魚肌球蛋白與腥味物質(zhì)的結(jié)合作用研究

徐永霞，王 瑞，尹一鳴，趙洪雷，李學(xué)鵬，儀淑敏，王明麗，周小敏，勵建榮*

（1渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2蓬萊京魯漁業(yè)有限公司 山東煙臺 265600 3浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司 浙江舟山 316120）

我國淡水魚資源豐富，其中白鰱魚、鳙魚等低值淡水魚產(chǎn)量高，價(jià)格低，且具有良好的凝膠性能，是生產(chǎn)魚糜及魚糜制品的良好原料[1-2]。然而，淡水魚固有的腥味較重，在加工過程中難以脫除，嚴(yán)重制約了我國淡水魚魚糜加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。引起淡水產(chǎn)生魚腥味的物質(zhì)種類多樣，組成復(fù)雜，主要包括醛酮類、醇類、含氮含硫類、烴類及萜烯衍生物等[4-5]。在淡水魚加工及貯藏過程中，微生物和酶的作用以及脂肪的氧化是魚腥味產(chǎn)生的重要原因。

魚肉中的腥味物質(zhì)大部分與蛋白基質(zhì)結(jié)合而難以有效脫除[1]，其中肌原纖維蛋白、肌球蛋白作為魚糜的主要組成成分，也是魚糜中腥味物質(zhì)的主要結(jié)合受體，直接影響最終產(chǎn)品的質(zhì)地、保水性和風(fēng)味等。目前關(guān)于蛋白質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究主要集中在大豆蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白和牛血清蛋白等蛋白上，而關(guān)于肉類蛋白尤其是魚肉蛋白與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究較少。劉璘等[1]利用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)研究了白鰱魚肉蛋白質(zhì)與典型腥味物質(zhì)的結(jié)合作用，Damodaran 等[6]研究了魚肉中的肌動球蛋白對醛酮類風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合作用，Cao 等[7]研究了雙氧水處理后草魚肌動蛋白結(jié)構(gòu)變化及對醛醇類風(fēng)味物質(zhì)吸附能力的影響。研究者大多采用色譜、光譜、核磁共振及分子模擬等方法研究小分子氣味物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理，獲得作用力類型、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)等信息[8-9]。其中作為研究模型的β-乳球蛋白與醛、酮、醇類等風(fēng)味化合物的結(jié)合位點(diǎn)主要分布在蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，并且存在多個不同的結(jié)合位點(diǎn)，且這些作用位點(diǎn)對不同結(jié)構(gòu)風(fēng)味化合物的結(jié)合具有選擇性[10]。不同類型和結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對于風(fēng)味化合物的作用效應(yīng)各有不同，關(guān)于魚肉蛋白與風(fēng)味物質(zhì)相互作用的研究目前還較少。

鑒于此，本文以花鰱魚為研究對象，選取魚肉中6 種典型腥味化合物【己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇】，建立魚肌球蛋白-腥味化合物作用模型體系，通過頂空-氣相色譜/質(zhì)譜法、差示掃描量熱法、拉曼光譜及分子模擬等技術(shù)，分析魚肌球蛋白與腥味物質(zhì)的結(jié)合作用特征，旨在為淡水魚蛋白產(chǎn)品中腥味物質(zhì)的調(diào)控及風(fēng)味品質(zhì)改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花鰱魚（Aristichthys nobilis），錦州市林西街水產(chǎn)市場，平均尾重（1 500±50）g。

己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇均為色譜純級，美國Sigma 公司：腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽水合物（ATP），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀、氯化鎂、乙酸鎂、馬來酸、β-巰基乙醇、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、碳酸氫鉀等均為分析純級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；LabRAM HR Evolution 拉曼光譜儀，崛場（中國）貿(mào)易有限公司；NanoBrook 粒度儀，美國布魯克海文儀器公司；970CRT 熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Q2000 差示掃描熱量儀，美國TA 儀器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取及成分分析 新鮮花鰱魚宰殺后取背部肌肉，參照Park 等[11]的方法提取肌球蛋白。肌球蛋白濃度采用雙縮脲法測定，用牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參照Qi 等[12]的方法，利用十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對肌球蛋白組成進(jìn)行分析，采用Quantity One 軟件對膠進(jìn)行掃描與分析。

