石其宇,董曉慶, ,黃世安,朱守亮,蔡明佳,周 亞,龔 鈺
(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/貴州省果樹工程技術(shù)研究中心, 貴州貴陽 550025;2.貴州省果樹蔬菜工作站, 貴州貴陽 550025)
蜂糖李(Prunus salicina)是在貴州省安順市鎮(zhèn)寧自治縣六馬鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)的地方優(yōu)良李品種[1],其口感好、甜度高,富含糖、酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及膳食纖維等多種營養(yǎng)成分[2],深受廣大消費者的青睞。蜂糖李屬于呼吸躍變型果實,采收期集中在高溫季節(jié),采后容易產(chǎn)生變軟、腐爛等諸多問題[3]。因此,尋求簡單高效的蜂糖李貯藏保鮮技術(shù)和方法,減少采后損失,提高商品附加值,是當(dāng)前急需解決的問題,也是近些年眾多學(xué)者所關(guān)注和研究的熱點。
草酸(Oxalic acid)遍布于自然界,是一種可被生物體代謝的安全無毒的有機酸。研究發(fā)現(xiàn),草酸處理能夠提高采后果實的抗病性,增強果實的抗氧化能力[4],具有延緩果實采后成熟與衰老、保持果實良好品質(zhì)的作用[5]。已有研究證明,草酸處理可以延緩香蕉[6]、番荔枝[7]、木瓜[8]等果實的采后成熟衰老進程。Kawaljit[9]等研究表明,草酸處理可有效減少梨果實的失重、腐爛,保持果實的營養(yǎng)和感官品質(zhì)。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)施用草酸可降低李果實乙烯的生成,延緩果實軟化,能有效延長李果實貨架期。草酸處理不僅能降低貯藏期間青芒果果實的軟化,增強其SOD等抗氧化酶的活性[11],還有助于提高采后芒果果實的抗病性[12],且對于提升采后獼猴桃果實品質(zhì)和抗病性有著良好的效果[13],同時對降低采后甜瓜果實紅粉病病害程度也具有明顯效果[14]。此外,草酸處理能有效提高番茄[15]、桃[16]、杏[17]以及哈密瓜[18]等果實的抗冷凍性,緩解果實冷害的發(fā)生,是延長果實低溫冷藏品質(zhì)行之有效的方法。草酸處理對抑制荔枝果皮[19]和鮮切蓮藕片[20]褐變的效果也極為明顯。
但是,關(guān)于草酸延遲貴州喀斯特山區(qū)地方性李品種蜂糖李采后果實貯藏品質(zhì)降低、延長果實貨架期,還未有過相關(guān)的報道。因此,本研究以蜂糖李果實為試材,從果實采后保鮮及抗氧化代謝的角度入手,研究采后使用0.5 mmol/L草酸處理對蜂糖李果實保鮮效果和抗氧化代謝的影響,并對其保鮮、抗氧化代謝的生理機制進行分析和探討,以期為蜂糖李果實保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
蜂糖李果實 于2019年6月16日采摘自貴州省六馬蜂糖李種植農(nóng)民專業(yè)合作社的一果園(105.52 E,25.37 N),采后立即運回貴州大學(xué)園藝實驗室進行處理;草酸、牛血清蛋白質(zhì)、二硫代硝基苯甲酸、抗壞血酸、紅菲咯啉、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、愈創(chuàng)木酚、核黃素 均為分析純,貴州省格瑞恩科技有限公司;蔗糖、苯酚、濃硫酸、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、EDTA-Na2·2H2O、還原型谷胱甘肽、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、硫代巴比妥酸、三氯化鐵、磷酸、KNO2、冰醋酸、無水醋酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100、30%H2O2、DTT、PVP、L-蛋氨酸、氮藍四唑、K2HPO4、KH2PO4、EDTA、PVPP 均為分析純,貴州省塞蘭博科技有限公司。
