基于SERS的三種食源性致病菌的快速檢測

黃棟瑋 王甜甜 谷貴章 張進杰,* 徐大倫 楊文鴿

(1 寧波大學食品與藥學學院， 浙江 寧波 315000；2 湖州市食品藥品檢驗研究院， 浙江 湖州 313000)

食品在加工和貯運過程中因大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)和單核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等食源性致病菌污染造成的食品事件時有發(fā)生[1-3]，因此在公共衛(wèi)生和食品安全的防控過程中，快速又高效的致病菌檢測至關重要[4]。迄今為止，食源性致病菌的檢測主要采用傳統(tǒng)平板計數(shù)法、免疫學方法[5-7]和分子生物學方法[8-11]，這些方法耗時耗力且不便于現(xiàn)場檢測[12-15]。因此有必要探索有效、靈敏、快速的方法來檢測與鑒定食源性致病菌[16-17]。

表面增強拉曼光譜(surface-enhanced raman spectroscopy, SERS)通過將分子吸附在粗糙金屬或金屬溶膠顆粒上，從而得到比普通拉曼光譜更強的信號，其強度增加多個數(shù)量級，可以提供生物樣品的特征指紋光譜。SERS增強效應主要歸因于納米金屬結構表面的電磁場效應[18-19]。基于各種細菌細胞成分組成的獨特信息，SERS可以展示其特征峰，因此該技術可以用于鑒別特殊致病菌[20-21]。研究表明，通過不同大小金屬納米顆粒與細菌混合可獲得細菌的SERS效果[22-23]，如金納米顆粒(gold nanoparticles，Au NPs)、銀納米顆粒(silver nanoparticles，Ag NPs)[24]等可作為SERS增強基底，使這些無需特殊標記物檢測的SERS檢測方法更方便快捷。

納米顆粒(nano particles，NPs)團聚體重復性差，而且其大小、形狀和幾何結構不易控制，導致納米顆粒與分析物的有效結合度不高，在一定程度上降低了分析檢測的有效性和可靠性。為克服上述問題，研究者通過表面修飾合成了金屬納米顆粒，使其具有獨特的催化、電學和光學特性。Au NPs具有分散性好、穩(wěn)定性高及生物兼容性好的優(yōu)點[25]，Ag NPs的SERS增強效果好，但易被氧化，穩(wěn)定性差[26]，而 Au@Ag NPs則能結合以上兩者的優(yōu)點，更好地吸附待測分子從而獲得較優(yōu)的SERS信號[27]。但目前鮮見關于Au@Ag NPs對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌進行定性分析的SERS方法報道。本研究基于Au@Ag NPs的無標記SERS技術完成大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特的鑒定檢測，結合主成分分析(principal component analysis，PCA)、層次聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)進行3種食源性微生物的分類，旨在利用Au@Ag NPs作為基底檢測區(qū)分3種食源性致病菌，為快速檢測食源性病原體提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸(HAuCl4·3H2O，98%)、抗壞血酸(C6H8O6，99%)，美國 Sigma 公司；檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O，98%)、硝酸銀(AgNO3，99.9%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)，浙江省中心疾病預防控制中心；單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，CICC 10982)和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，CICC 21540)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設備

XploRA ONE高靈敏度拉曼光譜儀，上海HORIBA Scientific公司； H-7650透射電子顯微鏡，日本日立公司；D-7PC紫外-可見分光光度計，南京菲勒儀器有限公司；Eppendorf AG 22331高速冷凍離心機，德國艾本德公司，Winner802納米激光粒度儀，濟南微納顆粒儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Au@Ag NPs溶液制備 參考李盼等[28]的方法分兩步合成Au@Ag NPs。第一步合成Au NPs作為種子：100 mL去離子水中加入515 μL 2%的 HAuCl4·3H2O，磁力攪拌加熱到沸騰后加入1 mL 1%的Na3C6H5O7·2H2O溶液，繼續(xù)沸騰加熱30 min。溶液由無色變?yōu)槌吻宓淖霞t色即代表金納米顆粒形成。第二步合成Au@Ag NPs：取10 mL上述制備好的Au種子，加入1.5 mL 0.1 mol·L-1抗壞血酸溶液，在磁力攪拌條件下加入3.5 mL 1 mmol·L-1的AgNO3溶液，將AgNO3中的Ag+由抗壞血酸還原成Ag，包裹在Au核表面，反應過程中持續(xù)還原生長成Ag殼，AgNO3加樣結束后溶液變?yōu)殚冱S色，繼續(xù)攪拌30 min，得到Au@Ag NPs。

