藍莓酵素的體外抗氧化及對秀麗隱桿線蟲的氧化應激保護作用

王高堅，王珍珍，李嘉嘉，范昊安，沙如意, ，毛建衛(wèi),2,

（1.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業(yè)生物資源生化制造協同創(chuàng)新中心，浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州 310023；2.浙江工業(yè)職業(yè)技術學院，浙江紹興 312000）

食用酵素是以一種或多種新鮮蔬菜類、水果類、谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料，加（或不加）糖類物質，經多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產的功能性微生物發(fā)酵產品[1]，擁有豐富的次生代謝產物，益生菌等功能性成分，特別是富含小分子功能成分，研究表明該類產品具有抗衰老、抗菌消炎、抗癌、增強機體免疫能力及解毒等多種保健功能[2?4]。

藍莓，又名越橘（VacciniumSpp），杜鵑花科越橘屬[5]，原產于北美，目前國內藍莓種植主要分布在云南、江浙、山東及東北三省[6]。因其果實中含有大量多酚、花青素、氨基酸、膳食纖維、維生素等物質，而被廣泛栽培種植。但其果實成熟后極易變軟破碎，且采摘季節(jié)主要在夏季，極大增加了運輸和儲藏的成本。目前，我國市場銷售的藍莓產品主要以果汁果酒類、蜜餞類、果醬類等[7]粗加工產品為主，對于藍莓發(fā)酵產品如藍莓果酒、果醋，酵素等研究主要集中于工藝、功效及風味物質等[8]，而對其作用機理還有待研究開發(fā)[9]。鑒于有關藍莓加工產品的抗氧化作用及其作用機制的報道較少，本文研究了藍莓酵素發(fā)酵過程中主要代謝產物變化及體外抗氧化指標，并結合秀麗隱桿線蟲模型，對藍莓酵素的體內抗氧化能力進行綜合考量，以期為藍莓的深加工以及高附加值產品開發(fā)與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大興安嶺野生藍莓 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室；白砂糖（食品級） 太古糖業(yè)（中國）有限公司；酵液（含酵母菌、乳酸菌，醋酸菌等）浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室；野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，Bristol N2），雌雄同體、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌（E.coliOP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；2,2′-偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2′-Azobis（2-methylpropionamidine） dihydrochloride，AAPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、熒光素鈉（fluorescein，FL）、水溶性維生素E（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox） 上海阿拉丁化學試劑有限公司；脂質氧化（MDA）檢測試劑盒、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒 碧云天生物技術有限公司。

20 L不銹鋼（316L）發(fā)酵罐 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室；FS-750T超聲波細胞破碎機 上海生析超聲儀器有限公司；LRH-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；SpectraMax iD5多功能酶標儀 美國美谷分子儀器公司；奧林巴斯SZ680體視顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓酵素的制備 用無菌水沖洗新鮮藍莓（果實成熟且無蟲害潰爛），自然瀝干后，將藍莓和白砂糖以質量比1:1加入高壓蒸汽滅菌過的20 L不銹鋼發(fā)酵罐中，并加入適量酵液，于（20±5）℃下發(fā)酵，定期取樣，將樣品于10000 r/min下離心10 min，取上清，置于?80 ℃超低溫冰箱中保藏，待測[4]。

1.2.2 總花青素含量的測定 采用pH示差法測定藍莓酵素中總花青素含量[10]，取0.5 mL酵素樣品，分別用0.2 mol/L KCl-HCl緩 沖溶液（pH1.0）和0.2 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH4.5）的緩沖液稀釋50倍，于23 ℃下靜置15 min后，在510 nm和700 nm處測定其吸光值。

總花青素含量計算采用以下公式如下：

X為花青素含量，mg/mL；Mw為相對分子質量，以矢車菊3-O-葡糖糖苷為參照，其值為449.2；Df為稀釋倍數；?為摩爾消光系數，其值為26900；L為光程，其值為1。

1.2.3 總酚含量的測定 采用福林酚法[11]測定藍莓酵素中總酚含量。取5 μL酵素樣品，用去離子水稀釋至0.5 mL，加入2.5 mL 10%的福林酚溶液（v/v），避光靜置3 min后，加入2 mL 75 g/L Na2CO3溶液，混勻。25 ℃反應1 h，在765 nm處測定吸光度。并以沒食子酸作為標品，繪制標準曲線。