TEL-7001型呼吸儀 上海金梟儀器有限公司;GY-1型果實硬度計 廣州市銘睿電子科技有限公司;移液槍(1000 μL、100 μL) 德國Eppendorf公司;CP213型電子天平 昆山吉和力儀器有限公司;FA-2104型分析天平 上海啟閔生物科技有限公司;PAL-BX/ACD1糖酸度計 ATAGO公司;DK-98-II型雙列八孔電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;YG16W型臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;UV752紫外分光光度計 上海佑科儀器有限公司;DW-HL678型超低溫冰箱 成都川弘科生物技術(shù)有限公司。
1.2.1 樣品處理 將挑選好的成熟度一致(8成熟)、外觀整齊、大小相近、無病蟲害、無傷疤、無機械損傷的李果實放入0.5 mmol/L草酸溶液(前期預(yù)實驗篩選得出的最佳草酸處理濃度)中浸泡處理10 min,自然晾干,置于室溫(25±1) ℃下;以蒸餾水處理10 min的果實為空白對照(0 mmol/L),同樣自然晾干并置于室溫下。自蜂糖李果實采后0 d開始,直至果實采后21 d期間,每3 d測定相關(guān)指標并觀察記錄果實腐爛情況。
1.2.2 果實品質(zhì)指標
1.2.2.1 失重率測定 采用稱重法測定,失重率計算公式為:
式中:M1為采收當(dāng)天果實的初始重量(g);M2為試驗當(dāng)天果實的重量(g)。
1.2.2.2 腐爛率 以蜂糖李果實出現(xiàn)水漬狀褐變斑點、果實軟化腐敗、果皮皺縮褐變作為果實腐爛的判別依據(jù)。記錄并統(tǒng)計果實腐爛情況,失重率計算公式為:
1.2.2.3 呼吸速率測定 參考董曉慶等[21]方法。用CO2分析儀測定:將干燥器放入(25±1)℃的環(huán)境下,每個處理隨機取10個蜂糖李(單果質(zhì)量48 g左右),放入9.4 L的干燥器中,同時放入CO2分析儀,密封,每隔10 min讀數(shù)1次,讀數(shù)3次。結(jié)果以CO2計,單位mg/(kg·h)。
1.2.2.4 硬度測定 參考曹建康等[22]方法。每個重復(fù)隨機選取6個果實,在每個果實赤道部位兩側(cè)對稱取2個點,去皮(厚約1 mm),用硬度計(探頭直徑3.5 mm,測定深度10 mm)測定,結(jié)果以kg/cm2表示。
1.2.2.5 SSC、TA含量測定以及固酸比的計算 采用PAL-BX/ACD1糖酸度計進行果實SSC含量(%)和TA含量(%)的測定;固酸比=SSC/TA。
1.2.2.6 葉綠素含量測定 參考曹建康等[22]方法測定果實中葉綠素的含量。
1.2.2.7 可溶性糖、可溶性蛋白含量測定 參考曹建康等[22]的方法,采用苯酚-硫酸法測定果實可溶性糖;參考曹建康等[22]的方法,采用考馬斯亮藍染色法測定可溶性蛋白含量。
1.2.3 果實抗氧化代謝相關(guān)物質(zhì)指標
1.2.3.1 MDA含量的測定 參考曹建康等[22]方法測定果實中MDA的含量。
1.2.3.3 GSH、VC含量測定 參考曹建康等[22]方法測定果實中GSH、VC的含量。
1.2.4 果實抗氧化代謝相關(guān)酶活性指標 POD、SOD、CAT、APX活性測定 參考曹建康等[22]方法進行果實POD、SOD、CAT、APX等酶活性的測定。
