TMEFF2 在子宮內膜癌組織中表達和甲基化水平的變化及與患者病理特征的關系

王 鵬，趙建國，劉 靜

（天津市中心婦產科醫(yī)院婦瘤科，天津 300100）

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1，2]，早期患者5 年生存率超過95%；然而，晚期患者術后易復發(fā)，并伴有陰道、盆腔和遠處轉移，導致5 年生存率降至16%～45%[3]。因此，尋找有效的分子標志物用于早期診斷和靶向治療對于提高生存率至關重要。具有表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）樣和Follistin 樣結構域的跨膜蛋白TMEFF2（transmembrane protein with epidermal growth factor-like and two follistatin-like domains）在包括結直腸癌、胃癌等在內的多種疾病中被證實屬于功能性因子[4]，一方面胞外區(qū)Follistatin 樣功能域，可與轉化生長因子-β 家族、血管內皮生長因子等結合，并抑制其受體活化；另一方面胞外區(qū)EGF 樣結構可參與細胞內的信號轉導[5]。然而關于TMEFF2 在婦科癌癥中的研究有限。本研究利用生物信息學數(shù)據庫，對TMEFF2 在EC 中的表達進行了客觀分析。并進一步收集了大量臨床樣本以確定其表達及甲基化水平與EC 患者臨床和病理特征的關系，為尋找有效的生物學分子靶點提供一定的可靠數(shù)據支持。

1 資料與方法

1.1 生物信息學數(shù)據分析 本研究中利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）分析腫瘤組織及其相應正常組織中的差異基因表達。該數(shù)據庫是用于在線分析和挖掘可靠信息的癌癥數(shù)據庫，可根據腫瘤分期、腫瘤分級或其他臨床病理特征，分析相關基因在腫瘤組織和正常組織中的相對表達量。篩選條件為：腫瘤類型：美國公共癌癥基因數(shù)據庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA）-UCES（Uterine Corpus Endometrial Carcinoma）；基因：TMEFF2；分析類型：腫瘤組織vs.正常組織；臨界值設置：P＜0.05，倍數(shù)變化＞2。最終通過篩選獲得了546 個EC 組織、35 個正常子宮內膜組織的TMEFF2 基因表達的臨床數(shù)據資料。

1.2 臨床資料 選擇2018 年1 月～2021 年3 月在天津市中心婦產科醫(yī)院婦科接受初次手術的44～74歲的患者，共采集了302 例石蠟包埋的子宮內膜標本保存于我院病理科。按照病檢結果分為EC 組117例，包括子宮內膜樣腺癌65 例、漿液性癌24 例、黏液性癌19 例、透明細胞癌6 例、未分化癌和去分化癌3 例；癌前病變組95 例，包括82 例子宮內膜非典型性增生、13 例子宮內膜上皮內瘤；正常子宮內膜組90 例，包括分泌型子宮內膜55 例，增生型子宮內膜35 例，正常子宮內膜樣本來自入院接受診刮或由于子宮良性疾病而接受全子宮切除術的患者。所有惡性病例均按照國際婦產科聯(lián)合會（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）系統(tǒng)（2009）[6]的標準進行診斷、分級和分期。檢測腫瘤分化程度、肌層浸潤深度、雌激素受體（estrogen receptor，ER）和前列腺素孕激素受體（progestrone receptor，PR）的表達。本研究和所有人類樣本的收集都得到了我院機構倫理委員會的批準，且所有患者都給予了書面知情同意。納入標準：①經手術和病理組織學診斷符合相應的診斷標準[5]；EC 組患者均為原發(fā)性病變；癌前病變及正常子宮內膜組均無子宮肌瘤、卵巢巧克力囊腫及其他雌激素依賴性疾?。虎谛g前未接受過放療、化療、生物免疫治療等；③對于EC患者，包括子宮切除術和盆腔/腹主動脈旁淋巴結切除術。將伴有嚴重基礎性疾?。ㄈ绺文I功能嚴重不全、心力衰竭、急性心肌梗死、腦梗死等）、合并自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病或其他部位原發(fā)惡性腫瘤者排除在本研究之外。EC 組、癌前病變組、正常子宮內膜組年齡分別為（56.00±11.16）歲、（54.29±13.92）歲及（55.29±11.38）歲，三組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由2 位病理學家對腫瘤組織學切片進行篩選，選擇具有代表性的腫瘤細胞，并從每個腫瘤標本中取出一個直徑2 mm 的組織核，置于新的受體石蠟塊中進行免疫組織化學染色。