1.2.4 總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[12]測定藍莓酵素中總黃酮含量。取500 μL酵素樣品加入60%乙醇溶液（v/v）至5 mL，加入0.3 mL 10%的NaNO2溶液（m/v），混合均勻，放置 3 min；加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液（m/v），靜置6 min；加入2.0 mL 8%NaOH溶液（m/v），用60%乙醇定容至10 mL，混勻靜置15 min，在500 nm處測定吸光度值。并以蘆丁作為標品，繪制標準曲線。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測定 取5 μL酵素樣品，用去離子水稀釋至2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）450 μL，于25 ℃恒溫反應30 min，以去離子水為空白對照溶液，在517 nm處測定吸光度[13]。自由基清除率計算如式（3）所示：

其中A0是空白對照液的吸光度，A1為樣品吸光度，A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.6 還原力的測定 取5 μL酵素樣品，去離子水補至1 mL，加入1 mL 10 g/L鐵氰化鉀，混合均勻，于50 ℃反應30 min，再加入1 mL 100 g/L三氯乙酸，混合均勻，靜置10 min取1 mL上清液，加入去離子水1 mL和200 μL 1 g/L三氯化鐵，混勻。以去離子水為空白對照溶液，在700 nm處測定吸光度[14]，還原力的強弱用吸光度大小來表示。

1.2.7 氧自由基吸收能力（oxygen-radical absorbance capacity，ORAC） 參考Grajedaiglesias等[15]方法略加改動。取10 μL藍莓酵素發(fā)酵液，用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋20倍得樣品待測液。向96孔板各孔加50 μL稀釋后的樣品，隨后每孔加入100 μL 0.02 μmol/L FL 37 ℃孵化20 min，迅速加入50 μL 30 mmol/L AAPH溶液，在激發(fā)波長480 nm和發(fā)射波長530 nm處連續(xù)測定100 min，每分鐘測定一次各孔熒光強度，直至熒光衰減呈基線為止，循環(huán)100次。配制1、2、4、8、16 μmol/L Trolox溶液，重復上述操作。計算結果以Trolox當量表示（μmol TE/mL）。

計算公式如下：

其中：f0為初始點熒光值；f100為第100次循環(huán)時的熒光值,fi為第i次循環(huán)時的熒光值；AUCsample、AUCblank，AUCFL分別為樣品組熒光信號積分面積、空白孔熒光信號積分面積（未加FL）和樣品空白組熒光信號積分面積。

1.2.8 線蟲培養(yǎng)和同期化 本文所用線蟲均在含有大腸桿菌OP50的NGM平板上，20 ℃下進行培養(yǎng)。取藍莓酵素與大腸桿菌OP50菌液（OD值=0.6）等體積混勻后，取40 μL涂布于NGM平板上。同期化后的線蟲分別在給藥板和只含有大腸桿菌OP50的NGM上培養(yǎng)[16]。

為保證實驗準確性，選取體內含有大量蟲卵的成蟲NGM板，用5 mL M9緩沖液反復沖洗平板，直至將大部分線蟲沖下并轉移至15 mL離心管中；8000 r/min離心2 min，棄上清后加入3 mL裂解液重懸，裂解3 min后加入5 mL M9緩沖液終止裂解；8000 r/min下離心1 min，棄去上清液；加入M9緩沖液重懸，洗滌3～5次。離心棄去上清液后，加入5 mL M9緩沖液，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，即得到大量L1期線蟲。

1.2.9 線蟲急性氧化應激實驗 同期化的L4期線蟲（蟲齡4 d）轉移至NGM給藥平板中（分別含有用E.coliOP50菌液稀釋10、20、40倍的藍莓酵素，并記作LM-10、LM-20、LM-40），其中對照組僅含E.coliOP50菌液。每板含50條線蟲。20 ℃培養(yǎng)2 d后，將各組線蟲轉移至24孔板中，記為急性氧化應激實驗的第0 h。每組6孔，每孔5條，孔內預先加入400 μL M9緩沖液（含終濃度為5 mmol/L H2O2）。每間隔1 h觀察線蟲存活及死亡數目并記錄，直至所有線蟲死亡[17]。

1.2.10 線蟲體內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量測定 線蟲分組處理同急性氧化應激實驗，孔內預先加入150 μL M9緩沖液。每孔加入終濃度25 μmol/L的DCFH-DA溶液，37 ℃避光反應，采用酶標儀于激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm處檢測熒光值。每間隔20 min檢測1次，共反應3 h，每次讀數前振蕩[18]。計算公式如下：