使用軟件Microsoft Excel 2013對所獲得的實驗數(shù)據(jù)進行整理計算并繪圖。同時,在Microsoft Excel 2013數(shù)據(jù)分析模塊中采用t檢驗:平均值的成對二樣本分析對實驗結(jié)果進行差異顯著性分析。
由圖1-A可以看出,整個采后貯藏期間,經(jīng)草酸處理的蜂糖李果實失重率低于對照組果實。至21 d貯藏結(jié)束時,處理組失重率為26.22%,而對照組則達到了33.42%,果實經(jīng)處理后9~21 d期間,處理組和對照組果實之間失重率存在極顯著差異(P<0.01),草酸處理可抑制貯藏期間蜂糖李果實的失重。
如圖1-B所示,采后蜂糖李果實腐爛率呈上升趨勢。在經(jīng)過處理后,對照組果實腐爛率總是高于處理組。到第21 d時,對照組果實腐爛率為22.22%,處理組果實腐爛率為15.28%,處理組腐爛率比對照組低6.94%,兩者差異極顯著(P<0.01)。
果實失重率、腐爛率是衡量采后果實成熟衰老程度的重要指標。試驗結(jié)果顯示,草酸處理明顯抑制了蜂糖李果實失重率和腐爛率的上升。這說明草酸處理減少了貯藏過程中蜂糖李果實水分以及營養(yǎng)物質(zhì)的損失,延緩了果實成熟衰老的進程。這與草酸處理在獼猴桃[5]和青芒果[11]上的研究結(jié)論相一致。
蜂糖李為呼吸躍變型果實,在其成熟衰老的過程中會產(chǎn)生呼吸躍變,果實呼吸速率突然升高,出現(xiàn)明顯的呼吸高峰。如圖2所示,對照組果實呼吸高峰出現(xiàn)在采后第6 d,處理組果實呼吸高峰則出現(xiàn)在采后第9 d,二者呼吸強度峰值分別為89.20、71.85 mg/(kg·h),處理組比對照組低19.45%。兩組果實呼吸速率都呈現(xiàn)先下降再上升最后下降的趨勢。相比于對照組,處理組果實呼吸高峰的出現(xiàn)往后推遲了3 d。在采后6~15 d期間,處理組果實的呼吸速率顯著低于對照組(P<0.05)。
果實硬度、葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、SSC、TA等的含量以及固酸比與果實成熟衰老和果實品質(zhì)息息相關(guān)。果實可溶性糖含量的增加及果實硬度、TA含量、葉綠素含量等的下降是果實成熟衰老的體現(xiàn)。固酸比會影響果實風(fēng)味,而可溶性固形物、可溶性蛋白含量則是評價果實品質(zhì)和營養(yǎng)的重要指標。
在貯藏過程中,隨著果實成熟度的增加,果實軟化,硬度降低。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)草酸可降低多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酯酶(PE)的活性,抑制李果實軟化。從圖3-A可以看出,蜂糖李果實硬度隨著貯藏期的延長都呈下降趨勢,但在處理3 d后,草酸處理的蜂糖李果實相比較于對照其硬度下降幅度明顯減緩。到21 d時,處理組硬度為4.91 kg/cm2,而對照組則為2.73 kg/cm2。在6~21 d期間草酸處理組的硬度都大于對照組,且處理組和對照組之間差異極顯著(P<0.01)。可見,草酸處理可抑制貯藏期間蜂糖李果實硬度的下降,這可能是由于草酸降低了果實PG和PE的活性,從而抑制了果實硬度的下降。
圖3 草酸處理對蜂糖李果實硬度(A)、SSC(B)、TA(C)、固酸比(D)、可溶性糖含量(E)、可溶性蛋白含量(F)、葉綠素含量(G)的影響Fig.3 Effects of oxalic acid treatment on firmness(A), SSC(B), TA(C), SSC/TA(D), soluble sugar content(E), soluble protein content(F) and chlorophyll content(G) of Fengtang plum fruit
