高壓二氧化碳處理對鮮切荸薺褐變的影響

孔夢潔，張 嬌，李家興，胡婉峰, ，徐曉云，潘思軼

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070）

荸薺（Eleocharis tuberosa）作為我國特有的一種水生蔬菜，因其脆嫩、甘甜多汁等特點而受到眾多消費者的喜愛[1?2]。但荸薺帶有的淤泥和復雜的表面結構，增加了消費者的食用難度[3]。鮮切荸薺食用方便，能滿足消費市場的多元要求，近年來廣受消費者的青睞。

鮮切荸薺由于在加工過程中受到了嚴重的機械損傷，汁液外溢，使得酶和底物暴露于空氣之中，因此極易誘發(fā)果蔬組織褐變和一系列生理生化反應，降低鮮切荸薺的感官質量和營養(yǎng)價值[4]。有研究表明，導致鮮切荸薺黃化的主要物質可能為黃酮類和蒽醌類物質的混合物[5?6]，這些物質主要是通過苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生的，該途徑有多種酶共同參與，其中苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）作為苯丙烷代謝途徑第一步反應的關鍵酶和限速酶[7]，能將苯丙氨酸轉化為氨和肉桂酸，其活性的表達直接影響果蔬體內多酚類化合物的合成[8]。也有研究者認為鮮切荸薺的褐變與酶促氧化褐變有關[9]，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和 過 氧 化 物 酶（peroxidase，POD）均能作用于多酚類物質，將其轉變?yōu)轷?，醌類物質再進一步聚合形成褐色素，促使褐變的產(chǎn)生。目前，鮮切荸薺的護色方法主要有氣調保鮮及熱處理[10]、丁香酚[11]、乙醇[12?13]、檸檬酸[14?15]處理等方法。這些保鮮手段都能在一定程度上延長鮮切荸薺的貯藏期，但會對品質和風味產(chǎn)生不良影響[15?16]。同時，隨著消費者對食品安全的日益關注，人們對綠色環(huán)保、高效的保鮮加工手段的需求越來越迫切。

高壓二氧化碳（high-pressure carbon dioxide technology，HPCD）技術作為一種新型非熱加工技術，能有效避免熱加工過程造成的很多弊端，在果蔬加工領域應用廣泛，能夠最大限度地保持果蔬功能成分、營養(yǎng)成分和色澤[17?19]。同時，有研究表明，HPCD處理可以使果蔬汁中PPO、POD等褐變相關酶發(fā)生聚集和分解，二三級結構改變，導致相關酶活性降低或喪失[20?21]，從而達到理想的護色效果。目前HPCD技術的應用研究主要集中在抑制果蔬汁褐變領域，而在鮮切果蔬領域的應用及其對褐變控制機理的研究鮮有報道。本文以極易發(fā)生褐變的鮮切荸薺為研究對象，研究HPCD對鮮切荸薺的褐變抑制及貯藏品質的影響，為控制鮮切荸薺褐變的發(fā)生，延長其貯藏期提供理論基礎和技術支持，也為其他鮮切果蔬的褐變控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荸薺 華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)城菜市場；鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、L-苯丙氨酸、H2O2、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、碳酸氫鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑 生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸 分析純，上海源葉生物科技有限公司。

HA3000-30超臨界反應裝置 江蘇華安科研儀器有限公司；G200組織研磨儀 卡尤迪生物科技有限公司；Thermo Multskan GO 全自動酶標儀 美國Thermo 公司；HU-910IV-M標準型pH計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；5804 R離心分離機 德國 Eppendorf 公司；YS3060 3nh高精度色差計 蘇州九聯(lián)科技有限公司；TA.XT plus物理特性測試儀英國SMS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮切荸薺處理及貯藏 經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)較高壓強和較長時間的高壓二氧化碳處理會導致樣品在貯存過程中出現(xiàn)汁液流失現(xiàn)象，因此將本實驗的處理壓強設定為1、2、4 MPa，處理時間為5 min，具體處理方法如下：荸薺經(jīng)清洗去皮后，放入已預熱（31 ℃）的高壓二氧化碳反應釜中，待達到所需壓強和處理時間后。取出置于4 ℃冰箱中貯存，分別在0、2、4、6、8 d隨機取樣進行色澤和硬度測定，同時將部分樣品立即用液氮冷凍，再放置于?80 ℃冰箱貯存，用于其他指標的測定。每組選用90個果實，設置3次重復。