1.3 免疫組化法檢測組織TMEFF2 蛋白定位和表達取子宮內膜組織標本連續(xù)切片（約4 μm）。應用免疫組化鏈霉親和素-過氧化物酶法檢測TMEFF2 蛋白表達。將切片經二甲苯二次浸潤和乙醇分級浸潤脫蠟再水化后，進行抗原微波修復和內源性過氧化物酶阻斷。用10%山羊血清在37 ℃下阻斷載玻片15 min，然后用1∶75 的TMEFF2 抗體（美國Abcam公司）在4 ℃的濕箱中孵育過夜，接著用辣根過氧化物酶標記的二級抗體在37 ℃結合30min，然后用二氨基聯(lián)苯胺試劑染色，觀察TMEFF2 蛋白表達。用等體積的PBS 代替TMEFF2 抗體作為陰性對照。根據Gao LL 等[7]對染色結果進行判讀：染色強度為0、1、2、3 分，分別對應無染色、弱染色、中染色、強染色；以陽性細胞百分比為標準，染色范圍為0、1、2、3、4 分，分別對應＜5%、5～25%、26～50%、51～75%、＞75%。以上2 個分數(shù)相乘得出最終分數(shù)如下：0～2 分（-）、≥3 分為陽性染色。為了控制誤差，將組化圖片由2 位經驗豐富的病理醫(yī)師獨立觀察。

1.4 組織TMEFF2 基因甲基化水平檢測 采用巢式甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）法檢測組織TMEFF2 基因甲基化水平將石蠟包埋組織在37 ℃放置過夜，隨后浸泡于二甲苯中2 次15 min，然后用一系列乙醇分級脫水。用Qiagen DNA FFPE 組織提取試劑盒分離組織樣本中的DNA。EZ DNA 甲基化試劑盒用于DNA 亞硫酸氫鹽修飾。引物片段5’-GAGTTTAGTTTTTGGATGTTG-3’和5’-TACAACTCTACAACAACAAAC-3’，以亞硫酸氫鹽修飾后的DNA 樣品（1:250 稀釋）為模板，進行MSP：甲基化引物（上游）5’-AAATTTTCGAGATTATGCGC-3’和（下游）5’-CCGAAAAACACAAAATCGCG-3’；非甲基化引物（上游）5’-AAATTTTTGAGATTATGTGT-3’和（下游）5’-CCAAAAAACACAAAATCACA-3’。該反應包括在95 ℃初始化10 min，隨后35 個周期循環(huán)（95 ℃變性30 s，57 ℃冷卻59 s，72 ℃延伸30 s）。上述過程使用GeneAmp DNA 擴增試劑盒配制25 μl 反應體系，在PTC-100 熱循環(huán)儀上完成，CpGenomTM 通用甲基化和非甲基化DNA 作為陽性和陰性對照，將PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠上進行分離，溴化乙錠染色，用紫外成像系統(tǒng)觀察。甲基化或非甲基化PCR 產物中只有一條帶表明兩個等位基因分別為甲基化或非甲基化；同時出現(xiàn)甲基化和非甲基化PCR 產物表明存在部分甲基化。將甲基化或部分甲基化并入甲基化組，否則為非甲基化。

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據采用SPSS 21.0 軟件進行分析，計量資料以（）表示，計數(shù)資料使用[n（%）]表示。采用單因素方差分析和χ2檢驗評估組間差異。雙側P＜0.05 時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基于TCGA 數(shù)據庫分析 TMEFF2 在UCEC 組織中的表達情況及與預后的關系原發(fā)性CESC 組織中TMEFF2 表達低于正常組織[TPM：0.001（0.001，0.036）vs 0.018（0.011，0.059），P＜0.05]，但是基因啟動子甲基化水平高于正常組織[β 值：0.139（0.050，0.320）vs 0.094（0.078，0.109），P＜0.05]。此外，TMEFF2 表達與UCES 患者無病生存率時間和總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），低表達亞組患者中位無病生存時間和總生存時間均長于高表達亞組患者，見圖1。