SSC能反映果實品質(zhì)和成熟度。如圖3-B所示,采后貯藏期間蜂糖李果實SSC大致呈上升而后開始下降的趨勢。對照組果實SSC自第0 d開始上升,在第12 d后開始下降,而處理組果實SSC則是在采后6~18 d階段呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。對照組果實SSC在第12 d達到最高值19.75%,而處理組則是在采后第18 d達到最高值20.62%。在采后6~12 d期間,處理組和對照組之間SSC差異顯著(P<0.05)。
TA含量是影響果實風(fēng)味及口感的重要因素。從圖3-C可看出,在貯藏期間,蜂糖李果實TA含量大體上呈下降趨勢,但在采后9~21 d期間,草酸處理組果實TA含量相比于對照組有略微上升的趨勢,這可能是由于草酸處理抑制了果實有機酸代謝相關(guān)酶活性的原因[23]。在果實處理后除第15 d對照組可滴定酸含量為0.92%高于處理組0.89%外,對照組果實TA含量均低于處理組,草酸處理果實與對照組果實之間TA含量存在顯著差異(P<0.05),在采后3 d和18 d二者差異達到極顯著水平(P<0.01)。這表明草酸處理可延緩蜂糖李果實采后貯藏期間其可滴定酸含量的下降。
如圖3-D所示,采后貯藏期間,蜂糖李果實固酸比整體呈上升趨勢。草酸處理后蜂糖李果實固酸比除第15 d值為21.08略高于對照組20.81外,其固酸比均低于對照組,在采后3~12 d期間,處理組果實和對照組果實固酸比差異達到了極顯著水平(P<0.01)。在采后第12 d,對照組果實固酸比達到最高值,為24.39,處理組果實固酸比則是在采后第15 d達到最高值21.08。
果實中可溶性糖含量的高低與其品質(zhì)、成熟度和貯藏性密切相關(guān)。從圖3-E可以看出,采后蜂糖李果實可溶性糖含量呈上升趨勢。貯藏期間,除第18 d外,草酸處理的蜂糖李果實可溶性糖含量均低于對照組。到第21 d時,處理組果實可溶性糖含量為9.96%,對照組為10.49%,略高于處理組。經(jīng)草酸處理的蜂糖李果實與對照組果實之間可溶性糖含量在第3、6、15、21 d差異顯著(P<0.05),第12 d時,處理組與對照組果實可溶性糖含量差異達到極顯著水平(P<0.01)。
從圖3-F可以看出,采后貯藏期間,蜂糖李果實可溶性蛋白含量大致呈先上升后下降的趨勢。對照組果實可溶性蛋白含量在采后第12 d達到了最高值0.18 mg/g,處理組果實可溶性蛋白含量則是在采后第9 d達到最高值0.17 mg/g。統(tǒng)計分析結(jié)果表明,處理組果實與對照組果實之間可溶性蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。
隨著采后果實的成熟衰老,其組織中的葉綠素含量不斷下降。如圖3-G所示,在采后貯藏過程中,蜂糖李果實葉綠素含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。貯藏期間第3、6、9 d以及第21 d,處理組果實葉綠素含量極顯著高于對照組(P<0.01)。經(jīng)草酸處理的果實葉綠素含量由第0 d的0.27 mg/g下降到第21 d的0.14 mg/g,對照組則是下降到0.10 mg/g,至第21 d時,兩組果實葉綠素含量間相差值為0.04 mg/g,這說明草酸處理可有效抑制采后蜂糖李果實組織中葉綠素的降解,延緩果實新鮮度的降低。
本試驗中,蜂糖李果實硬度的變化與劉鍇棟等[7]在番荔枝上的研究結(jié)果一致,可溶性蛋白及可溶性固形物含量的變化與其研究結(jié)果不一致,這可能是由于試驗材料、草酸濃度以及果實處理方式不同所引起的。果實葉綠素含量變化與程春梅等[24]在西蘭花上的研究結(jié)果一致,而果實可溶性糖以及TA含量的變化與喻最新等[25]在血橙和梁春強等[26]在獼猴桃上的研究結(jié)果相似。
