黃金茶揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化、成分分析及抗氧化研究

萬 敏，姚于飛，付王威，吳睿婷，游慧婷，景 智，李文娟,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西南昌 330006；3.南昌大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330006）

山臘梅常見于安徽、江蘇、江西、福建和貴州等地，是江西省上饒市婺源縣山區(qū)特色資源[1]。山蠟梅的嫩葉，可經(jīng)加工制作而成的功能性綠茶，因資源珍稀、功效奇特，被譽為“綠葉黃金”，命名為黃金茶。黃金茶為不發(fā)酵茶，通過揉捻等工藝制得，民間一直將其作為清涼解暑，健胃消食，治腹脹痛，止咳除煩的“藥食同源”的天然食材，經(jīng)常飲用對身體具有一定的防護(hù)作用，現(xiàn)代臨床實驗證實，黃金茶具有良好的止咳平喘、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)消化、減少體脂等作用[2]。黃金茶的活性成分繁復(fù)，主要含有揮發(fā)油、多糖、生物堿、黃酮、香豆素、鯊肌醇、東莨菪苷、異嗪皮啶等物質(zhì)。黃金茶香味濃郁，揮發(fā)油含量高，被認(rèn)為是黃金茶中的主要活性成分[3]。目前有關(guān)茶飲品的活性功能研究中，抗氧化能力是體現(xiàn)其功效的重要指標(biāo)[4]。大量研究已證實，有效清除自由基，抑制活性氧的形成的作用，是綠茶多種活性功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。然而國內(nèi)外對黃金茶揮發(fā)油的抗氧化活性研究未見報道。

目前，揮發(fā)油的提取方法研究較多，如水蒸氣蒸餾法[6]、同時蒸餾萃取法[7]、超臨界流體萃取[8]、固相微萃取技術(shù)[9]等。常規(guī)提取黃金茶揮發(fā)油的方法主要集中在水蒸氣蒸餾法，此方法設(shè)備要求不高，操作簡單，但得率較低[10?11]。同時蒸餾萃取法優(yōu)點是實驗簡單，操作方便，溶劑用量較少，安全環(huán)保，缺點是試驗所需溫度較高，揮發(fā)油部分成分易揮發(fā)，且揮發(fā)油組分復(fù)雜，當(dāng)蒸餾溫度過高時，樣品會發(fā)生水解、氧化或熱分解現(xiàn)象[12]。超臨界流體萃取法是比較新穎和熱門的提取方法，提取得率較高，但設(shè)備要求也較高，生產(chǎn)會比較受到限制[13?14]。微波輔助水蒸氣蒸餾法被定義為從植物中提取揮發(fā)油的一種替代方法，微波輔助萃取具有諸多優(yōu)點，選擇性高、溶劑消耗量少等，且易于操作，適用面較廣[15?16]，但微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報道用。

因此，本文主要研究在微波輔助水蒸氣蒸餾法提取過程中微波時間、料液比和水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發(fā)油得率的影響，從而選出提取黃金茶揮發(fā)油最佳工藝。并且，本實驗在金茶揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，應(yīng)用GC-MS對黃金茶揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行分析同時，進(jìn)一步研究黃金茶揮發(fā)油的抗氧化作用，旨在為黃金茶的綜合利用提供新的技術(shù)支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃金茶 由江西省婺源婺源縣龍塢山蠟梅專業(yè)合作社于2019年6月采摘山臘梅嫩葉，并制備而成；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT） 購于美國Sigma公司；正己烷、無水硫酸鈉、無水乙醇、鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、三氯化鐵、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、氯化鈉、菲啰嗪 均為國產(chǎn)分析純，購于西隴化工股份有限公司。

METTLER TOLEDO AL104電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Anke TGL-16G-A高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；M1-L201B型微波爐 美的制冷家電集團；SKM型數(shù)顯恒溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；UT6紫外可見分光光度計 屹譜儀器制造（上海）有限公司；Milli-Q plus超純水儀 購于美國Millipore公司；7890A-5975C GC-M聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃金茶揮發(fā)油的制備 稱取40 g黃金茶樣品，超純水浸泡后微波處理，待冷卻后應(yīng)用于水蒸氣蒸餾法提取，分別以微波時間（5、10、15、20和25 min）、料液比（1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL）和水蒸氣蒸餾時間（2、3、4、5和6 h）的3個因素進(jìn)行試驗，考察單因素對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。提取過程中保持微沸狀態(tài)，收集餾出液，加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，得到黃金茶揮發(fā)油，計算得率。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 微波時間對黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡，分別以微波時間（5、10、15、20和25 min）對樣品進(jìn)行微波處理，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，考察微波時間對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。

