溫度對(duì)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞和干細(xì)胞的影響

燕法紅，林彩蓮，孫鳳強(qiáng)，莊洪霞，朱玉春，居瑞雪

（濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院/濰坊市人民醫(yī)院血液內(nèi)科1，產(chǎn)科2，檢驗(yàn)科3，山東 濰坊 261041）

臍帶血（cord blood）是一種重要的造血干細(xì)胞來源，保持臍帶血的有效質(zhì)量與數(shù)量對(duì)造血干細(xì)胞移植的成功至關(guān)重要。臍帶血的質(zhì)量與數(shù)量受到多種因素的影響，涉及采集、運(yùn)輸、保存、冷凍、融化等多個(gè)環(huán)節(jié)[1]。其中，臍帶血的運(yùn)輸及保存就是其中一個(gè)重要方面，運(yùn)輸及保存的時(shí)間及溫度等都可能影響臍帶血的質(zhì)量與數(shù)量。對(duì)于臍帶血的最佳運(yùn)輸及保存條件，目前研究存在一定分歧。德國制定了臍帶血運(yùn)輸保存的規(guī)范，要求臍帶血在采集后48 h 內(nèi)送至臍血庫并予以處理、凍存，在此期間的溫度必須保持在（22±4）℃。目前其他國家對(duì)臍帶血的運(yùn)輸及保存的時(shí)間與溫度等條件沒有明確規(guī)定[2]。隨著交通條件的改善，物流速度的加快，臍血庫數(shù)量的增多，目前臍帶血的運(yùn)輸時(shí)間已大大縮短，一般臍帶血在采集后十余小時(shí)內(nèi)均可到達(dá)臍血庫。本研究擬觀察臍帶血采集后12 h 保存于4 ℃與室溫對(duì)干細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞的影響，以探索臍帶血運(yùn)輸與保存的最佳溫度。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC7-anti CD45、PE-anti CD34 流式抗體購自美國Becton Dickinson 公司，淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，裂紅液購自美國Becton Dickinson 公司，肝素鈉購自成都市海通藥業(yè)有限公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自天津?yàn)笕A科生物科技有限公司，血細(xì)胞分析儀為日本Sysmex 公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter 公司產(chǎn)品。

1.2 人臍帶血采集及處理 16 份人臍帶血來自濰坊醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2020 年7 月～10 月健康產(chǎn)婦。在50 ml 無菌注射器中加入1 支肝素鈉（12500 U），臍帶娩出后用注射器抽取30 ml 臍帶血，立即平均分為兩組，分別為4 ℃組與室溫組，前者放置于4 ℃冰箱，后者放置于室溫（22±4）℃，均放置12 h。此后的處理步驟兩組一致，以減少干擾與誤差，除離心外均放置在4 ℃（或者冰水浴）。

1.3 密度梯度離心法分離干細(xì)胞（MNC）與MNC 計(jì)數(shù) 臍帶血放置12 h 后，1200 r/min 離心7 min，吸取白膜層，加入等體積PBS 后混勻，緩慢加入到含有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000 r/min 緩慢離心20 min。吸取MNC，加入10 ml PBS，1200 r/min離心7 min，棄上清，以PBS 重懸至1 ml。用血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)，白細(xì)胞濃度除以15，記錄為每毫升臍帶血所采集的MNC 數(shù)，然后進(jìn)行流式檢測。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+細(xì)胞比例 每組取50 μl充分混勻后的臍帶血，若MNC 濃度過高可進(jìn)行稀釋，每組加入PC7-anti CD45、PE-anti CD34 流式抗體各5 μl，避光孵育20 min。加裂紅液，放置10 min。加PBS，300 g 離心5 min，棄上清。再洗一遍。以PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測。以CD45/SSC 設(shè)門，定位白細(xì)胞群。分析CD34+細(xì)胞占CD45+細(xì)胞的比例，然后乘以MNC 數(shù)，得出CD34+細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組資料經(jīng)檢驗(yàn)為正態(tài)分布后，計(jì)量資料以（）表示，比較采用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)。應(yīng)用線性相關(guān)，分析不同溫度下CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 數(shù)的相關(guān)性，應(yīng)用GraphPad Prism5 軟件作圖。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臍帶血MNC 數(shù)、CD34+細(xì)胞比例及CD34+細(xì)胞數(shù)比較 4 ℃組與室溫組MNC 數(shù)分別為（9.28±4.65）×108/L、（20.11±8.37）×108/L，4 ℃組MNC 數(shù)低于室溫組（t=-5.283，P＜0.05）。4 ℃組與室溫組CD34+細(xì)胞比例分別為（1.10±0.56）%、（0.55±0.24）%，4℃組高于室溫組（t=4.348，P＜0.05）。4 ℃組與室溫組CD34+細(xì)胞數(shù)分別為（9.41±5.08）×106/L、（10.80±5.40）×106/L，兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.265，P=0.225），見圖1。

圖1 兩組臍帶血MNC 數(shù)、CD34+細(xì)胞比例及CD34+細(xì)胞數(shù)比較

2.2 CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 的相關(guān)性 4 ℃組CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 無相關(guān)性（r=0.295，P=0.267）；室溫組CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 呈正相關(guān)（r=0.551，P=0.027）。