1.3.2 細菌樣品制備 取-80℃儲存的大腸桿菌、單核增生李斯特菌和腸炎沙門氏菌分別于腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)中培養(yǎng)過夜(37℃，100 r·min-1)，得到的菌液濃度分別約為108、107和107CFU·mL-1。分別取10 mL菌液離心(4℃，4 500 r·min-1， 10 min)去上清液。將細菌沉淀用無菌水洗滌3次，再離心后將沉淀均勻分散在10 mL Au@Ag NPs中。之后將菌液與Au@Ag NPs渦漩混合獲得均勻的混合物，靜置3～5 min，使Au@Ag NPs和細菌相互吸附。

1.3.3 SERS檢測樣品制備 取3 μL細菌沉淀與Au@Ag NPs溶液的混合樣品滴到石英載玻片上，在樣品干燥前使用 LabSpec 6.0軟件開始數(shù)據(jù)采集。樣品檢測過程中參數(shù)設置不變，每個樣品檢測重復3次，保證數(shù)據(jù)的準確性。

1.3.4 拉曼光譜檢測參數(shù) 檢測樣品前需要先用硅片以520.00 cm-1處的拉曼特征峰為基準進行校正。SERS采集的激光波長為785 nm，激光強度100%，10×目鏡，采集時間4 s，累計次數(shù)5次，光譜范圍200～2 000 cm-1。

1.3.5 Au@AgNPs的分析方法 將上述制備好的Au@Ag NPs稀釋一倍后取1 mL放入比色皿中，在波長300～800 nm內進行紫外光譜收集；將基底溶液放入粒度儀干凈的料斗中，利用Stokes-Einstein方程計算顆粒粒徑及其分布。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 9.0軟件(OriginaLab公司，美國)對光譜圖和數(shù)據(jù)圖進行處理。

2 結果與分析

2.1 Au@Ag NPs的表征

Au@Ag NPs 顆粒的大小和分散性對SERS檢測有一定的影響，采用紫外分光光度計和粒度儀表征得到Au@Ag NPs的主要吸收峰位置以及納米顆粒的粒徑分布。由圖1-A可知，Au@Ag NPs在396 nm和492 nm處存在吸收峰。由圖1-B可知，Au@Ag NPs的平均直徑為54±3 nm，且顆粒均勻。Ag NPs對細菌有良好的拉曼增強效應，但Ag NPs穩(wěn)定性相對較弱[29]。本試驗合成得到的Au@Ag NPs比Ag NPs具有更好的穩(wěn)定性和分散性。因此，理論上本試驗合成的Au@Ag NPs可以均勻附著在微生物表面，起到拉曼光譜增強作用。

圖1 Au@Ag NPs的紫外吸收光譜(A)和粒徑分布(B)

利用透射電子顯微鏡對Au@Ag NPs及其與細菌偶聯(lián)后的效果進行表征。由圖2-A可知，Au@Ag NPs的核-殼結構特征明顯，Au核周圍均勻的包裹著Ag殼；由圖2-B、C、D可知，納米顆粒分別與3種微生物混合后，納米顆粒可以吸附并富集于細菌表面，表明Au@Ag NPs與3種細菌都有較好的偶聯(lián)效果。因此可以判定Au@Ag NPs適宜用于大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌的SERS檢測。

