青脆李益生菌飲品的發(fā)酵工藝優(yōu)化及冷藏對(duì)其品質(zhì)的影響

商 桑，高倫江，曾小峰，曾順德，刁 源，尹旭敏，陳一龍

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，重慶 401329）

李子已成為重慶第2大主栽水果，栽培面積達(dá)100萬畝以上，產(chǎn)量超50萬噸，重慶李子栽培品種主要為青脆李、脆紅李等，已成為重慶巫山、酉陽、萬州等地精準(zhǔn)扶貧、鄉(xiāng)村振興的重要支柱產(chǎn)業(yè)。特別是“巫山脆李”已成為著名的區(qū)域公共品牌，品牌價(jià)值超20億。青脆李皮薄肉脆、味甜汁多，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種維生素、氨基酸及礦物質(zhì)，深受人們喜愛[1?3]。但青脆李是典型的呼吸躍變型果實(shí)，且重慶地區(qū)青脆李成熟期正值7～8月盛夏，由于環(huán)境溫度較高，采后極易發(fā)生后熟現(xiàn)象，在常溫運(yùn)輸中2～3 d便會(huì)發(fā)生軟化、褐變以及腐爛等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[1]，迫切需要保鮮和精深加工來支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

目前，以李子為原料的產(chǎn)品開發(fā)主要集中在果汁[4?5]、果酒[6?7]、果醋[8]、果脯[9]、蜜餞[10]、果干[11?12]及果糕[13]等，而有關(guān)青脆李益生菌飲品開發(fā)方面鮮有報(bào)道。許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品或地域特色食品，如泡菜、酸乳、奶酪、奶酒等，都有益生菌的存在[14]。隨著人類對(duì)益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物與健康關(guān)系認(rèn)識(shí)的不斷深入，益生菌發(fā)酵食品受到了越來越多的關(guān)注。益生菌可改善人體腸道菌群平衡、改善乳糖不耐癥、提高機(jī)體免疫力、合成營(yíng)養(yǎng)素、預(yù)防食物過敏、降低血脂和保護(hù)肝臟、提高人體健康水平等[15?18]。乳制品是益生菌應(yīng)用最多、最為成熟的食品領(lǐng)域，但乳制品中含有較高的脂肪和膽固醇，且還存在乳蛋白過敏、乳糖不耐受等健康風(fēng)險(xiǎn)，限制了益生菌發(fā)酵乳制品的消費(fèi)[19]。基于果品的非乳益生菌發(fā)酵食品的開發(fā)受到越來越多的關(guān)注[20?21]，水果富含糖類、有機(jī)酸、維生素、多酚、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，是益生菌發(fā)酵的理想基質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，許多常見水果原料如蘋果[22]、桑葚[23?24]、石榴[25]、獼猴桃[26]、櫻桃[27]、檸檬[28]、橙[29]等益生菌發(fā)酵產(chǎn)品，其葡萄糖、果糖濃度下降，乳酸等有機(jī)酸含量增加，酯類、酮類和醇類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)增加，抑菌活性、抗氧化能力及抗敏活性提高，不僅增加了益生功效，而且增進(jìn)了產(chǎn)品的風(fēng)味，且極大豐富了我國(guó)飲料和果蔬制品的種類。研發(fā)青脆李益生菌飲品，對(duì)提升青脆李精深加工產(chǎn)品檔次具有重要意義。篩選青脆李益生菌飲品適宜發(fā)酵菌種、適宜的發(fā)酵工藝參數(shù)及冷藏品質(zhì)變化規(guī)律，可為青脆李益生菌飲品生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青脆李原料 產(chǎn)自重慶酉陽；益生菌嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，1.1854）、植物乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，1.2469）、嗜熱鏈球菌（Lactobacillus acidophilus，1.2471）選購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 奧博星生物技術(shù)有限公司。

SA-1600-2JZ多功能超凈工作臺(tái) 上海稼豐園藝用品有限公司；DJ2-4.0雙道打漿機(jī) 江蘇靖江食品機(jī)械制造有限公司；TG-1850醫(yī)用離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計(jì) 日本Atago愛拓；無菌塑料一次性培養(yǎng)皿（90 mm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 斜面冷藏保存的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌分別用接種針各取一環(huán)，分別接種于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵用菌種，3000 r/min離心15 min去上清液、無菌水洗滌、二次離心，再去上清液備用。

1.2.2 青脆李原漿制備 將青脆李洗凈、晾干后采用雙道打漿機(jī)破碎取汁盛放于不銹鋼發(fā)酵桶內(nèi)備用。

1.2.3 青脆李益生菌飲品適宜菌株篩選

1.2.3.1 青脆李益生菌飲品優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株篩選 擴(kuò)大活化后的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌（1:1:1）分別以0.5‰質(zhì)量比接種量接種于青脆李原漿中，37 ℃下連續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔8 h定時(shí)測(cè)定青脆李益生菌飲品的pH變化情況。