1.3.2 腥味物質(zhì)儲備液的制備 將己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇分別溶于20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）中，超聲2 min，制得最終質(zhì)量濃度為2 000 mg/L 的腥味物質(zhì)儲備液，密封后于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 肌球蛋白-腥味化合物作用體系的構(gòu)建采用Tris-HCl 緩沖液（含0.5 mol/L NaCl，pH 7.0）將肌球蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，取10 mL 蛋白溶液置于頂空瓶中，分別加入上述腥味物質(zhì)儲備液，使最終蛋白樣品溶液中腥味物質(zhì)的質(zhì)量濃度為1 mg/L，立即用PTFE 硅膠隔墊瓶蓋密封，高速振蕩混勻1 min 后，在30 ℃避光條件下恒溫振蕩1 h。以不添加任何腥味物質(zhì)儲備液的蛋白溶液為對照組。

1.3.4 肌球蛋白對腥味化合物結(jié)合能力的測定參考Wang 等[13]的方法，并稍加修改。采用頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-GC-MS）測定振蕩平衡后試樣中各風(fēng)味化合物的濃度，空白組以含相同濃度揮發(fā)物的緩沖溶液代替。上述振蕩后的樣品，置于氣相自動進(jìn)樣托盤上。樣品進(jìn)樣前在40 ℃下孵化10 min，然后通過頂空進(jìn)樣的方式吸取1 mL 樣品空氣插入GC 進(jìn)樣口，250 ℃下解吸5 min，不分流進(jìn)樣。

GC 條件：HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為99.999%高純氦氣，流速1.0 mL/min；柱箱初溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 的速率升溫至120 ℃，保持5 min。MS 條件：色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；離子化方式：EI；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍30～550 m/z。

肌球蛋白對腥味化合物的結(jié)合能力用空白緩沖液組進(jìn)樣瓶中頂部空間風(fēng)味物質(zhì)的含量與蛋白質(zhì)存在情況下其含量變化的百分比表示，見式（1）。

1.3.5 表面疏水性的測定 參照Chelh 等[14]的方法，采用ANS（8-苯胺-1-萘磺酸）熒光探針法進(jìn)行測定。用20 mmol/L PBS 緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0） 將肌球蛋白樣品梯度稀釋至0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL，向4 mL 蛋白樣品中加入50 μL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L pH 7.0 的PBS 緩沖液配制）后混合均勻，避光反應(yīng)10 min，使用熒光分光光度計(jì)測定其熒光強(qiáng)度。以相對熒光強(qiáng)度對肌球蛋白濃度作圖，曲線初始階段的斜率即為肌球蛋白的表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 Zeta 電位的測定 參照Beliciu 等[15]的方法，并稍加修改。采用Brookhaven 90 Plus 納米粒度分析儀進(jìn)行Zeta 電位的測定，將蛋白樣品用20 mmol/L 的PBS（含0.6 KCl，pH 7.0） 稀釋至0.05 mg/mL，測試前超聲1 min 去除氣泡。設(shè)定參數(shù)：采用35 mW 固態(tài)激光器，“高精度” 模式，波長660 nm，溶劑為水，測定溫度25 ℃。

1.3.7 總巰基和活性巰基含量的測定 參照李穎暢等[16]的方法進(jìn)行總巰基和活性巰基含量的測定，計(jì)算方法見式（2）。

式中，ε——巰基摩爾消光系數(shù)，此處為13 600 L/（mol·cm）。

1.3.8 拉曼光譜分析 參照Alix 等[17]的方法，采用高分辨率拉曼光譜儀，以氬離子激光器為光源對冷凍干燥后的蛋白樣品進(jìn)行測定。設(shè)定參數(shù)：激發(fā)波長532 nm，狹縫200 μm，功率120 mW，曝光時間60 s，掃描范圍400～3 600 cm-1。以苯丙氨酸（1 003 cm-1）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行歸一化。