從圖4-A可以看出,在采后貯藏期間,經(jīng)過草酸處理的蜂糖李果實MDA含量低于未經(jīng)草酸處理的蜂糖李果實。處理組果實MDA含量最高時為0.65 μmol/mg,而 對 照 組MDA含 量 最 高 時 為0.78 μmol/mg。經(jīng)草酸處理后3~9 d期間,處理組果實和對照組果實之間MDA含量差異顯著(P<0.05),在第3 d和第18 d二者差異可達到極顯著水平(P<0.01)。
生物膜過氧化是引起細胞膜結(jié)構(gòu)和功能喪失的重要原因,MDA則是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一,其水平是檢測有機體膜脂過氧化程度的一個公認的指標,可反映植物細胞膜過氧化的程度[27]。本試驗中,相比于對照組,草酸處理可在一定程度上降低蜂糖李果實采后貯藏期間的MDA含量。這與草酸處理在番茄[15]、桃[16]和荔枝[19]等果實上的研究結(jié)果相似。貯藏后期,MDA含量下降到較低水平,這可能是由于在貯藏后期蜂糖李果實糖含量的上升,從而影響了后期的試驗結(jié)果。
圖4 草酸處理對蜂糖李果實MDA含量(A)、產(chǎn)生速率(B)的影響Fig.4 Effects of oxalic acid treatment on MDA content(A),superoxide anion generation rate(B) of Fengtang plum fruit
在果蔬成熟衰老的過程中,大量積累的活性氧會打破代謝平衡,對植物細胞造成傷害[28]。而活性氧中的可引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用,使膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)遭到破壞,引起膜功能紊亂[29]。過氧化作用又會生成,如此循環(huán)往復(fù),對植物機體造成了嚴重傷害。試驗中,草酸處理顯著降低了采后蜂糖李果實產(chǎn)生速率,說明草酸處理可減輕各種自由基對果實機體的損害,這與草酸在獼猴桃[26]和哈密瓜[30]上的研究結(jié)果基本一致。
如圖5-A所示,采后蜂糖李果實的VC含量大體呈下降趨勢。貯藏期間,經(jīng)草酸處理的蜂糖李果實的VC含量整體上高于對照組。在第21 d時,對照組果實的VC含量為0.62 mg/100 g,處理組VC含量則為2.34 mg/100 g,此時處理組果實的VC含量接近于對照組的4倍。在采后第3 d以及15~21 d期間,草酸處理極顯著抑制了采后蜂糖李果實中VC的降解(P<0.01)。如圖5-B所示,貯藏期間,除第12 d外,草酸處理的蜂糖李果實GSH含量均高于對照組,采后6~21 d期間,除第15 d外,二者GSH含量差異顯著(P<0.05)。
VC是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一,是可在植物體內(nèi)合成的一類抗氧化物質(zhì)[31],具有很強的還原性,是衡量果實抗氧化衰老能力的因素之一,通過轉(zhuǎn)變?yōu)榘朊摎湫秃兔摎湫?VC可清除植物組織中的多種活性氧自由基[32]。GSH則可協(xié)助VC清除活性氧自由基,從而限制脂類過氧化,提高活性氧自由基的清除水平,增強植物機體的抗逆性,應(yīng)對氧化脅迫[33],對維持蛋白質(zhì)或酶的正常功能、維持細胞內(nèi)較高的還原勢具有重大意義。相比于對照組果實,草酸處理可有效減緩采后蜂糖李果實VC含量的降低,并將其GSH含量保持在較高的水平,本試驗中VC的含量變化與在番荔枝[7]和獼猴桃[26]的研究上得到的結(jié)果一致,而GSH的含量變化與鄭小林等[34]在杧果的研究上得到的結(jié)論相似。