1.2.3.2 混合菌株不同接種比例對(duì)生長(zhǎng)速度的影響 優(yōu)選后的混合菌株按照1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:2:1比例混合，按0.5‰質(zhì)量比接種量接種于青脆李原漿中，37 ℃下培養(yǎng)3 d，定時(shí)測(cè)定其活菌落總數(shù)。

1.2.4 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝研究單因素優(yōu)化

1.2.4.1 菌株添加量對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 以感官評(píng)分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。37 ℃，發(fā)酵3 d條件下，發(fā)酵接種量0.1‰、0.3‰、0.5‰、0.7‰、0.9‰、1.1‰（質(zhì)量比）為單因素實(shí)驗(yàn)，確定菌株添加量最佳水平范圍。

1.2.4.2 發(fā)酵溫度對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 以感官評(píng)分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。0.5‰接種量，發(fā)酵3 d條件下，發(fā)酵溫度20、25、30、35、40 ℃為單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度最佳水平范圍。

1.2.4.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 以感官評(píng)分作為考察青脆李益生菌飲品發(fā)酵品質(zhì)的特征指標(biāo)。0.5‰接種量下，25 ℃條件下，發(fā)酵時(shí)間24、32、40、48、56、64、72 h為單因素實(shí)驗(yàn)，確定發(fā)酵時(shí)間最佳水平范圍。

1.2.5 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、接種量（C）及空白（D）為自變量進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交因素水平設(shè)計(jì)表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)L9（34）因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment

1.2.6 冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)的影響在4 ℃冷藏條件，分別于5、10、15、20、25、30 d定期測(cè)定可滴定酸、pH、可溶性固形物、還原糖及活菌落總數(shù)，考察冷藏時(shí)間對(duì)青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)影響情況。

1.2.7 指標(biāo)測(cè)定

1.2.7.1 活菌落總數(shù) 稀釋涂布法測(cè)定活菌群總數(shù)[30]：無菌條件下取25 mL青脆李益生菌飲品，加入225 mL無菌生理鹽水中，振搖，制成10?1的均勻稀釋液，再取1 mL稀釋液加入9 mL無菌生理鹽水中，制成10?2稀釋液，并繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋至10?8。在進(jìn)行梯度稀釋的同時(shí)，分別吸取該稀釋度的稀釋液1 mL于兩個(gè)無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入47 ℃左右的MRS瓊脂培養(yǎng)基并混勻，待培養(yǎng)基凝固后，于37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，選擇菌落總數(shù)在30～300個(gè)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.7.2 總酸含量 采用酸堿滴定法測(cè)定（GB/T 12456-2008 食品中總酸的測(cè)定）。

1.2.7.3 pH 采用pH計(jì)測(cè)定。

1.2.7.4 可溶性固形物含量 采用手持糖度計(jì)測(cè)定。

1.2.7.5 還原糖含量 采用直接滴定法測(cè)定（GB5009.7-2016食品中還原糖的測(cè)定）。

1.2.7.6 青脆李益生菌汁感官評(píng)價(jià) 選取長(zhǎng)期喜食益生菌酸奶及益生菌發(fā)酵果汁且年齡25-30歲，男女各半的嗜好型評(píng)定人員組成評(píng)定小組，從青脆李益生菌飲品色澤、氣味、口感等方面綜合進(jìn)行評(píng)定，滿分為10分，取平均分進(jìn)行評(píng)定[31]，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 青脆李益生菌飲品感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for fermented Prunus americana juice

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青脆李益生菌飲品適宜菌株篩選

2.1.1 青脆李益生菌飲品優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株篩選 圖1結(jié)果表明，各發(fā)酵菌株組合發(fā)酵青脆李原漿，其pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，前期下降較快、后期下降較慢。72 h下嗜酸乳桿菌發(fā)酵青脆李原漿其pH下降32.54%、植物乳桿菌下降29.19%、嗜熱鏈球菌下降28.60%、三菌株混合發(fā)酵下降35.31%。從菌株對(duì)益生菌飲品pH值影響考慮，認(rèn)為植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株組合。

圖1 不同益生菌對(duì)青脆李益生菌飲品pH的影響Fig.1 The influence of different probiotics on the pH value of fermented Prunus americana juice

表3 感官評(píng)分結(jié)果顯示，植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌優(yōu)于其他三種益生菌株單獨(dú)使用。綜合圖1和表3結(jié)果認(rèn)為植物乳桿菌+嗜酸乳桿菌+嗜熱鏈球菌可作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)一步開展發(fā)酵工藝及參數(shù)優(yōu)化。