1.3.9 熱穩(wěn)定性分析 稱取5～10 mg 冷凍干燥后的肌球蛋白樣品于鋁盒中，利用差示掃描量熱儀進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定。參數(shù)設(shè)定：初始溫度20 ℃，升溫速率5 ℃/min，結(jié)束溫度80 ℃。

1.3.10 分子靜態(tài)動力學(xué)模擬 從UniProtKB 數(shù)據(jù)庫檢索到花鰱魚肌球蛋白的氨基酸序列（https：//www.uniprot.org/）（PDB ID：E9JM97），利用SWISSMODEL server 進(jìn)行同源建模，篩選不同的結(jié)果，通過觀察模型蛋白氨基酸序列對源蛋白氨基酸序列的覆蓋率及其拉試圖的合理區(qū)域，選取覆蓋率超過70%、拉試圖合理區(qū)域超過90%的蛋白模型，獲得的同源性蛋白模型被導(dǎo)入到Discovery Studio（DS，版本2.1，NeoTrident Technology LTD）中，通過最小化協(xié)議進(jìn)行優(yōu)化。

小分子配體：在DS 中建立己醛、庚醛、辛醛、壬醛、（E）-2-庚烯醛和1-辛烯-3-醇的三維模型，使用Minimization 協(xié)議對其進(jìn)行優(yōu)化。受體蛋白：除去受體蛋白的水分子和雜原子，并添加氫原子和Charmn 力場。使用DS/CDOCKER 方案對受體與配體進(jìn)行對接。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 運(yùn)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和Duncan 檢驗(yàn)，使用Origin 9.0軟件繪圖，GC-MS 數(shù)據(jù)處理利用NIST11/Wiley7.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫進(jìn)行鑒定。數(shù)據(jù)后的肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白SDS-PAGE 分析

肌球蛋白在高溫、高壓等強(qiáng)變性條件下會降解成6 條多肽鏈，包括2 條重鏈和4 條輕鏈，重鏈分子質(zhì)量約為200 ku，輕鏈分子質(zhì)量約為20 ku，另外2 條輕鏈約為15 ku 和25 ku[18]?；桇~肌球蛋白的SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。由圖可知，本試驗(yàn)中提取的花鰱魚肌球蛋白主要包含1 條肌球蛋白重鏈（分子質(zhì)量約200 ku）和2 條肌球蛋白輕鏈（分子質(zhì)量約為18 ku 和25 ku）。此外還有少量的肌動蛋白，分子質(zhì)量約為43 ku。

