泰山紫草對免疫性血小板減少性紫癜的治療作用研究

陰祖旺，李明亮，毛雙雙，葛 雪，史文峰，鄭紅麗，劉有旺

（山東第一醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，山東 泰安 271000）

免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）是臨床常見的出血性疾病，一般表現為皮膚、黏膜自發(fā)性出血，血小板減少，出血時間延長。目前臨床通常采用輸血、輸入血小板并聯合采用潑尼松激素和環(huán)磷酰胺治療[1]。但輸注血小板存在感染血源性疾病的風險，反復輸血或血小板使機體誘發(fā)同種異體免疫反應，產生溶血反應或破壞輸注的血小板等。激素及免疫抑制劑長期使用副作用大且有一定的復發(fā)率。中藥治療免疫性血小板減少性紫癜是目前的發(fā)展趨勢和研究熱點。泰山紫草是泰山名藥之一，有活血、涼血、清熱解毒等功效[2-4]，但該藥材對免疫性血小板減少性紫癜的作用及機制尚不清楚。本研究擬探究泰山紫草對ITP 的治療效果及機制，旨在為臨床治療免疫性血小板減少性紫癜提供治療選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康8 周齡雄性BALB/c 小鼠，60只，鼠齡8 周齡，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。健康雄性Hartley Guinea Pig 豚鼠，6 只，6 周齡，體重300～400 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究經山東第一醫(yī)科大學動物倫理委員會審核通過。

1.2 儀器與方法 試劑弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國Sigma 公司，小鼠IL-2 和IL-10ELISA 試劑盒購自美國賽默飛公司，小鼠血小板生成素ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物，FITC Anti-MouseCD41 抗體購自美國Biolegend 公司，泰山紫草購自泰安市泰山四大名藥開發(fā)有限公司，醋酸潑尼松龍注射液購自華中藥業(yè)股份有限公司。本研究用到的主要儀器有酶標儀（賽默飛世爾，Multiskan FC）、離心機（美國Sigma 公司，3-16L）；血細胞分析儀（日本光電公司，MEK6318K）；流式細胞儀（美國BD 公司，FACS Aria II）。

1.3 方法

1.3.1 血清制備 麻醉小鼠，眼眶采血，EDTA 抗凝，1000 rpm 離心10 min，取富含血小板的上清，3000 rpm離心10 min，棄上清，沉淀用PBS 洗3 次，用生理鹽水配成1×109個/ml 血小板懸液，與等量弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化混勻制備豚鼠抗小鼠血小板血清（Guinea pig anti-mouse platelet serum，APS）。第1 周給豚鼠皮下注射含弗氏完全佐劑的血小板懸液1 ml，然后連續(xù)4 周每周皮下注射含弗氏不完全佐劑佐劑的血小板懸液1 ml，第6 周心臟采集豚鼠全血，3000 rpm 離心10 min，取上清，此即為豚鼠抗小鼠血小板血清。經腹腔注射血小板，隔30 d 進行2 次注射后分離豚鼠血清備用。

1.3.2 模型建立 將上述制備的豚鼠抗小鼠血小板血清用生理鹽水以1∶4 稀釋，隔天腹腔注射BALB/c 小鼠，每只每次100 μl，共19 d 建立免疫性血小板減少性紫癜（ITP）模型。

1.3.3 動物分組及給藥 于造模后第7 天開始分組給藥。將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、泰山紫草湯低、中、高劑量組和激素組，每組10 只。正常對照組小鼠不作任何處理，泰山紫草湯低、中、高劑量組于造模后給予自制泰山紫草湯，其中低、中高3 個劑量的用量分別為5 mg/20 g、10 mg/20 g、20 mg/20 g，激素組于造模后給予醋酸潑尼松龍治療0.4 mg/20 g，模型組于造模后給予等體積蒸餾水。各組均灌胃給藥，1 次/d，共給藥14 d。