注：合成Au@Ag NPs的TEM圖像(A)；用Au@Ag NPs包被的大腸桿菌(B)、腸炎沙門氏菌(C)和單核增生李斯特菌(D)的TEM圖像。

2.2 食源性致病菌的SERS圖譜與結構分析

對細菌與Au@Ag NPs偶聯(lián)的復合物進行SERS檢測，結果如圖3所示。在無Au@Ag NPs偶聯(lián)的情況下，3種細菌的拉曼光譜圖未出現(xiàn)任何顯著特征峰型(圖3-A)，而經(jīng)過Au@Ag NPs偶聯(lián)的大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌均顯示出增強效應的拉曼光譜圖，且3種不同細菌的拉曼信號譜峰圖之間差異明顯(圖3-B)。因此，借助Au@Ag NPs與細菌偶聯(lián)，采用拉曼光譜儀來檢測和區(qū)分這3種食源性致病菌是可行的。

不同種屬微生物之間的細胞表面化學成分組成不同，由圖3-B可知，以Au@Ag NPs 為基底，與致病菌耦合，結果顯示3種食源性致病菌的拉曼響應譜峰間存在差異。大腸桿菌的主要拉曼特征峰在431、554、689、925、1 073、1 136、1 384、1 502 cm-1處。結合表1中已報道的拉曼光譜位移分配結果，554 cm-1處的拉曼特征峰表示蛋白質的S-S拉伸，925和1 384 cm-1分別是碳水化合物和蛋白質的COO-拉伸；腸炎沙門氏菌的拉曼光譜特征峰位移主要有555、644、726、1 135、 1 389 cm-1， 其中 555 cm-1是蛋白質的S-S拉伸，644 cm-1是氨基酸的C-S伸展，1 135 cm-1是蛋白質的C-N和C-C拉伸，1 389 cm-1屬于蛋白質的COO-拉伸；單核增生李斯特菌的主要特征峰是485、556、825、1 026、 1 135、1 382、1 500、1 574 cm-1，其中485 cm-1、556 cm-1屬于碳水化合物的特征峰，1 026 cm-1為多糖的C-C環(huán)呼吸，1 135 cm-1是呼吸環(huán)的存在以及COC的拉伸。由于使用了不同的檢測方法，所以這3種致病菌的 SERS指紋圖譜與表1中文獻報道有所偏差。另外，圖3-B 顯示3種致病菌的拉曼光譜在555、1 135和1 384 cm-1附近均有響應，是由于蛋白質的C-C、S-S、C-N以及C-O等不同鍵位的拉伸而具有相似特征峰，但同濃度不同種類微生物條件下的SERS響應峰強度不同；單核增生李斯特菌在1 574 cm-1處具有大腸桿菌和腸炎沙門氏菌均無的特征峰。由此可見，基于Au@Ag NPs基底的偶聯(lián)效果與拉曼增強效應，可以根據(jù)3種微生物的拉曼指紋圖譜差異，對上述3種致病菌進行有效檢測與區(qū)分。

表1 已報道文獻中3種食源性病原體的SERS光譜的拉曼位移分配[4,6,15]

圖3 3種食源性致病菌原液的SERS圖譜(A)以及3種食源性致病菌與Au@Ag NPs 偶聯(lián)后的SERS圖譜(B)

2.3 SERS光譜的重復性試驗

為了檢驗Au@Ag NPs應用于大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌檢測的穩(wěn)定性，制作了5個不同批次的Au@Ag NPs，分別對3種致病菌進行SERS檢測。本次試驗的大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌的濃度經(jīng)驗證分別為108、107和107CFU·mL-1。由圖4可知，偶聯(lián)5個不同批次的Au@Ag NPs的SERS光譜具有高度的重現(xiàn)性，且大腸桿菌在554 cm-1處的拉曼峰值相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為4.15%，腸炎沙門氏菌在1 384 cm-1處的拉曼峰值RSD為5.86%，單核增生李斯特菌在1 384 cm-1處的拉曼峰值RSD為6.44%。Au@Ag NPs良好的重現(xiàn)性為食源性致病菌的快速SERS檢測提供了強有力的支持。