圖1 肌球蛋白電泳圖Fig.1 The SDS-PAGE patterns of myosin

2.2 結(jié)合能力分析

食品中的蛋白質(zhì)除了通過降解形成風(fēng)味物質(zhì)外，還可以通過分子鍵與風(fēng)味物質(zhì)相結(jié)合進(jìn)而改變食品中風(fēng)味組分的存在狀態(tài)[19]。蛋白質(zhì)與揮發(fā)性風(fēng)味小分子之間的作用主要取決于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的多樣性，同時也受高級結(jié)構(gòu)的影響；此外，風(fēng)味物質(zhì)的種類、疏水性及分配系數(shù)對兩者的結(jié)合作用也有直接影響[20]。不同腥味化合物與魚肉肌球蛋白的結(jié)合能力如圖2所示。1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、（E）-2-庚烯醛、辛醛和壬醛與肌球蛋白的結(jié)合能力分別為20.82%，21.4%，23.59%，25.29%，26.86%和28.25%，由此發(fā)現(xiàn)隨著風(fēng)味化合物碳鏈長度、不飽和度以及官能團(tuán)的改變，結(jié)合能力也隨之改變。隨著直鏈醛碳鏈長度及不飽和度的增加，結(jié)合能力逐漸增大（P<0.05），這可能是由于隨著風(fēng)味化合物碳鏈的增長和不飽和度的增加，疏水性逐漸增強(qiáng)，從而擁有更多的結(jié)合位點(diǎn)，同時也說明兩者之間的作用力可能為疏水相互作用[20]。此外，醛類中的不飽和雙鍵可能會和蛋白組成中的賴氨酸、組氨酸殘基發(fā)生加成反應(yīng)，從而增強(qiáng)其結(jié)合能力[21]。醇類物質(zhì)由于極性較強(qiáng)，與蛋白質(zhì)之間的疏水相互作用相對較弱，因此結(jié)合能力較低。Kühn 等[21]提出，大部分揮發(fā)性物質(zhì)在自然狀態(tài)下都具有疏水性，某些特定基團(tuán)，如羰基的存在對蛋白與風(fēng)味化合物之間的相互作用具有顯著影響，其中醛類化合物與蛋白質(zhì)的作用能力要高于酮類和醇類化合物。Tan 等[22]通過數(shù)學(xué)模型發(fā)現(xiàn)風(fēng)味化合物與蛋白質(zhì)之間的作用能力主要受碳原子數(shù)、氫原子數(shù)、鏈長及沸點(diǎn)大小等的影響。Brewer 和Vega[23]研究表明，疏水相互作用及氫鍵是影響蛋白質(zhì)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)吸附能力的主要作用，蛋白結(jié)構(gòu)的展開也會提供更多的吸附位點(diǎn)。

2.3 表面疏水性的變化

表面疏水性可以有效地反映蛋白表面與外界極性水環(huán)境接觸的疏水性氨基酸的相對含量，常被用來評價(jià)蛋白質(zhì)的變性程度[7]。如圖3所示，對照組的表面疏水性最低，添加不同種類的腥味化合物均使肌球蛋白的表面疏水性顯著增加（P<0.05）。這是由于醛醇類腥味化合物的存在導(dǎo)致肌球蛋白發(fā)生變性，使其結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多的脂肪族及芳香族氨基酸側(cè)鏈等疏水性基團(tuán)，從而導(dǎo)致肌球蛋白表面疏水性的增加，并且風(fēng)味化合物結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生的影響具有顯著差異。此外，隨著醛類化合物碳鏈長度的增加，肌球蛋白的變性程度也逐漸增加（P<0.05）。相比于飽和醛庚醛，不飽和醛（E）-2-庚烯醛使肌球蛋白的表面疏水性有所增加，然而無顯著性差異（P>0.05）。由此可見，相對于不飽和鍵，風(fēng)味化合物的碳鏈長度對肌球蛋白的溶解度有著更大的影響。此外，1-辛烯-3-醇對肌球蛋白表面疏水性的影響要顯著低于醛類物質(zhì)（P<0.05）。由此可見，與鏈長及不飽和度相比，風(fēng)味化合物官能團(tuán)的變化對蛋白質(zhì)與風(fēng)味化合物之間的相互作用影響更大。

圖3 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后表面疏水性的變化Fig.3 Changes in surface hydrophobicity of myosin binding of fishy odor compounds