其中AUC樣品組、AUC對照組分別為樣品組和對照組熒光信號積分面積

1.2.11 線蟲體內丙二醛含量、抗氧化酶系水平的測定 線蟲分組處理同急性氧化應激實驗。用M9緩沖液將線蟲沖洗至離心管中，于4 ℃，1000 r/min離心10 min，去除上清液，重復清洗2～3次。加入0.5 mL M9緩沖液重懸線蟲，并于冰浴條件下超聲破碎2 min。超聲條件如下：超聲功率400 W，超聲2 s，間隔2 s。于4 ℃，12000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書步驟測定線蟲體內丙二醛（malondialdehyde，MDA）、抗氧化酶系水平及蛋白質濃度[19]。

1.3 數據處理

實驗數據以平均值±標準差（SD）的形式表示。采用Origin 8.6軟件繪制圖表，SPSS 24軟件進行相關性和單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總花青素含量變化

研究表明，藍莓中的花青素主要是飛燕草素、矮牽牛素、錦葵色素等，并且多以糖苷的形式存在，具有抗氧化、抗癌、抗動脈粥樣硬化、保護肝臟等功效[20]。本文參考植物酵素行業(yè)標準QB T 5323-2018對取樣間隔時間進行選擇。如圖1所示，發(fā)酵前期，花青素含量迅速上升，在發(fā)酵第50 d時達到了0.52±0.01 mg/mL，這可能是藍莓果中的花青素不斷溶出所形成的[21]。但隨后，花青素含量開始迅速下降并隨著發(fā)酵時間的延長下降速度逐漸減緩，直至300 d時趨于穩(wěn)定。這可能是隨著發(fā)酵的進行，總花青素通過微生物代謝轉化成了其他小分子物質如酚酸類物質。大量研究表明，在微生物作用下，花青素可被脫去糖基，轉化為酚酸和醛酮類等小分子物質。Cheng等[22]研究表明腸道菌群可將花青素轉化為綠原酸、隱綠原酸、阿魏酸等酚酸類物質，韋仕靜[21]研究發(fā)現桑葚酵素在發(fā)酵過程中花青素含量不斷下降，且伴隨著原兒茶酸、高香草酸、肉桂酸等酚酸類物質的增加。

圖1 發(fā)酵過程中總花青素含量的變化Fig.1 Changes of total anthocyanin content during fermentation

2.2 發(fā)酵過程中總酚含量變化

水果中的多酚及黃酮類物質能夠消除體內的自由基，并且攝入一定量的水果還可以減緩細胞氧化損傷、保護心腦血管、減少癌癥發(fā)生概率等[23]?？偡訕藴是€如下：y=0.0057x+0.0236R2= 0.9991。由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，藍莓酵素總酚含量不斷上升，發(fā)酵前40 d，總酚含量快速上升至2.45±0.02 mg/mL，一是由于多酚類物質不斷溶出，二是一些大分子酚類物質被微生物分解為小分子的酚類化合物[24]。發(fā)酵中后期，藍莓酵素總酚含量呈緩慢上升的趨勢，在發(fā)酵后期逐漸趨于穩(wěn)定。并在第300 d時達到2.81±0.02 mg/mL，這一結果要遠高于藍莓果酒[25]（1.31 mg/mL），總酚含量變化與花青素含量變化呈負相關性，這也符合上述花青素可能轉化為其他酚類物質的猜想。

圖2 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenolic content during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中黃酮含量變化

黃酮類物質具有抗氧化、抗炎、抗病毒等功效。富含黃酮的果蔬加工制品可以預防多種慢性疾病，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經退行性疾病。研究表明攝入一定量的黃酮類物質能夠有效預防糖尿病及其并發(fā)癥的產生與發(fā)展[26]。總黃酮標準曲線如下：y=0.3531x+0.0241R2= 0.9999。如圖3所示，在發(fā)酵前30 d，藍莓酵素總黃酮含量快速上升。隨著發(fā)酵的進行，總黃酮含量出現輕微波動，于發(fā)酵第300 d達到3.17±0.02 mg/mL，其值明顯高于文獻中報道的未經發(fā)酵的夏普藍1.18±0.07 mg/g、奧尼爾1.21±0.02 mg/g等[27]。上述結果表明，長期發(fā)酵有助于提高藍莓酵素中黃酮類物質的含量。

圖3 發(fā)酵過程中黃酮含量變化Fig.3 Changes of total flavonoid content during fermentation

2.4 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力變化

藍莓酵素發(fā)酵過程中對DPPH自由基清除能力的變化如圖4所示，隨著發(fā)酵時間的增長，DPPH自由基清除率呈現迅速上升后趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵前60 d，DPPH自由基清除能力快速上升至54.25%±0.46%。發(fā)酵第91 d，清除率達到最大值55.07%±0.93%，之后清除率變化趨于平穩(wěn)。Pertuzatti等[28]研究表明藍莓具有較好的清除DPPH自由基的能力，且其清除率變化趨勢與多酚，黃酮變化趨勢較為接近，由此推測藍莓酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化可能是多酚類物質有關。