表3 不同益生菌對(duì)青脆李益生菌飲品的感官評(píng)價(jià)Table 3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana juice with different probiotics bacterias

2.1.2 混合菌株不同接種比例對(duì)生長(zhǎng)速度的影響圖2結(jié)果表明，不同混合菌株比例其菌落總數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)初期呈上升趨勢(shì)，后期呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)。菌落總數(shù)最高可達(dá)3.48×109，最低也有2.97×109，均達(dá)到109數(shù)量級(jí)，與獼猴桃[26]益生菌發(fā)酵汁菌落總數(shù)相當(dāng)，超過乳酸菌飲料[32]106CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)。總體看來對(duì)菌落總數(shù)影響均不明顯。本著方便原則，選擇植物乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌=1:1:1開展后續(xù)工作。

圖2 接種比例對(duì)菌株生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 The change of inoculation ratio on the growth rate of strainsn

2.1.3 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝研究單因素優(yōu)化

2.1.3.1 菌株添加量對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 接種量較低和較高時(shí)，對(duì)發(fā)酵感官均影響較大。接種量過低，發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，發(fā)酵速度較慢，風(fēng)味物質(zhì)形成較少，產(chǎn)酸量低且容易受到雜菌污染；接種量過高，較難控制發(fā)酵速度，發(fā)酵產(chǎn)品容易偏酸，且發(fā)酵風(fēng)味過于濃郁，發(fā)酵速度雖能加快但微生物細(xì)胞易衰老，且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[33]。圖3結(jié)果表明，隨著接種量的增加，感官評(píng)分逐漸上升，然后呈下降趨勢(shì)，接種量0.3‰時(shí)感官評(píng)分為8.2、0.5‰時(shí)8.7，0.7‰時(shí)8.9，感官評(píng)分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮確定最適菌株添加量范圍0.5‰～0.7‰。

圖3 接種量對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)價(jià)的影響Fig.3 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different inoculation

2.1.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 發(fā)酵溫度影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量，以及產(chǎn)品的酸度和風(fēng)味[34]。圖4結(jié)果表明，發(fā)酵溫度過低，代謝不活躍，產(chǎn)酸不足，使酸甜不協(xié)調(diào)；發(fā)酵溫度越高代謝越旺盛，產(chǎn)酸越快，但過高，導(dǎo)致口感過酸而不愉悅[35]；隨著發(fā)酵溫度的上升，感官評(píng)分由上升趨勢(shì)轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)。發(fā)酵溫度20 ℃時(shí)感官評(píng)分為8.1、25 ℃時(shí)8.4，30 ℃時(shí)8.3，感官評(píng)分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮確定最佳發(fā)酵溫度范圍20～30 ℃。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)價(jià)的影響Fig.4 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different temperature

2.1.3.3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)青脆李益生菌飲品感官評(píng)分的影響 發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵食品的風(fēng)味品質(zhì)密切相關(guān)，發(fā)酵時(shí)間過短，則發(fā)酵菌株還處于自身生長(zhǎng)階段，代謝物質(zhì)較少；發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，則造成代謝物質(zhì)積累產(chǎn)生異味[36]。圖5結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，青脆李益生菌飲品感官評(píng)分呈先上升后下降趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間32 h感官評(píng)分為8.3、40 h時(shí)8.6，48 h時(shí)8.9，感官評(píng)分高低反應(yīng)益生菌飲料色澤、氣味和口感的優(yōu)劣，綜合考慮最佳發(fā)酵時(shí)間范圍40～48 h。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)青脆李益生菌汁感官評(píng)價(jià)的影響Fig.5 Sensory evaluation on the fermented Prunus americana with different time

2.2 青脆李益生菌飲品發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表4可知，正交試驗(yàn)結(jié)果R值可以看出，各因素對(duì)青脆李益生菌飲品感官的影響順序?yàn)锳（溫度）＜B（時(shí)間）＜C（接種量）。從各因素K值可以看出，溫度、時(shí)間、接種量3因素試驗(yàn)最佳組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h，接種量0.7‰。采取A2B2C3驗(yàn)證試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)青脆李益生菌飲品感官評(píng)價(jià)分值達(dá)到9.2，證實(shí)此組合為較優(yōu)的試驗(yàn)方案。

表4 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 L9（34）Orthogonal test design and results

2.3 冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品貯藏品質(zhì)的影響

2.3.1 冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品可滴定酸、pH變化的影響 圖6結(jié)果表明，4 ℃冷藏條件下總酸含量緩慢增加，pH值趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)橘A藏過程益生菌菌株處于衰亡期，隨著代謝產(chǎn)物積累和生長(zhǎng)環(huán)境的惡劣，產(chǎn)酸速度則趨于變緩，pH值也相對(duì)穩(wěn)定。