1.2.2.2 料液比對黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比（1:20、1:25、1:30、1:35和1:40 g/mL）浸泡，微波處理10 min，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，考察料液比對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。

1.2.2.3 水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發(fā)油得率的影響 稱取40 g黃金茶樣品，在超純水中用料液比1:30 g/mL浸泡，微波處理10 min，待冷卻后采用水蒸氣蒸餾法提取2、3、4、5和6 h，考察水蒸氣蒸餾時間對微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的影響。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗來確定微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的最佳生產(chǎn)工藝，試驗因素為微波時間、料液比和水蒸氣蒸餾時間。試驗設(shè)計如表1所示。正交試驗完成后進(jìn)行驗證試驗，分別稱取黃金茶3份，根據(jù)優(yōu)化提取工藝驗證，計算其揮發(fā)油得率，取三次平均值與正交試驗結(jié)果比較，得到的揮發(fā)油在0～4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.4 黃金茶揮發(fā)油得率的計算

式中，m1：黃金茶揮發(fā)油重量，g；m0：黃金茶重量，g；W，黃金茶揮發(fā)油得率，%。

1.2.5 GC-MS分析黃金茶揮發(fā)油組成

1.2.5.1 樣品的前處理 精密量取最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油7.5 μL，加入1.5 mL正己烷，并用無水硫酸鈉除水，5000 r/min離心10 min，取上清液得到待測溶液，通過0.22 μm有機濾膜過濾后直接進(jìn)樣分析。

1.2.5.2 色譜條件 HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱（250 μm×30 m, 0.25 μm），載氣為高純氮氣，柱流量為1.0 mL·min?1，進(jìn)樣量為1 μL，分流進(jìn)樣，分流比20:1，進(jìn)樣口溫度280 ℃，升溫程序：柱溫70 ℃，保持2 min，10 ℃·min?1的速率升至100 ℃，隨后以2 ℃·min?1的速率升至123 ℃并保持3 min，再以5 ℃·min?1的速率升至160 ℃，10 ℃·min?1的速率升至220 ℃，2 ℃·min?1的速率升至230 ℃并保持5 min。

1.2.5.3 質(zhì)譜條件 接口溫度280 ℃，電子轟擊（EI）能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS回級桿溫度150 ℃溶劑延遲7 min，全掃描，質(zhì)荷比20～500 amu。結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫并查閱文獻(xiàn)對揮發(fā)油組分進(jìn)行鑒定，采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。

1.2.6 黃金茶揮發(fā)油抗氧化活性測定

1.2.6.1 對DPPH自由基的清除作用 參考尹術(shù)華等[17]和Nuengchamnong等[18]，現(xiàn) 配 濃 度 為2×10?4mol/L的DPPH自由基溶液，取最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油和BHT分別用無水乙醇稀釋為10.00、20.00、40.00、60.00、80.00和100.00 mg/mL待測液，分別取0.05 mL樣品溶液加入2 mL EP管中，然后加入0.2 mL DPPH自由基溶液，再加入0.05 mL乙醇渦旋混勻，避光30 min，517 nm測定吸光度值A(chǔ)，記為A2；對照組將0.2 mL DPPH自由基溶液更換為0.2 mL乙醇進(jìn)行試驗，517 nm測定吸光度值A(chǔ)，記為A1；空白組將0.05 mL黃金茶揮發(fā)油更換為0.05 mL乙醇進(jìn)行試驗，517 nm測定吸光度值A(chǔ)，記為A0。

根據(jù)公式計算清除率I（%）：

1.2.6.2 還原力的測定 參考Zhao等[19]和吳楊洋等[20]，測定前將最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油、BHT分別用無水乙醇稀釋成10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/mL濃度的待測液。把0.75 mL的1%的鐵氰化鉀溶液、0.75 mL的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和0.75 mL的待測液相互混合，在向其中加入0.75 mL的10%的三氯乙酸，在4 ℃的條件下離心10 min（3000 r/min）。離心后取1.5 mL上清液，加入1.5 mL的蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液，完全混勻后，在室溫下靜置反應(yīng)10 min。然后在700 nm處測定其吸光度，記錄吸光度值為A，用蒸餾水做空白調(diào)零。

1.2.6.3 金屬離子螯合能力 參考劉瓊等[21]實驗，最優(yōu)工藝條件下制備的黃金茶揮發(fā)油用無水乙醇稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL 濃度的黃金茶揮發(fā)油待測液，乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2）用超純水稀釋成5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 mg/mL濃度的乙二胺四乙酸二鈉待測液，分別配好實驗使用試劑，50 μmol/L的FeSO4溶液、0.15 mol/L的NaCl溶液和300 μmol/L的菲啰嗪。分別取0.2 mL待測液加入4 mL EP管中，依次加入0.2 mL FeSO4溶液、1.4 mL NaCl溶液和0.2 mL菲啰嗪，混勻，靜置10 min，562 nm處測定吸光值A(chǔ)2；對照組將0.2 mL待測液更換為0.2 mL超純水進(jìn)行試驗，562 nm處測定吸光值A(chǔ)0；空白組將0.2 mL菲啰嗪更換為0.2 mL NaCl溶液進(jìn)行試驗，562 nm處測定吸光值A(chǔ)1。