圖4 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.4 Changes of DPPH radical scavenging activity during fermentation

2.5 發(fā)酵過程中還原力變化

如圖5所示，藍莓酵素在發(fā)酵過程中還原力呈現先迅速上升后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵40 d與發(fā)酵10 d相比，提高了40.63%；發(fā)酵到143 d后還原力達到最高0.357±0.01，之后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵300 d后，還原力提升了42.27%。這一結果要明顯高于蔣增良等[2]制備的藍莓酵素，說明發(fā)酵有助于提高還原力水平。

圖5 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.5 Changes of reducing power during fermentation

2.6 發(fā)酵過程中ORAC值變化

自由基是生物體生命活動中由細胞產生的中間產物，自由基的清除和產生應是處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，但當失去平衡時，大量的自由基堆積，易引起諸多疾病[29]。ORAC方法模擬了體內環(huán)境中抗氧化劑與自由基反應的情況，表示抗氧化物在特定的生理pH下對氧自由基的抑制作用。如圖6所示，隨著發(fā)酵的進行，藍莓酵素ORAC值逐漸增大，在91 d時達到最大值86.09±4.1 μmol TE/mL。相較于西蘭花酵素（12.23±0.21 μmol TE/mL）、藍莓果（67.5±1.2 μmol TE/mL）、葡 萄 酒 醋（11.5±1.1 μmol TE/mL）[30]，藍莓酵素的氧自由基的吸收能力更強。

圖6 發(fā)酵過程中氧自由基吸收能力（ORAC）變化Fig.6 Changes of oxygen-radical absorbance capacity during fermentation

2.7 發(fā)酵過程中體外抗氧化活性與活性成分相關性分析

對藍莓酵素發(fā)酵過程中的功能成分與體外抗氧化活性進行Pearson法相關性分析，結果如表1所示，藍莓酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化活性和總酚、總黃酮含量存在極顯著的相關性（P＜0.01），說明藍莓酵素中的多酚類物質和黃酮類物質具有抗氧化能力?？偡雍颗c總花青素存在極顯著的負相關性（P＜0.01），這一結果也與花青素含量下降可能是轉化成具有抗氧化活性的酚酸類小分子物質的猜想相符。

表1 發(fā)酵過程中各參數相關性Table 1 Correlation of parameters during fermentation

2.8 藍莓酵素對線蟲氧化應激能力的影響

綜合考量總酚、總黃酮、花青素等物質的變化情況及藍莓酵素體外抗氧化效果，選擇發(fā)酵第300 d的藍莓酵素進行線蟲實驗。研究表明，雙氧水會誘導線蟲體內細胞產生氧化應激反應[31]。如圖7所示，對照組、LM-40、LM-20，LM-10的平均壽命分別為7.95±0.58、8.4±0.51、9.05±0.50、9.7±0.51 h。相較于對照組，LM-10組生存曲線顯著右移（P＜0.05），表明藍莓酵素能夠顯著增強線蟲的抵抗氧化應激能力，從而減緩雙氧水對線蟲的氧化脅迫。藍莓酵素含有的黃酮、多酚等抗氧化活性成分，一方面可能抑制了與線蟲體內與自由基生成相關的酶如脂氧化酶、髓過氧化酶等的活性，另一方面抗氧化活性成分能夠增強線蟲體內抗氧化酶活性，從而起到抗氧化作用，因而提高了線蟲氧化應激能力[32]。

圖7 藍莓酵素對秀麗隱桿線蟲雙氧水刺激下壽命的影響Fig.7 Effect of blueberry Jiaosu on lifespan of C. elegans under hydrogen peroxide

2.9 藍莓酵素對線蟲體內ROS相對含量的影響

細胞內的ROS過量產生，會導致大量有害反應的發(fā)生，如脂質過氧化、DNA突變和蛋白質變性等，它與癌癥、心血管疾病，衰老等多種疾病密切有關[33]。由圖8可知，LM-40、LM-20、LM-10的ROS水平較對照組均顯著降低，分別減少了12.01%±7.49%、44.18%±7.49%和49.15%±3.75%，經藍莓酵素處理后可有效降低線蟲體內的ROS含量，且隨著藍莓酵素濃度的增加，線蟲體內的ROS含量逐漸減少，呈現一定的劑量依賴關系。