1.2.2 色澤測定 鮮切荸薺的色澤采用色差計進行測定。黑板、白板進行校正后，隨機選取6個荸薺并且每個荸薺上選擇五個點進行測定后取平均值。

1.2.3 硬度測定 參照田維娜[22]方法，采用質構儀測定樣品硬度，具體參數(shù)設置如下: P/5圓柱測試探頭，采用TPA操作模式，測試前速率為5.0 mm/s，測試速率為2.0 mm/s，測試后速率為2.0 mm/s，時間為5.00 s，壓力為10 g。每個處理測定20片荸薺樣品，結果取平均值。

1.2.4 PPO活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取2 g樣品，加 入8 mL磷酸緩 沖液（PBS，pH6.8，0.2 mol/L），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為PPO粗酶液。取上清液100 μL于酶標條（PBS作為空白對照），加入200 μL鄰苯二酚（0.2 mol/L），在420 nm下測定反應體系3 min內的吸光值變化。定義每分鐘內，吸光值每變化0.001，為1個單位的PPO酶活，記作1 U。

1.2.5 POD活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取2 g樣品，加入8 mL磷酸緩沖液（PBS，pH 6.8，0.2 mol/L），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為POD粗酶液。取上清液100 μL于酶標條（PBS作為空白對照），同時加入100 μL雙氧水（2%）和100 μL愈創(chuàng)木酚（0.25 mol/L），在470 nm下測定反應體系3 min內的吸光值變化。定義每分鐘內，吸光值每變化0.001，為1個單位的POD酶活，記作1 U。

1.2.6 PAL活性測定 參照Zhang等[23]方法，稱取5 g樣品加入0.5 g PVP和15 mL硼酸緩沖液（BBS，0.2 mol/L，pH 8.7，含0.05 mmol/Lβ-巰基乙醇），充分研磨后，于10000×g下離心20 min，上清液即為PAL粗酶液。取上清液1 mL（BBS作為空白對照），加入2 mL BBS和1 mL苯丙氨酸（0.2 mol/L），37 ℃水浴下反應1 h，反應結束后迅速加入200 μL鹽酸（6 mol/L）終止反應，于290 nm處測定吸光值。定義每小時，吸光值每變化0.001，為1個單位的PAL酶活，記作1 U。

1.2.7 總酚含量測定 總酚含量采用福林酚法[24]測定。稱取2 g樣品，加5 mL 50%甲醇，充分研磨后，于12000×g離心15 min。取0.5 mL 上清液加入1 mL的福林酚試劑、2 mL 7.5% Na2CO3溶液，避光90 min，760 nm測定吸光值。取不同濃度的沒食子酸標準溶液，根據(jù)上述同樣的方法，測定吸光值，進行標準曲線的繪制。得到線性回歸方程：y=14.561x+0.0663，R2=0.9947，根據(jù)沒食子酸標準曲線計算樣品中總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 25對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，采用originPro8.5繪圖軟件作圖。每次實驗至少進行三個重復。

2 結果與分析

2.1 HPCD處理對鮮切荸薺褐變的抑制

荸薺經(jīng)過鮮切處理之后，由于受到機械損傷，極易發(fā)生褐變現(xiàn)象[25]。如圖1所示，對照組鮮切荸薺經(jīng)過8 d的貯藏之后已經(jīng)嚴重褐變，失去了食用價值。經(jīng)1 MPa處理之后的鮮切荸薺，在貯藏8 d后出現(xiàn)了輕微的褐變現(xiàn)象。而經(jīng)2 MPa和4 MPa處理后的鮮切荸薺在整個貯藏期內都沒出現(xiàn)褐變現(xiàn)象，保持了較高的商品價值。從圖1可以直觀地感受到HPCD處理可有效抑制鮮切荸薺的褐變，維持其較高的商品價值。