如圖6-B所示,采后蜂糖李果實POD活性大致呈上升趨勢。到第21 d時,對照組果實的POD活性為0.79 U/g,處理組為0.90 U/g。貯藏期間,除第18 d外,處理組與對照組果實之間POD活性差異不顯著(P>0.05)。
CAT可催化植物體中的H2O2分解為水和氧氣,降低H2O2對植物有機體造成的氧化傷害。由圖6-C可以看出,采后蜂糖李果實的CAT活性大致呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。處理3 d后,草酸處理的蜂糖李果實CAT活性明顯高于對照組。草酸處理6 d后,處理組果實與對照組果實之間CAT活性差異極顯著(P<0.01),草酸處理可抑制蜂糖李果實CAT活性的下降。
APX具有抗衰老的作用,在植物體物質(zhì)代謝的過程中具有重要意義。如圖6-D所示,采后蜂糖李果實APX活性呈下降趨勢。在處理9~21 d時,除第12 d外,處理組果實APX活性極顯著高于對照組果實(P<0.01)。第21 d時,對照組果實APX活性為8.53(0.01ΔOD290/min·g),處理組則為17.60(0.01ΔOD290/min·g),其APX活性約為對照組的2倍。由以上分析可得出,草酸處理可有效延緩采后蜂糖李果實APX活性的降低。
果蔬組織中存在包括酶促保護系統(tǒng)和非酶促保護系統(tǒng)的兩類活性氧清除機制。SOD、CAT、POD、APX等是植物組織中重要的活性氧清除酶。SOD是一種重要的抗氧化酶,可與CAT、POD等酶協(xié)同作用來防御活性氧及其它過氧化物自由基對有機體的傷害,對植物組織中自由基、活性氧的代謝平衡具有重要意義[35]。CAT可分解植物組織中的H2O2,將H2O2歧化為無害化合物,保護植物細胞膜免受自由基傷害[36]。POD與果實抗病性、抗氧化性等密切相關(guān),具有清除H2O2以及胺類、醛類、苯類毒性的作用[37]。APX可催化VC與H2O2發(fā)生氧化還原反應(yīng),是植物體中VC-GSH氧化還原途徑中的重要組成部分,對清除植物組織中的H2O2具有重要意義[38]。本試驗結(jié)果表明,草酸處理能有效抑制蜂糖李果實中包括SOD、CAT、APX等酶活性的降低。但在試驗中草酸處理對蜂糖李果實POD活性的影響并不明顯。草酸處理對蜂糖李果實SOD活性變化的影響與沈玫等[39]在綠竹筍上的研究結(jié)果相一致,對CAT活性的影響結(jié)果與草酸在辣椒[40]上的研究結(jié)果一致。此外,草酸處理抑制蜂糖李果實APX活性的降低與在哈密瓜[33]上的研究結(jié)果相似,而對POD活性的影響與陳維維等[41]在梨果實上的研究結(jié)果相反,這可能是由于材料不同以及草酸處理濃度不同所造成的。草酸處理抑制了采后蜂糖李果實SOD、CAT、APX等酶活性的降低,這說明草酸處理有助于增強采后蜂糖李果實抗氧化能力。
草酸處理能有效延緩蜂糖李果實失重率、腐爛率、呼吸速率、固酸比、可溶性糖含量、MDA含量以及水平等的上升,對延緩果實軟化效果明顯,這說明草酸處理能延緩采后蜂糖李果實的成熟衰老進程。同時,草酸處理能抑制蜂糖李果實GSH含量,以及APX、CAT、SOD等酶活性的下降,說明草酸處理能提升蜂糖李果實的抗氧化能力。此外,貯藏期間草酸處理的蜂糖李果實品質(zhì)優(yōu)于對照組果實,具體表現(xiàn)為草酸處理抑制了采后蜂糖李果實TA、VC、葉綠素含量等的下降,并使果實SSC保持在較高的水平,說明草酸處理能在一定程度上維持采后貯藏期間蜂糖李果實的品質(zhì),保證果實具有較好的品質(zhì)和營養(yǎng)價值。但在試驗中,草酸處理對蜂糖李果實可溶性蛋白含量以及POD活性的影響效果并不明顯,需待進一步的研究和驗證。
本研究結(jié)果表明,草酸處理能夠延緩采后蜂糖李果實的成熟衰老進程,提升其抗氧化能力,抑制采后貯藏期間其果實品質(zhì)的降低,對蜂糖李果實具有良好的保鮮效果。因此,作為一種安全無毒的有機酸,草酸處理可作為采后蜂糖李果實保鮮的一種新方法。