圖8 藍莓酵素對秀麗隱桿線蟲體內ROS含量的影響Fig.8 Effect of blueberry Jiaosu on ROS in C. elegans

2.10 藍莓酵素對線蟲體內MDA含量的影響

過量的ROS會與細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應，從而導致脂質過氧化終產物MDA的堆積。其具有一定的細胞毒性，因此其含量可以反映生物體內脂質過氧化的程度，間接反映出細胞受損情況。由圖9可知，相較于對照組，LM-40、LM-20，LM-10組線蟲體內MDA含量分別降低了17.14%±2.44%、27.56%±2.95%、52.44%±3.17%，且呈劑量依賴性。相較于對照組，實驗組均可極顯著抑制MDA的生成（P＜0.001）。鄭飛[34]研究表明藍莓中粗多糖可以顯著提高小鼠體內的超氧化物歧化酶和乳酸脫氫酶活性，并降低丙二醛含量，從而延長小鼠壽命。這與本實驗線蟲作為模型結果相一致。

圖9 藍莓酵素對線蟲體內MDA含量的影響Fig.9 Effect of blueberry Jiaosu on MDA in C. elegans

2.11 藍莓酵素對線蟲體內抗氧化酶的影響

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是內源性抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[35]?？梢源呋纸獍麅萇2?、·OH、H2O2等ROS基團，有利于維持機體的平衡狀態(tài)，延緩線蟲衰老[36]。由圖10a中可知，經藍莓酵素處理后能夠顯著提高線蟲體內SOD活力，且存在一定劑量依賴關系。相比與對照組，LM-40組、LM-20組、LM-10組分別提高了0.81、2.30、3.38倍（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。由圖10b可知，經藍莓酵素處理后，LM-40組、LM-20組、LM-10組CAT酶活分別為對照組的1.08、1.28、2.44倍，僅LM-10組的CAT水平較對照組顯著提升（P＜0.01）。由圖10c可知，各處理組的GSH-Px活力均無顯著性差異（P＞0.05），說明藍莓酵素對線蟲體內GSHPx活性無明顯影響，這與楊金月[37]的實驗結果一致，這可能是因為線蟲體內的主要抗氧化酶為SOD和CAT，兩者在抵御氧化損傷上起著關鍵作用[38]。由此可知，藍莓酵素主要通過上調SOD、CAT水平，以提升線蟲體內抗氧化能力，從而減緩衰老。Peng等[39]研究藍莓提取物可使果蠅的壽命延長10%并伴隨著SOD、CAT以及Rpn11相關基因的上調。Wang等[40]研究表明藍莓提取物可以通過上調抗氧化相關基因（sod-3、cat-1、mev-1、skn-1、sek-1和nhr-8）的表達，進而增加抗氧化酶基因的表達，提高線蟲對氧化應激的抵抗力，延緩線蟲的衰老。綜上所述，藍莓酵素可能是通過上調抗氧化基因實現了抗氧化應激能力的提升。

圖10 藍莓酵素對線蟲體內抗氧化酶的影響Fig.10 Effect of blueberry Jiaosu on antioxidant enzyme in C. elegans

3 結論

藍莓經長期自然發(fā)酵后，制備得藍莓酵素?？偡?、總黃酮含量有了顯著的提升；發(fā)酵第300 d，總酚含量達2.81±0.02 mg/mL，總黃酮含量達3.17±0.02 mg/mL?？偦ㄇ嗨睾砍尸F先上升后下降趨勢，花青素含量變化與總酚、總黃酮含量變化呈負相關性。通過體外抗氧化實驗（還原力測定、DPPH自由基清除實驗、氧化自由基吸收能力測定），證明發(fā)酵后藍莓酵素的體外抗氧化能力有了明顯的提高，分別可達0.347±0.01、53.86%±1.40%、77.88±1.49 μmol TE/mL，且抗氧化功效與總酚、總黃酮含量呈極顯著相關性。并以秀麗隱桿線蟲為模型，評價了藍莓酵素在體內的抗氧化水平。結果表明，藍莓酵素是通過上調了內源性抗氧化系統(tǒng)組成部分CAT與SOD的酶活水平并且降低線蟲體內的ROS和MDA含量，從而達到有效減緩由H2O2引起的氧化應激，延長線蟲的存活時間。本研究闡明了藍莓酵素發(fā)酵代謝產物及其與抗氧化功效間的相關性，并且為深入探究其作用機制奠定了理論基礎。