圖1 HPCD處理對鮮切荸薺褐變的抑制效果（4 ℃，8 d）Fig.1 The inhibitory effect of HPCD processing on fresh-cut CWC browning（storage at 4 ℃ for 8 days）

2.2 HPCD處理對鮮切荸薺色澤的影響

L*值的大小反映的是樣品表面的亮度，L*值越大樣品表面越明亮。b*值反映的是樣品表面的藍黃值，當b*為正值時，其值越大表明樣品表面顏色越黃；b*為負值時，其絕對值越大表明樣品表面藍色程度越深。由圖2 a可以看出，未處理組鮮切荸薺的L*值在第2 d開始出現(xiàn)急劇的降低，表明未處理組隨著貯藏期的延長，鮮切荸薺表面逐漸出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。經(jīng)HPCD處理后的鮮切荸薺，在整個貯藏期內的L*值變化較為緩慢，在貯藏的第8 d仍然保持較高的L*值。由圖2 b可以看出，未處理組鮮切荸薺在整個貯藏期內的b*值變化較大，為正值，表明鮮切荸薺發(fā)生黃化。經(jīng)過1 MPa處理的鮮切荸薺的b*值在第6 d開始逐漸增加，這與貯藏后期出現(xiàn)的褐變現(xiàn)象一致。4 MPa處理組的b*值在整個貯藏期內基本保持不變。鮮切荸薺L*值與b*值在整個貯藏期中的變化表明，HPCD處理可以有效抑制鮮切荸薺的褐變。

圖2 HPCD處理對鮮切荸薺色澤的影響Fig.2 Effects of HPCD treatment on the color in fresh-cut CWC during storage

2.3 HPCD處理對鮮切荸薺硬度的影響

如圖3所示，鮮切荸薺的硬度隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢。未處理組鮮切荸薺的硬度在貯藏4 d后出現(xiàn)了急劇降低。經(jīng)1 MPa和2 MPa處理后的鮮切荸薺在貯藏周期內硬度變化較小。在貯藏6 d時，1 MPa和2 MPa處理的鮮切荸薺的硬度分別為未處理組的1.19和1.21 倍。而經(jīng)較高的壓強（4 MPa）處理的鮮切荸薺的硬度在貯藏后期急劇降低，表明此處理條件對鮮切荸薺的硬度有不利的影響。

圖3 HPCD 處理對鮮切荸薺硬度的影響Fig.3 Effects of HPCD treatment on the hardness in fresh-cut CWC during storage

2.4 HPCD處理對鮮切荸薺PPO活性的影響

PPO在酶促褐變中扮演著重要的角色，在氧氣存在的情況下，多酚氧化酶可以催化酚類物質氧化為醌類物質，醌類物質又會進一步聚合導致顏色進一步加深[26?27]。由圖4可以看出，多酚氧化酶的活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與未處理組相比，HPCD處理后PPO的活性在第0 d出現(xiàn)了降低，且抑制效果與處理壓強呈正比。經(jīng)HPCD處理后的果汁中也出現(xiàn)了同樣的結果，這可能是由于HPCD處理會改變PPO的構象，同時CO2在水溶液中的溶解度較高，形成碳酸造成酶所處環(huán)境pH的改變，進而改變了PPO的活性[28?29]。但隨著貯藏時間的延長，處理組PPO的活性顯著高于未處理組（P＜0.05），并在隨后的貯藏期內始終高于未經(jīng)處理組。

圖4 HPCD處理對鮮切荸薺PPO活性的影響Fig.4 Effects of HPCD treatment on the activities of polyphenol oxidase in fresh-cut CWC during storage