圖1 基于TCGA 數(shù)據庫挖掘TMEFF2 在UCEC 組織中的表達情況以及與預后的關系

2.2 不同組織中TMEFF2 蛋白表達和基因甲基化狀態(tài) 經免疫組化法和MSP 法分析，TMEFF2 蛋白主要染色于細胞膜和細胞質，細胞核也偶有染色。EC組織中TMEFF2 蛋白陽性表達率低于正常組宮內膜組和癌前病變組，同時基因高甲基化率高于正常組宮內膜組和癌前病變組（P＜0.05）；另外癌前病變組織中TMEFF2 蛋白陽性表達率亦高于正常子宮內膜組，且基因啟動子甲基化率低于正常子宮內膜組（P＜0.05），見表1、圖2、圖3。

表1 不同組織中TMEFF2 表達和甲基化狀態(tài)比較[n（%）]

圖2 免疫組化法分析TMEFF2 蛋白在各組織中的典型表達情況（×400）

圖3 MSP 法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)

2.3 EC 患者組織中TMEFF2 基因啟動子甲基化狀態(tài)與TMEFF2 蛋白表達的關系 81 例TMEFF2 基因高甲基化組織中TMEFF2 蛋白陽性表達率低于非甲基化組織[4.94%（4/81）vs 83.33%（30/36）]，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=74.299，P＜0.05）。

2.4 EC 患者組織TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)、蛋白表達水平與臨床病理特征的關系 EC 組織中TMEFF2基因高甲基化與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2 有關，同時TMEFF2 蛋白陽性表達亦與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、肌層浸潤≥1/2 有關（P＜0.05），見表2。

表2 EC 組織中TMEFF2 基因甲基化狀態(tài)和蛋白水平與臨床病理特征的關系[n（%）]

表2（續(xù)）

3 討論

EC 是發(fā)生于子宮內膜的一類上皮性惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是多因素的生物學過程，涉及多個基因、多個階段[8]。然而，其準確的發(fā)病機制尚不清楚，也缺乏特異性的分子標記物用于早期診斷。因此，研究影響EC 發(fā)生發(fā)展的分子機制和治療靶點尤為重要。TMEFF2 是一種單通道跨膜蛋白，由于其獨特的結構特征，在機體的許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[9]。在本研究證實TMEFF2 蛋白在EC 組織中較正常子宮內膜組織和癌前病變組織下降，而且EC 組織中TMEFF2 蛋白陽性表達率降低與基因啟動高甲基化狀態(tài)有關。此外EC 組織中TMEFF2 基因高甲基化與FIGO 分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移、肌層浸潤≥1/2 有關，說明TMEFF2 可能在EC 發(fā)生和進展過程中屬于功能性分子。