3 討論

對(duì)于臍帶血凍存前的最佳保存溫度、溫度對(duì)臍帶血中的干細(xì)胞及其他成分的影響，部分學(xué)者從不同的角度對(duì)此進(jìn)行了研究，但研究的結(jié)論并不一致。部分研究認(rèn)為室溫保存可獲得較好的效果，Moldenhauer A 等[3]認(rèn)為，在25 ℃時(shí)MNC 與CD34+細(xì)胞明顯高于4 ℃，集落形成單位（CFU）的形成能力優(yōu)于4 ℃。Maeng JY 等[4]發(fā)現(xiàn)在24 ℃保存比4 ℃保存下CFU 數(shù)量增多，但CD34+細(xì)胞活性無明顯差別。Pereira-Cunha FG 等[5]發(fā)現(xiàn)臍帶血在室溫保存至96 h，能較好地保存各種細(xì)胞成分的活性。Guttridge MG 等[6]證實(shí)臍帶血在室溫保存3 d，CD34+細(xì)胞活性不受影響，但CD45+細(xì)胞活性明顯下降。另一部分研究則認(rèn)為4 ℃保存更優(yōu)越，如Pamphilon D 等[7]認(rèn)為4 ℃保存比室溫可獲得更多的總有核細(xì)胞（TNC）數(shù)、MNC 數(shù)、CD45+活細(xì)胞，但CD34+活細(xì)胞與CFUGM 之間無差別。Fry LJ 等[8]認(rèn)為4 ℃～8 ℃保存比室溫保存可得到更多的CD45+細(xì)胞、CD34+細(xì)胞、粒細(xì)胞與MNC。Louis I 等[9]認(rèn)為4 ℃保存比室溫可明顯提高M(jìn)NC、CD45+、CD34+細(xì)胞活性和復(fù)蘇能力，但CFU 形成能力無差別。另外一部分研究則認(rèn)為4 ℃保存與室溫保存差別不大[10,11]。Strobel J 等[2]研究了2460 例臍帶血，發(fā)現(xiàn)不同的保存溫度總體上對(duì)CD34+活性及CFU 影響不大，但20 ℃～24 ℃保存會(huì)略顯優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)，室溫組與4 ℃組CD34+細(xì)胞數(shù)基本相同，與部分研究一致[4,6,10,11]。臍帶血中干細(xì)胞數(shù)的多少與細(xì)胞凋亡、抗凝—纖溶系統(tǒng)的變化等因素有關(guān)[3,10]，有研究認(rèn)為室溫與4 ℃保存時(shí)臍帶血中的干細(xì)胞凋亡無明顯差別[10]，與本次研究結(jié)果相吻合。Radke TF 等[10]發(fā)現(xiàn)臍帶血采集后72 h 之內(nèi)，在4 ℃與26 ℃保存時(shí)CD34+細(xì)胞均沒有發(fā)生死亡，但可發(fā)生凋亡，但兩種溫度下的細(xì)胞凋亡差別不大；只有在較高的37 ℃條件下CD34+細(xì)胞死亡和凋亡才進(jìn)一步增加，細(xì)胞形態(tài)也隨之發(fā)生變化。本次研究沒有納入37 ℃保存，由上可以看出，在臍帶血采集后的一定時(shí)間內(nèi)，4 ℃與室溫保存時(shí)CD34+細(xì)胞的損失無明顯差別，可以解釋本研究中臍帶血在采集12 h后保存在兩種溫度下CD34+細(xì)胞的數(shù)量沒有差別。對(duì)于MNC 的變化，本研究發(fā)現(xiàn)，室溫組MNC 數(shù)高于4 ℃組，與有關(guān)研究一致[3]。由于低溫環(huán)境可釋放有害物質(zhì)，細(xì)胞吸收后可引起損傷[12]，MNC 數(shù)量的下降可能與其有關(guān)。Pereira-Cunha FG 等[5]觀察了室溫保存96 h 內(nèi)臍帶血中不同MNC 組分的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間推移，單核細(xì)胞與不成熟B 淋巴細(xì)胞維持穩(wěn)定，成熟B 淋巴細(xì)胞下降，而CD34+細(xì)胞與成熟T 淋巴細(xì)胞升高。整體上來說，MNC 是基本維持穩(wěn)定的。本研究還發(fā)現(xiàn)，室溫組CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 數(shù)呈正相關(guān)，而4 ℃組CD34+細(xì)胞數(shù)與MNC 數(shù)無相關(guān)性，考慮仍與低溫?fù)p傷MNC 有關(guān)，導(dǎo)致4 ℃時(shí)二者數(shù)量上的不平衡。

綜上所述，室溫保存比4 ℃更有利于同時(shí)保護(hù)干細(xì)胞與MNC。但本研究尚存在一定的局限性，僅從干細(xì)胞與MNC 細(xì)胞數(shù)量的角度進(jìn)行觀察，沒有對(duì)TNC 數(shù)、復(fù)蘇后細(xì)胞活性、CFU 形成能力等進(jìn)行檢測。相關(guān)研究值得進(jìn)一步深入開展，更全面地觀察不同保存條件下臍帶血一系列參數(shù)的變化，為臍帶血的保存提供可靠的理論基礎(chǔ)。