2.4 PCA和HCA分析

考慮到基于相似的振動光譜難以對微生物進行分類和鑒定，采用PCA、HCA分析本研究從細菌樣品中獲得的SERS圖譜。PCA可以在很大程度上降低復雜多變量數(shù)據(jù)的主成分維數(shù)，將復雜的多維空間數(shù)據(jù)轉變?yōu)橹庇^可見的分布散點圖，客觀地捕獲相似光譜之間最小光譜差異，判別不同種類之間關系，同時分析比較其相似性。HCA是對研究對象進行先聚類再判斷分析，判斷研究對象種群之間的相似性與差異性。利用2.3中3種不同致病菌SERS光譜數(shù)據(jù)進行PCA分析，使用歐式距離 (euclidean distance) 和RStudio構建HCA樹狀圖，評估基于Au@Ag NPs增強基底的3種致病菌SERS圖譜的差異性。

PCA分析結果見圖5-A，PC1、PC2和PC3的方差貢獻率分別為58.39%、20.21%和13.87%，累積貢獻率達92.47%。且PCA分析可以很明顯地將致病菌歸為3類，每種致病菌都能分別與其他2種區(qū)分開。大腸桿菌與腸炎沙門氏菌、單核增生李斯特菌分離度較大。HCA分析結果如圖5-B，可以看出結果主要分為3個簇，每簇之間各自聚類無交叉干擾。3種致病菌在聚類距離5處可以清晰地被分為3個聚類，腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌在聚類距離為8處被聚為一類，相對于大腸桿菌，腸炎沙門氏菌與單核增生李斯特菌的SERS特征拉曼光譜較相似，但整體上，3種致病菌的SERS圖譜可以通過PCA和HCA進行有效區(qū)分。

圖5 3種食源性致病菌指紋圖譜的主成分分析(A)和聚類分析樹狀圖(B)

3 討論

SERS受不同激光波長、被檢物質、增強基底及其之間相互作用的影響，其中基底的增強活性和良好的重現(xiàn)性至關重要。最常用的SERS基底是Au NPs 和Ag NPs[30-32]。其中Au NPs作為增強基底的SERS分析雖然操作簡單、檢測快速，但其在檢測過程中的靈敏度不及Ag NPs[33-35]，Ag NPs合成雖簡單易操作，但在儲存期間容易聚沉影響檢測。本研究以合成的Au@Ag NPs作為拉曼增強基底，組合了Au NPs和Ag NPs的優(yōu)勢，針對3種病原微生物，Au@Ag NPs的拉曼增強效果好，重復性和穩(wěn)定性好。

基于SERS檢測病原微生物已經(jīng)有一些報道，曹偉麗等[36]用合成的SiO2-Au@Ag NPs與大腸桿菌簡單混合培養(yǎng)后進行檢測，其檢測限為105CFU·mL-1；梁愛惠等[37]利用銀納米棒作增強基底，維多利亞藍B作為染色劑檢測大腸桿菌，檢測效果略差于曹偉麗等[36]的檢測結果；蘇永波等[38]利用微波法制備的銀納米溶膠檢測大腸桿菌，其SERS結果可以很好地顯示大腸桿菌的特征拉曼指紋圖譜。因為食源性病原微生物的體積比納米顆粒大2～3個數(shù)量級，且納米顆粒的大小、組成成分和微生物的附著效果以及微生物表面的物質組成，都會影響SERS的檢測效果。本研究制備的Au@Ag NPs與大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌能進行有效耦合，產(chǎn)生各自的特征拉曼光譜，再結合PCA和HCA對特征拉曼光譜進行分析，結果顯示能對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌進行有效的區(qū)分。

4 結論

本試驗采用兩步法合成的Au@Ag NPs基底增強效果好，穩(wěn)定性高。Au@Ag NPs可以均勻地吸附在大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌的周圍；基于 Au@Ag NPs的表面增強作用，拉曼光譜法可以檢測到濃度為107～108CFU·mL-1的大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌。PCA和HCA能將大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌的拉曼光譜進行有效區(qū)分。因此將Au@Ag NPs作為增強基底，可以采用SERS對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌和單核增生李斯特菌進行定性檢測。本研究結果為食品微生物安全風險控制及檢測提供了一定的理論依據(jù)。