根據(jù)公式計算樣品對金屬鐵離子的螯合活性I（%）：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 22.0軟件處理和分析微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油實驗中所得數(shù)據(jù)，并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波時間的確定 由圖1可知，隨著微波時間的增加，黃金茶揮發(fā)油得率有所增加，但幅度不大。當(dāng)微波時間超過10 min之后，黃金茶揮發(fā)油得率緩慢降低，微波時間為25 min時，得率快速下降。這可能是因為微波對黃金茶茶葉細(xì)胞破壞其細(xì)胞膜的作用，微波處理時間越長，細(xì)胞被破壞的程度就越大，被釋放到環(huán)境中的活性化合物也越多，從而揮發(fā)油得率增加。但當(dāng)處理黃金茶揮發(fā)油的微波時間超過10 min之后，由于內(nèi)部過熱，極性水導(dǎo)致植物體內(nèi)的壓力梯度增加細(xì)胞被劇烈破壞，細(xì)胞壁破裂，從而油更容易被釋放到周圍溶液當(dāng)中去，從而降低了黃金茶揮發(fā)油得率[22]。因此最佳微波時間為10 min。

圖1 微波時間對黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.1 Effects of microwave time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.1.2 料液比的確定 從圖2可知，料液比越高，黃金茶揮發(fā)油得率越高，但料液比超過1:30時，黃金茶揮發(fā)油得率降低。這是因為料液比較低時，茶葉與水接觸面積較小，浸潤度較低，不利于揮發(fā)油釋放，導(dǎo)致得率較低，也容易發(fā)現(xiàn)結(jié)焦現(xiàn)象。隨著料液比的增加，更多的極性水進(jìn)入黃金茶茶葉細(xì)胞，水在加熱時迅速升溫，加快細(xì)胞破裂使得揮發(fā)油能較多的被水蒸氣帶出，得率增加。但當(dāng)料液比過高時，黃金茶揮發(fā)油在水中的溶解變大，導(dǎo)致部分油損失在水介質(zhì)中，且液面過厚也會影響微波的吸收[22]。因此最佳料液比為1:30。

圖2 料液比對黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.2 Effects of ratio of material to liquid on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.1.3 水蒸氣蒸餾時間的確定 由圖3可知，隨著水蒸氣蒸餾時間的增加，黃金茶揮發(fā)油得率增加。當(dāng)水蒸氣蒸餾時間超過5 h之后，黃金茶揮發(fā)油得率降低。結(jié)合文獻(xiàn)報道[23]，推測隨著時間的增加，黃金茶揮發(fā)油不斷的隨著水蒸氣從黃金茶茶葉中分離出來，但過長的時間導(dǎo)致?lián)]發(fā)油被破壞或除介質(zhì)，使得黃金茶揮發(fā)油得率下降。因此，最佳水蒸氣蒸餾時間為5 h。

圖3 水蒸氣蒸餾時間對黃金茶揮發(fā)油得率的影響Fig.3 Effects of steam distillation time on the yield of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

2.2 正交試驗結(jié)果分析

以黃金茶揮發(fā)油得率為評價指標(biāo)，每次試驗重復(fù)三次，取平均值。通過表2可知，微波時間對揮發(fā)油得率影響最大，其他依次是水蒸氣蒸餾時間、料液比，最佳工藝是A2B2C2，即微波時間10 min，料液比1:25 g/mL，水蒸氣蒸餾時間5 h。由表3可知，微波時間、水蒸氣蒸餾時間對試驗結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），這與極差分析結(jié)果一致。根據(jù)優(yōu)化提取工藝驗證，揮發(fā)油得率分別為1.7987%、1.7684%、1.7706%，平均值為1.7792%，高于正交試驗結(jié)果，重現(xiàn)性好，確定優(yōu)化提取工藝為A2B2C2。

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Tests of Between-Subjects effects