圖6 4 ℃冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品總酸、pH影響Fig.6 The change of acid and pH in the condition of 4 ℃ refrigeration

2.3.2 冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品可溶性固形物、還原糖含量的影響 圖7結(jié)果表明，4 ℃冷藏條件青脆李益生菌飲品可溶性固形物含量隨冷藏時(shí)間的推移緩慢下降，但總體上變化不大?？赡茉蚴乔啻嗬钤瓭{中含有的大量原果膠在酸性條件下水解為果膠，水溶性果膠的增加彌補(bǔ)了益生菌發(fā)酵過程消耗的葡萄糖和果糖，造成可溶性固形物的變化不明顯。由于青脆李益生菌飲品中還原糖的水解和消耗的速度達(dá)到了一個(gè)平衡，所以還原糖含量相對(duì)穩(wěn)定。

圖7 4 ℃冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品還原糖、可溶性固形物影響Fig.7 The change of reducing sugar and soluble solids in the condition of 4 ℃ refrigeration

2.3.3 冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品活菌落總數(shù)的影響圖8結(jié)果表明，青脆李益生菌飲品4 ℃冷藏條件活菌落總數(shù)隨儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，冷藏20 d活菌落總數(shù)為8.6×107CFU·mL?1，滿足活性乳酸菌飲品要求[37]。冷藏30 d活菌數(shù)仍有2.0×106CFU·mL?1，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19302[38]規(guī)定發(fā)酵乳的乳酸菌數(shù)應(yīng)不少于1×106CFU·mL?1相當(dāng)。

圖8 4 ℃冷藏對(duì)青脆李益生菌飲品活菌數(shù)的影響Fig.8 The number of viable bacteria in the condition of 4 ℃ refrigeration

3 結(jié)論與討論

益生菌菌株是影響果汁發(fā)酵的關(guān)鍵因素，不同益生菌菌株對(duì)果汁理化特性和營(yíng)養(yǎng)組成的適應(yīng)能力不同，其在果汁中的生長(zhǎng)與發(fā)酵性能也存在較大差異，對(duì)獼猴桃[26]、蘋果[39]發(fā)酵的風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)成分的影響也不相同。本研究通過初篩發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌1.1854、植物乳桿菌1.2469、嗜熱鏈球菌1.2471及三菌株組合發(fā)酵能顯著降低青脆李原漿pH值，三菌株組合發(fā)酵活菌落總數(shù)、感官評(píng)分占優(yōu)，最優(yōu)工藝條件植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌1:1:1混合菌株接種量0.7‰、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h下，獲得青脆李益生菌飲品感官評(píng)分9.1（滿分10分）；說明所篩選的復(fù)合益生菌菌株適合青脆李原漿發(fā)酵，可用于青脆李益生菌飲品的開發(fā)?；罹鷶?shù)是益生菌發(fā)酵食品的一個(gè)重要指標(biāo)，成為菌株篩選與工藝優(yōu)化的首選考察指標(biāo)。但活菌數(shù)測(cè)定程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，考慮用簡(jiǎn)單、快速的指標(biāo)替代。常采用可滴定酸含量、pH反映乳酸菌在果汁中的生長(zhǎng)與發(fā)酵情況[40]。本研究初篩主要考察發(fā)酵青脆李益生菌飲品pH值和感官評(píng)分，目的在于快速篩選對(duì)青脆李原漿發(fā)酵能力強(qiáng)、有利于保持或提高青脆李營(yíng)養(yǎng)功能的益生菌菌株。

除菌株對(duì)果汁的適應(yīng)性和發(fā)酵能力外，菌株對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的影響也至關(guān)重要，感官評(píng)分常作為菌株篩選與工藝優(yōu)化的考察指標(biāo)[41]。本研究以感官評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行菌株復(fù)篩和和發(fā)酵青脆李原漿工藝優(yōu)化，獲得了發(fā)酵青脆李益生菌飲品適宜菌株組合以及最佳發(fā)酵工藝條件。

益生菌發(fā)酵果汁活菌落數(shù)在貯存過程中的變化與貯藏溫度密切相關(guān)，本研究表明，4 ℃冷藏條件下存放20 d活菌數(shù)仍在8.6×107CFU·mL?1，30 d達(dá)2.0×106CFU·mL?1，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定發(fā)酵乳的乳酸菌數(shù)應(yīng)不少于1×106CFU·mL?1相當(dāng)，說明低溫貯存有利于活菌數(shù)的保持，青脆李益生菌飲品采用低溫保藏和冷鏈流通；在4 ℃冷藏條件下其可滴定酸、pH值、可溶性固形物含量、還原糖含量均基本保持穩(wěn)定，相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)是否與貯藏溫度有關(guān)，還有待進(jìn)一步探索。