TMEFF2 基因位于染色體2q32-q33 上，可編碼374 個單位長度的Ⅰ型跨膜蛋白聚糖，其主要功能已被廣泛報道，一方面可刺激腦垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素釋放激素，并且通過結合淀粉樣蛋白衍生物提供神經保護作用[10]；另一方面可通過激活JAK-STAT 通路[9]、調節(jié)一碳代謝[11]等參與多種細胞的癌變過程。TMEFF2 是一種多結構域蛋白，其N 端含有一個信號肽，其次是兩個卵泡抑素樣結構域、一個EGF 樣結構域、一個跨膜結構域和一個短胞內結構域，其中EGF 樣結構域由于重要的精氨酸殘基（Arg39）被組氨酸替代而顯示出功能上的無效性，而胞外區(qū)域的類卵泡抑素結構域則被認為是TMEFF2相關功能的關鍵結構域，例如可結合并調節(jié)各種生長因子，包括TGF 家族、血小板衍生因子和血管內皮生長因子等[12]。由于TMEFF2 涉及多種癌癥和不同的功能，自本世紀初被發(fā)現(xiàn)以來，已經引起了各個領域的學者相當大的興趣；然而，不同的研究結果似乎不一致，有時甚至相互矛盾。例如Mo HY 等[13]證實胃癌組織和結腸癌組織中TMEFF2 表達明顯降低，且其低表達與病理分期不良、腫瘤體積大、預后不良有關；除此以外，根據TCGA 和GSEA 數(shù)據集分析，在TMEFF2 低表達的胃癌組織中，與細胞增殖、凋亡和DNA 損傷等相關的基因表達更豐富，例如蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1 被鑒定為TMEFF2 的結合蛋白和TMEFF2 功能的中介體[14]。說明TMEFF2 在腫瘤發(fā)生中可通過增加細胞凋亡和阻斷細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖。此外Li K 等[15]在對35 例人胰腺組織及鄰近正常胰腺組織標本，以及5 例人胰腺癌細胞系進行了研究，結果顯示與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中TMEFF2 蛋白和基因均表達下調。而且上調胰腺癌細胞中TMEFF2 表達，可抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，同時抑制了p-STAT3、VEGF 表達，并增加了SHP-1 蛋白的表達，說明TMEFF2 可通過靶向結合SHP-1 調節(jié)STAT3/VEGF通路，進而在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用。然而Elahi A等[16]發(fā)現(xiàn)TMEFF2 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中均無表達，并推測TMEFF2 在大腸癌中表達缺失，可能不參與大腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。在本研究中，TMEFF2 蛋白在EC 組織中表達量普遍下調，且陽性表達率明顯低于正常子宮內膜組織或癌前病變組織，說明在子宮內膜癌變過程中，TMEFF2 扮演著重要角色，可能是EC 發(fā)生的一個潛在的生物標志物。

除此以外，TMEFF2 在其啟動子區(qū)存在CpG島，從TSP 開始跨度從-650 到+1 個堿基；而且TMEFF2 基因啟動子及其5’-上游CpG 島在許多癌癥中被證實存在高甲基化[17-19]。如Chen E 等[20]通過MSP 法檢測，發(fā)現(xiàn)59.5%的腎透明細胞癌組織中存在TMEFF2 基因高甲基化情況，而且TMEFF2 基因甲基化多發(fā)生于中晚期腫瘤組織中，且與患者預后不良有關。早在本世紀初，Young J 等[21]通過RTPCR 法分析顯示，TMEFF2 在28/30 例正常黏膜組織中呈陽性表達，而在結直腸癌組織中僅有7/30 例表達，且經雜合性缺失（LOH）分析顯示僅有1 例結直腸癌出現(xiàn)TMEFF2 基因LOH。另外46 例結直腸癌組織在49 個CpG 位點上的DNA 甲基化程度超過30%。這與本研究結果基本一致，在本研究中EC組織普遍存在TMEFF2 基因啟動高甲基化狀態(tài)，且與TMEFF2 蛋白表達缺失有關。張文濤等[22]利用DNA 甲基轉移酶抑制劑-5-氮雜-2’脫氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine，5-Aza-DC）處理Bca 細胞系后，TMEFF1 mRNA 和蛋白表達得到恢復，細胞增殖、遷移和侵襲明顯被抑制。此外Young J 等[23]團隊對對大腸癌體細胞和生殖系突變的全基因搜索，在63 個腫瘤和相應的正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)TMEFF2基因的致病突變；而Chen E 等[20]團隊對子宮內膜病變全譜中的5 個基因進行了定量甲基化分析，證實EC 組織中TMEFF2 基因甲基化指數(shù)高于正常子宮內膜組織。上述這些結果均表明DNA 甲基化而非LOH 是抑制TMEFF2 表達的主要影響因素，這也解釋了本研究結果。此外也說明TMEFF2 基因的啟動子甲基化是EC 中常見的表觀遺傳事件。檢測TMEFF2 基因的表觀甲基化可能是一個有價值的標記，用于鑒別診斷癌前病變中未檢測到的EC 患者。

綜上所述，EC 組織中普遍存在TMEFF2 蛋白表達缺失以及TMEF22 基因高甲基化狀態(tài)，而且TMEFF2 基因啟動子甲基化可能是導致EC 組織中TMEFF2 蛋白表達降低的主要原因之一。本研究結果對于探討EC 的發(fā)病機制以及尋找早期診斷的有效生物標志物具有重要意義，并有助于確定EC 的潛在治療靶點。