2.3 GC-MS結(jié)果分析

對黃金茶揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS檢測分析，共分離出23個峰，并采用面積歸一化法計算黃金茶揮發(fā)油各組分相對含量，總離子流圖見圖4，黃金茶揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)顯示，有21種成分被鑒定出，鑒定出的物質(zhì)成分占總峰的93.27%，黃金茶揮發(fā)油主要以萜類化合物為主，是該揮發(fā)油香氣的主要成分。在鑒定出的化合物中，相對含量在1%以上的有15種，占被檢測物質(zhì)總量的88.75%，其中（1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環(huán)己基）乙酸酯的含量達(dá)到50.67%，其次是α-蒎烯（6.92%）、α-乙酸松油酯（5.77%）、環(huán)氧化蛇麻烯II（3.96%）、偽檸檬烯（3.21%）、右旋大根香葉烯（3.12%）等。

圖4 黃金茶揮發(fā)油的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion flow chromatography of Chimonanthus nitens Oliv essential oil

表4 黃金茶揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果Table 4 GC-MS analysis of essential oil from Chimonanthus nitens Oliv

目前黃金茶揮發(fā)油組分的相關(guān)檢測研究未見報道。徐年軍等[10]報道了山臘梅葉中揮發(fā)油成分分析，與本實驗獲得的黃金茶揮發(fā)油的組分對比發(fā)現(xiàn)主要成分相似，但也有一定的差異，主要體現(xiàn)在成分（1-甲基-4-丙-1-烯-2-基環(huán)己基）乙酸酯的不同，黃金茶中該乙酸酯含量為50.67%。與山臘梅相比，黃金茶揮發(fā)油成分的差異因素，可能與黃金茶的制備或揮發(fā)油的提取過程有關(guān)：原材料山臘梅葉中醇類物質(zhì)在熱環(huán)境下氧化合成為酯類物質(zhì)，但確切的因素需要實驗進(jìn)一步研究。

2.4 黃金茶揮發(fā)油抗氧化活性測定

2.4.1 黃金茶揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用DPPH自由基的還原能力能使深紫色溶液被中變成無色或淺黃色，這可以作為評價抗氧化的方法[24?25]。結(jié)果表明，在各濃度梯度中黃金茶揮發(fā)油呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，如圖5所示，其清除DPPH自由基能力隨著濃度的升高而增大，黃金茶揮發(fā)油的IC50為81.60 mg/mL，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/mL時，清除作用達(dá)到56.13%，而2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）的清除率達(dá)到95.42%，與BHT相比較，黃金茶揮發(fā)油對DPPH自由基的清除作用低于BHT的抗氧化作用。以上結(jié)果顯示，黃金茶揮發(fā)油具有一定DPPH自由基的清除作用。

圖5 DPPH自由基清除作用Fig.5 DPPH free radical scavenging effect

2.4.2 黃金茶揮發(fā)油對還原力的測定 實驗結(jié)果如圖6所示，黃金茶揮發(fā)油在10 mg/mL時與陽性對照組還原力最為接近，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時，還原力處于緩慢上升的趨勢，黃金茶揮發(fā)油濃度在40～50 mg/mL時還原力呈現(xiàn)快速上升趨勢，但相比較于BHT，黃金茶揮發(fā)油對鐵離子的還原能力較弱。以上結(jié)果表明黃金茶揮發(fā)油具有較強的還原力。

圖6 還原力的測定Fig.6 Reduction force determination

2.4.3 黃金茶揮發(fā)油對金屬離子螯合能力的測定 如圖7所示，黃金茶揮發(fā)油對金屬離子螯合能力的IC50為17.16 mg/mL，且黃金茶揮發(fā)油對亞鐵離子螯合能力隨呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到40 mg/mL時，金屬離子螯合能力達(dá)到81.06%，此時，EDTA的金屬離子螯合能力達(dá)到93.94%，與EDTA相比，黃金茶揮發(fā)油的金屬離子螯合能力較低。以上結(jié)果可知黃金茶揮發(fā)油具有的螯合亞鐵離子能力。

圖7 金屬離子螯合能力Fig.7 Chelating ability of metal ions

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交試驗確認(rèn)微波輔助水蒸氣蒸餾法提取黃金茶揮發(fā)油的最優(yōu)工藝為微波時間10 min，料液比1:25 g/mL，水蒸氣蒸餾時間5 h，此條件下黃金茶揮發(fā)油得率為1.7792%。通過GCMS分析可知黃金茶揮發(fā)油中含有21種化學(xué)成分，其主要成分是為酯類化合物和萜類化合物。從抗氧化實驗可以看出黃金茶揮發(fā)油對DPPH自由基清除能力、還原力和金屬離子螯合能力都呈現(xiàn)出抗氧化作用。以上結(jié)論說明，黃金茶揮發(fā)油是一種具有抗氧化作用的有待開發(fā)的天然活性物質(zhì)，但由于黃金茶揮發(fā)油的組成成分豐富，其抗氧化機理及清除自由基活性成分分析仍需進(jìn)一步研究。