1.3.4 指標檢測 小鼠眼眶取血，EDTA-Na2 溶液抗凝。血細胞分析儀檢測外周血中血小板數量。5 μl抗凝血加50 μl TO 工作液和5 μl CD41-FITC 抗體，室溫避光孵育15 min 后，流式細胞儀檢測網織血小板比例。吸取每只小鼠100 μl 血清樣品，酶聯免疫吸附測定法（ELISA）分別測定血清中IL-2、IL-10 和血小板生成素（thrombopoietin，TPO）含量。ELISA 操作按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行分析，實驗數據用（）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q 檢驗，以P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 泰山紫草對ITP 模型小鼠外周血血小板計數和外周血網織血小板比例的影響 模型組外周血血小板數低于正常對照組，網織血小板比例高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；激素組血小板數高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組血小板數高于模型組，且呈劑量依賴效應（P＜0.05），且與正常對照組接近；泰山紫草湯低、中、高劑量組網織血小板比例均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組網織血小板比例和激素組接近，無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1 泰山紫草對ITP 小鼠外周血小板計數和對網織血小板百分比的影響（）

表1 泰山紫草對ITP 小鼠外周血小板計數和對網織血小板百分比的影響（）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 泰山紫草對ITP 模型小鼠骨髓細胞IL-2、IL-10、TPO 含量的影響 模型組血清IL-2 水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組和激素組IL-2 水平均明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組IL-2 水平與激素組水平接近，差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組血清IL-10 含量低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組IL-10 水平高于模型組和激素組，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組小鼠血清TPO 含量高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組TPO 水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；泰山紫草湯低、中、高劑量組TPO 水平與激素組水平接近，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 泰山紫草對ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影響（，pg/ml）

表2 泰山紫草對ITP 小鼠外周血中IL-2、IL-10、TPO 的影響（，pg/ml）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與激素組比較，cP＜0.05

3 討論

ITP 是與感染、藥物、遺傳等多種原因有關的自身免疫異常引起的疾病[5]。泰山紫草對ITP 的療效及作用機制尚不十分清楚。本研究建立了ITP 小鼠模型，通過泰山紫草湯灌胃治療，發(fā)現泰山紫草湯能有效提高外周血血小板數量，改善血小板減少的癥狀，降低血小板代償性增殖程度。表明泰山紫草湯對ITP 有治療作用。

研究顯示，體內細胞因子失調在ITP 發(fā)病過程中起著重要的作用[6-8]。細胞因子可調節(jié)免疫應答的類型，參與人體的炎癥和免疫反應。在ITP 患者體內發(fā)現多種細胞因子的水平異常，如白細胞介素（Interleukin，IL）-2、IL-10 和轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等[8，9]。其中IL-2 主要是由Th1 細胞分泌的一種促炎性細胞因子，可以促進T細胞增殖，并促使B 細胞增殖、分化為漿細胞，產生大量抗血小板抗體，進而導致血小板減少[10]。本研究發(fā)現，泰山紫草湯可以降低ITP 模型小鼠體內IL-2含量，療效接近醋酸波尼松龍，推測其具有抑制T細胞的增殖、分化及B 細胞生成血小板抗體，減少血小板免疫性破壞、從而達到提高血小板數量的作用。細胞因子IL-10 主要由Th2 細胞分泌，并能抑制Th1 細胞分泌的一種抑炎性細胞因子[11]。本研究表明泰山紫草湯可以升高ITP 模型小鼠體內IL-10 含量，療效優(yōu)于醋酸波尼松龍。推測其可能抑制B 細胞產生大量抗血小板抗體，進而引起血小板增加。綜合對泰山紫草湯對IL-2 的抑制作用和對IL-10的促進作用，推測泰山紫草湯可能通過調節(jié)促炎性細胞因子和抑炎性細胞因子的平衡，進而調節(jié)抗血小板抗體的產生，最終達到治療ITP 的作用。本研究結果也與相關研究報道相一致[6，7]。

TPO 是與血小板數量和抗血小板抗體最密切相關的指標[12，13]。TPO 泰山紫草治療后與模型對照組比較，各用藥組TPO 水平均降低，表明泰山紫草湯能明顯降低ITP 模型小鼠體內TPO 濃度，推測抗血小板抗體減少后，血小板升高，進而促進了外周血中TPO 的攝取、利用和降解，使血清TPO 濃度下降，與相關研究報道相一致[9，12，13]。

盡管本研究取得初步結果，但由于實驗條件限制，未系統研究多種促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的變化及其與抗血小板抗體之間的直接聯系，在以后的工作中，將深入研究泰山紫草湯的免疫作用機制。總之，本實驗為ITP 在新藥研制方面提供理論依據，為ITP 治療提供新思路。