化不顯著，隨苯并芘劑量增加呈增加趨勢。Vasanth 等[23]在給鯪魚攝入質(zhì)量濃度5.0～25.0 mg/L 蒽的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)AST 和ALT 的濃度隨著蒽劑量的增加而增加，這與本課題組的研究結(jié)論一致。在250 mg/kg 劑量下，HDL 含量顯著下降，表明肝臟處于損傷狀態(tài)，LDL 含量也顯著下降，然而其值均在正常范圍內(nèi)，TC 總膽固醇和TG 甘油三酸酯含量顯著降低，表明苯并芘對肝臟造成損害并影響總膽固醇和甘油三酸酯的合成?？傃鍓A性磷酸酶（ALP）是一種衍生自各種組織的同功酶，在本研究中ALP 的濃度隨著苯并芘劑量的增加而降低，并在250 mg/kg 劑量下顯著降低。這與Vasanth 等[23]的研究結(jié)果相反，結(jié)合第7 天體重嚴(yán)重下降，判斷小鼠可能發(fā)生了營養(yǎng)不良，而營養(yǎng)不良往往導(dǎo)致ALP 含量降低[24-25]。在250 mg/kg 劑量下總蛋白TP 顯著下降，表明可能已經(jīng)發(fā)生肝功能損害。因此，高劑量的苯并芘暴露會對小鼠肝功能造成嚴(yán)重?fù)p害。

本研究分析了肝臟、肺和結(jié)腸內(nèi)SOD 與MDA的變化情況。與對照組相比，在250 mg/kg 最高劑量下肝臟SOD 活性顯著增加，而肺和結(jié)腸SOD 活性沒有顯著變化。據(jù)報道，在20 μg/L 的苯并芘劑量下暴露6，12，18 d 后鯉魚肝臟中的SOD 活性顯著增加[26]。同樣也有研究報道，給熱帶魚腹腔注射1 000 μmol/kg 劑量的苯并芘4 d 后，組織SOD 活性顯著增加[27]。給舞毒蛾從第1 齡到第5 齡喂食含有2，20，100，2 000 ng/g 苯并芘的食物后發(fā)現(xiàn)組織SOD 活性顯著增加[28]。這些結(jié)果表明苯并芘代謝產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基，導(dǎo)致高水平的ROS，然后誘導(dǎo)SOD 的活性增加，最終隨著ROS水平的增加，SOD 活性也隨之增加，需要反應(yīng)的超氧自由基越多，表明小鼠在最高劑量下處于較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

在不同劑量苯并芘暴露下的生化指標(biāo)與氧化還原指標(biāo)測定結(jié)果顯示，在最高暴露劑量組250 mg/kg 下，所有指標(biāo)都發(fā)生了顯著變化。因此，隨后研究了對照組與250 mg/kg 暴露劑量組的小鼠腸道菌群的差異。結(jié)果顯示，在250 mg/kg 劑量組下，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，在門水平下，250 mg/kg 的苯并芘暴露劑量組顯示，變形菌門和厚壁菌門豐度顯著增加，擬桿菌門豐度顯著降低。事實上，變形菌門的增加和擬桿菌門的減少通常與多環(huán)芳烴有關(guān)[29-31]。在屬水平，S24-7、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃球菌屬、理研菌科的豐度顯著下降，擬桿菌門S24-7 菌科在腸道菌群中廣泛存在，小鼠是最常見的宿主，其平均相對豐度為20%[32]，是健康小鼠體內(nèi)較為主要的菌群，然而高劑量苯并芘的暴露導(dǎo)致S24-7 顯著降低，表明苯并芘暴露對小鼠腸道穩(wěn)定造成了破壞，在給小鼠服用瀉藥聚乙二醇（PEG）后的報道也顯示在引發(fā)輕度滲透性腹瀉的同時，也伴隨著S24-7 這種高豐度菌株的消失，并被擬桿菌科取代[33]。在疾病狀態(tài)下，梭菌目的豐度往往會減少[34]，其豐度的減少標(biāo)志著小鼠健康狀態(tài)受損。毛螺菌科是腸道中最重要的正丁酸生產(chǎn)微生物，具有調(diào)節(jié)宿主能量和黏膜完整性的功能，瘤胃球菌屬具有調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜中黏蛋白表達(dá)和黏液糖基化的能力[35]，這2 種菌株的豐度顯著下降，可能說明了高劑量苯并芘暴露對小鼠腸道屏障產(chǎn)生了有害影響。理研菌科能夠分解碳水化合物和蛋白質(zhì)[36]，也是正常小鼠中重要的菌群，其豐度的下降可能會導(dǎo)致小鼠攝食減少，與其體重顯著降低可能存在一定的關(guān)聯(lián)。250 mg/kg 暴露劑量組下，腸桿菌科、乳桿菌屬、假單胞菌屬和Allobaculum 的豐度顯著增加。腸桿菌科通常是腸道致病菌，其豐度的增加表明此時小鼠健康狀態(tài)已遭受嚴(yán)重威脅。假單胞菌屬是引起急性和慢性感染的主要病原體[37]，尤其是在免疫功能低下的人群中較為常見，假單胞菌屬的顯著增加暗示了小鼠在高劑量苯并芘暴露下免疫力下降的結(jié)果。Hayashi 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠進(jìn)行萬古霉素干預(yù)后，小鼠腸道穩(wěn)態(tài)失調(diào)，造成鼠李糖乳桿菌的豐度顯著增加，導(dǎo)致生物素急劇消耗，最終導(dǎo)致小鼠脫發(fā)。本研究中乳桿菌屬豐度的顯著增加可能暗示了小鼠體內(nèi)相關(guān)生物素的消耗，并最終對機(jī)體造成損害。在Lai 等[39]的研究中發(fā)現(xiàn)，在低劑量全氟辛烷磺酸暴露后，Allobaculum 豐度大大增加，這是一種特定的短鏈脂肪酸產(chǎn)生細(xì)菌，其有助于胰島素抵抗和肥胖。本研究中Allobaculum 豐度的增加可能是小鼠機(jī)體在受到損傷時的一種應(yīng)激行為。

4 結(jié)論

在不同濃度苯并芘劑量暴露下，小鼠體重、血清生化指標(biāo)和肝臟SOD 活性僅在250 mg/kg 暴露劑量下發(fā)生顯著變化。AST、ALT 水平隨苯并芘濃度增加而增加，呈現(xiàn)苯并芘的濃度依賴效應(yīng)，然而僅在250 mg/kg 暴露劑量下具有顯著性。250 mg/kg 暴露劑量下與對照組相比腸道菌群發(fā)生了顯著變化，S24-7、梭菌目、毛螺菌科、瘤胃球菌屬和理研菌科豐度顯著下降，腸桿菌科、乳桿菌屬、假單胞菌屬和Allobaculum 的豐度顯著增加。結(jié)果證明腸道菌群失調(diào)是苯并芘暴露造成Balb/c 小鼠模型損害的途徑之一，然而苯并芘的損傷機(jī)制是否涉及腸道屏障功能破壞，機(jī)體和菌群代謝紊亂，機(jī)體免疫失調(diào)等，仍有待深入研究。