2.5 HPCD處理對鮮切荸薺POD活性的影響

POD在果蔬的光合作用、呼吸作用以及生長素氧化等生理活動中起重要的作用，與果蔬的成熟衰老有著較為復雜的關系。POD可以H2O2為電子受體催化酚類物質氧化，與果蔬的色澤密切相關[27,30]。由圖5可知，在整個貯藏期內，鮮切荸薺中的POD活性先呈現(xiàn)上升的趨勢，在第2 d達到最高活性之后，逐漸降低。而經(jīng)4 MPa處理之后，鮮切荸薺中POD活性最高峰在第4 d出現(xiàn)，可以看出，HPCD處理會在一定程度上推遲POD活性峰值的出現(xiàn)。第0 d，HPCD處理與未處理組相比未見顯著差異（P＞0.05），隨著貯藏周期的延長POD呈現(xiàn)激活的狀態(tài)。第4 d，經(jīng)4 MPa處理后的鮮切荸薺中POD活性顯著升高，為未處理組的1.67倍（P＜0.05）。

圖5 HPCD處理對鮮切荸薺POD活性的影響Fig.5 Effects of HPCD treatment on the activities of peroxidase in fresh-cut CWC during storage

2.6 HPCD處理對鮮切荸薺PAL活性的影響

PAL是植物苯丙烷代謝途徑中關鍵限速酶，催化L-苯丙氨酸脫氨轉化為反式肉桂酸，生成的反式肉桂酸可以作為合成其他酚類物質的底物[8]。因此，PAL活性對植物中酚類物質等次生代謝產(chǎn)物的含量起著決定性作用。由圖6可知，未處理組PAL活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并在4 d達到最高活性。第4 d，經(jīng)1 MPa和2 MPa處理后的PAL活性分別為對照組的51.2%、40.9%，表明HPCD處理可以顯著抑制PAL活性（P＜0.05）。經(jīng)4 MPa處理后的PAL活性在整個貯藏期內并沒顯著的變化（P＞0.05），而經(jīng)1 MPa處理后的PAL活性在貯藏后期逐漸增加。

圖6 HPCD處理對鮮切荸薺PAL活性的影響Fig.6 Effects of HPCD treatment on the activities of phenylalanine ammonialyase in fresh-cut CWC during storage

2.7 HPCD處理對鮮切荸薺總酚含量的影響

果蔬組織中酚類是酶促褐變發(fā)生的根本基礎[31]，酚類物質作為酶促褐變的底物已經(jīng)在蘋果[26]、蓮藕[32]、馬鈴薯[33]等多種果蔬的研究中得到證實。由圖7可知，隨著貯藏長時間的延長，對照組鮮切荸薺中的多酚含量逐漸增加，這可能是由于PAL活性的增加促進了多酚物質的積累。HPCD處理組在貯藏后期顯著抑制多酚含量的積累。在6 d，經(jīng)2 MPa和4 MPa處理的鮮切荸薺中多酚含量僅為未處理組的30%和24%。經(jīng)4 MPa處理后，鮮切荸薺中多酚類物質含量在整個貯藏期內變化不顯著（P＞0.05）。因此，HPCD處理可以通過抑制PAL活性，降低鮮切荸薺中多酚類的合成，從而有效保持鮮切荸薺的色澤。

圖7 HPCD處理對鮮切荸薺總酚含量的影響Fig.7 Effects of HPCD treatment on the contents of total phenols in fresh-cut CWC during storage

3 結論

HPCD處理可以有效地抑制鮮切荸薺的褐變，2 MPa處理有效地減緩硬度和L*值的降低，激活PPO、POD，使鮮切荸薺的抗逆能力有一定的提高，延長貯藏期。同時抑制苯丙烷代謝途徑中關鍵酶PAL活性，降低鮮切荸薺中酚類物質的合成和積累，抑制鮮切荸薺在貯藏過程中的褐變。因此2 MPa處理可以延緩鮮切荸薺貯藏品質劣變的進程。