2.4 Zeta 電位分析

蛋白質(zhì)雙螺旋結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈上含有多種類型的極性基團(tuán)（如羥基、羧基及氨基），天然結(jié)構(gòu)中親水性極性基團(tuán)會暴露在外部水環(huán)境中，使得蛋白質(zhì)表面帶有一定數(shù)量的電荷，這些基團(tuán)所帶電荷的多少以及電荷的正負(fù)性將直接影響蛋白質(zhì)溶液的Zeta 電位值，當(dāng)溶液體系中的Zeta 電位絕對值降低時，表明蛋白質(zhì)表面所帶電荷減少，親水性基團(tuán)被包埋，暴露出更多的疏水性基團(tuán)，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[24]。添加不同種類腥味化合物后，魚肌球蛋白溶液的Zeta 電位絕對值變化情況如圖4所示。由圖可知，腥味化合物的存在使肌球蛋白的Zeta 電位絕對值降低，除1-辛烯-3-醇外，己醛、庚醛等醛類化合物使肌球蛋白的Zeta 電位值顯著降低（P<0.05），其中對照組、添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛肌球蛋白組的Zeta 電位絕對值分別為26.36，24.48，22.05，16.95，13.93，10.47，12.15 mW?？梢钥闯?，風(fēng)味化合物碳鏈長度及不飽和度的增加會使蛋白質(zhì)的變性程度增加，從而使蛋白樣液的Zeta 電位絕對值逐漸降低，并且醇類物質(zhì)的影響相對較小，這與前面蛋白表面疏水性的變化結(jié)果相一致。

圖4 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后Zeta 電位的變化Fig.4 Changes in zeta potential of myosin binding of fishy odor compounds

2.5 總巰基及活性巰基的變化

巰基（-SH）是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中最具反應(yīng)活性的基團(tuán)之一，其含量變化直接影響蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?？値€基主要包括活性巰基和包埋在蛋白內(nèi)部的巰基，SH1、SH2和SHa 是肌球蛋白分子中巰基的主要類型，其中SH1、SH2主要存在于肌球蛋白的頭部區(qū)域，當(dāng)?shù)鞍讟?gòu)象發(fā)生改變時，埋藏在蛋白內(nèi)部的巰基會暴露出來，因此巰基含量的變化是衡量蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)[25]。肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后巰基含量的變化如圖5所示，醛醇類物質(zhì)的存在使肌球蛋白的總巰基和活性巰基含量顯著升高（P<0.05）。與對照組相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后肌球蛋白總巰基含量分別增加了2.17，4.39，5.47，8.23，12.48，6.61 mol/105mg。這是由于風(fēng)味化合物的存在使肌球蛋白發(fā)生變性，蛋白結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致更多的巰基暴露在蛋白表面，從而使得總巰基和活性巰基的含量都呈上升趨勢，并且隨著化合物碳鏈長度及不飽和度的增加，影響更加顯著。此外，醛類化合物對肌球蛋白巰基含量的影響要顯著高于醇類化合物，這一結(jié)果與前面肌球蛋白表面疏水性的變化趨勢一致。蛋白表面疏水性增加的同時，會伴隨著巰基含量的增加以及表面電荷數(shù)的降低，從而導(dǎo)致蛋白自身穩(wěn)定性降低。

圖5 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后巰基含量的變化Fig.5 Changes in sulfhydryl groups content of myosin binding of fishy odor compounds

2.6 拉曼光譜分析

拉曼光譜分析可以反映蛋白質(zhì)肽鏈的骨架振動、氨基酸側(cè)鏈周圍微環(huán)境的變化[26]，其中蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象及其二級結(jié)構(gòu)的含量都與酰胺I 區(qū)（1 600～1 700 cm-1）的譜帶信息有關(guān)[27]。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、β-折疊（1 665～1 680 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 680 cm-1附近）和無規(guī)則卷曲（1 660～1 665 cm-1），其中α-螺旋是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性的代表，β-轉(zhuǎn)角等代表蛋白質(zhì)的無序性和松散性[28]。魚肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合前、后的拉曼光譜圖及二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化情況分別如圖6和表1所示。由表可知，添加風(fēng)味物質(zhì)后，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低（P<0.05），β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量顯著上升（P<0.05），這可能是由于醛類和醇類物質(zhì)的作用使肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，使α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊和β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變。與對照組相比，添加1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和（E）-2-庚烯醛后α-螺旋含量分別下降了7.09%，10.75%，11.5%，13.54%，14.14%和12.34%。研究表明[27-28]，蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要依靠疏水作用、氫鍵、二硫鍵、靜電相互作用等維持，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象最主要的結(jié)構(gòu)，它主要決定于多肽鏈上羰基（C=O）和氨基（-NH）之間形成的氫鍵。添加腥味化合物可能使氫鍵破壞，α-螺旋解旋，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并且化合物碳鏈長度的增加，碳碳雙鍵的存在，會增加腥味化合物與肌球蛋白之間的結(jié)合作用，促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變，從而增大了蛋白質(zhì)的變性程度。

圖6 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后的拉曼光譜圖Fig.6 The Raman spectrum of myosin binding of fishy odor compounds

表1 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合后二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化Table 1 The relative content of secondary structures of myosin binding of fishy odor compounds

2.7 熱穩(wěn)定性分析

腥味化合物對魚肌球蛋白熱變性中點(diǎn)溫度（Tm）及變性焓值（ΔH）的影響如表2所示。研究表明，蛋白質(zhì)的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度與其熱穩(wěn)定性有直接關(guān)系，Tm值越高，蛋白熱穩(wěn)定性越高，破壞其空間穩(wěn)定性所需能量也就越高，ΔH 值越大[28]。由表2可知，與對照組相比，1-辛烯-3-醇使肌球蛋白的熱變性溫度略有降低，而醛類化合物使肌球蛋白的熱變性溫度顯著降低（P<0.05），兩類化合物均使肌球蛋白的焓變值顯著降低（P<0.05），這是由于腥味化合物誘導(dǎo)肌球蛋白發(fā)生部分變性，使維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的α-螺旋結(jié)構(gòu)破壞，從而降低了蛋白質(zhì)變性所需要的焓變值，導(dǎo)致其熱穩(wěn)定性降低，并且隨著化合物碳鏈長度的增加影響越顯著。Wang 等[13]在探究豌豆蛋白與風(fēng)味物質(zhì)結(jié)合作用時也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。

表2 肌球蛋白與腥味化合物結(jié)合熱穩(wěn)定性的變化Table 2 Changes of the thermal properties of myosin binding of fishy odor compounds

2.8 分子靜態(tài)動力學(xué)模擬

同源建模獲得的花鰱魚肌球蛋白3D 模擬圖如圖7所示，通過DS 軟件的CDOCKER 程序?qū)Φ鞍资荏w與腥味化合物（配體）進(jìn)行對接，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出，腥味化合物可以與蛋白上的Phe101，Ile104，Ile100，Leu116，Phe45 等氨基酸通過氫鍵結(jié)合，同時還以共價(jià)鍵的形式與Phe101，Lys166 等氨基酸結(jié)合。此外，與醇類物質(zhì)相比，醛類物質(zhì)還可以與蛋白上的Lys109 和Thr168 通過疏水相互作用結(jié)合，分子模擬的結(jié)果輔助驗(yàn)證了疏水性相互作用、氫鍵及共價(jià)鍵是花鰱魚肌球蛋白與所選腥味化合物結(jié)合的主要方式。

圖7 花鰱魚肌球蛋白同源模擬3D 圖Fig.7 3D homology modeling diagram of bighead carp myosin

圖8 腥味化合物與花鰱魚肌球蛋白對接結(jié)果3D 圖Fig.8 3D docking diagram of fishy odor compounds binding to bighead carp myosin

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過HS-GC-MS、分子模擬結(jié)合光譜等技術(shù)探究了魚肌球蛋白與6 種特征腥味化合物

之間的結(jié)合作用機(jī)制。結(jié)果表明，醛類物質(zhì)與肌球蛋白之間的結(jié)合能力隨著碳鏈長度及不飽和度的增加而顯著增大，且1-辛烯-3-醇的結(jié)合能力顯著低于醛類；所選的特征腥味物質(zhì)與肌球蛋白之間的作用力主要是疏水相互作用、氫鍵和共價(jià)鍵；小分子腥味物質(zhì)的存在使肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開，疏水性基團(tuán)暴露，總巰基和活性巰基含量增加，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性降低，并且醛類物質(zhì)對肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響顯著高于醇類。