載脂蛋白E基因多態(tài)性對(duì)慢性腎臟病的診斷價(jià)值*

李 全，沈建江，楊 琳，李鵬飛

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210029

慢性腎臟病(CKD)在全球已成為一個(gè)嚴(yán)重威脅人類健康的問題，在我國CKD患病率高達(dá)10.8%[1]。CKD發(fā)病率與腎衰竭早期觀察到的腎小球?yàn)V過率(eGFR)下降程度有關(guān)[2]。有研究表明，CKD患者的載脂蛋白E(ApoE)基因型對(duì)脂蛋白水平和分布的調(diào)控受到多種因素的干擾[3]。ApoE常見3種等位基因(ε2、ε3、ε4)共有6種組合形式(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4和ε4/ε4)[4]，根據(jù)文獻(xiàn)[5]將其分為3種基因型，包括E2、E3和E4型。

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，由于ApoE異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的差異，它們對(duì)脂蛋白具有不同的結(jié)合能力及結(jié)合偏好，因此會(huì)對(duì)脂蛋白代謝產(chǎn)生各種影響[6]。ApoE的基因多態(tài)性會(huì)對(duì)脂蛋白水平產(chǎn)生影響并對(duì)CKD的輔助診斷和臨床分期具有臨床意義[7]。本研究以本院收治的CKD患者作為研究對(duì)象，采用PCR芯片雜交法對(duì)ApoE基因進(jìn)行分型，評(píng)估ApoE基因多態(tài)性及ApoE水平在CKD輔助診斷及臨床分期中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1—6月就診于本院腎內(nèi)科的122例CKD患者納入CKD組，其中男68例，女54例；年齡22～76歲，平均(52.5±13.4)歲；根據(jù)改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)對(duì)CKD的分期標(biāo)準(zhǔn)，122例CKD患者中CKD3期43例，CKD4期41例，CKD5期38例；所有檢測(cè)病例原發(fā)病均為慢性腎小球腎炎。CKD組病例納入標(biāo)準(zhǔn)：CKD病史超過1年，年齡超過18歲，能及時(shí)隨訪。選取同期本院36例健康體檢者作為健康對(duì)照組，其中男19例，女17例；年齡23～77歲，平均(43.3±9.5)歲。健康對(duì)照組與CKD組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過本院倫理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 美國貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀(Beckman公司)。ABI7500全自動(dòng)PCR分析儀(Beckman公司)；血清ApoE測(cè)定使用四川邁克檢驗(yàn)試劑盒(批號(hào)：20189)；質(zhì)控使用伯樂質(zhì)控品(批號(hào)：24560)；ApoE基因檢測(cè)試劑盒采購于珠海賽樂奇公司(批號(hào)：2021903)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 所有研究對(duì)象均空腹采集靜脈血，分離膠促凝管采集血液5 mL，3 500 r/min離心5 min分離血清，檢測(cè)ApoE水平，同時(shí)采集2 mL EDTA-K2抗凝血檢測(cè)ApoE基因型。

1.3.2ApoE基因型檢測(cè) 本研究ApoE基因型采用PCR芯片雜交法進(jìn)行檢測(cè)，提取DNA，50 ℃ 2 min；95 ℃變性15 min；94℃ 30 s，65 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在99 ℃加熱裂解5 min，迅速冰浴5 min。取20 μL上述產(chǎn)物至100 μL雜交液中，混勻后加入基因芯片孔中。將基因芯片置于雜交儀上55 ℃雜交60 min，室溫放置5 min。再將芯片放入50 ℃預(yù)熱的洗滌液A中浸泡2 min，然后將芯片取出離心，甩干芯片表面的水漬。最后用BW反應(yīng)液100 μL加在芯片表面，35 ℃反應(yīng)15 min后，將芯片洗滌4次，然后將顯色液滴加在芯片表面，35 ℃避光孵育10 min，最后沖洗芯片2次后晾干讀片。

1.3.3eGFR檢測(cè) 應(yīng)用AU5800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清肌酐水平，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算得到eGFR。

2 結(jié) 果

2.1ApoE各基因型在CKD組及健康對(duì)照組中的分布差異 本研究共檢測(cè)122例CKD患者及36例健康體檢者的ApoE基因型，122例CKD患者中E2、E3和E4基因型分別占20.5%(25/122)、65.6%(80/122)和13.9%(17/122)，其中CKD3期、4期和5期患者E2基因型占比分別為23.3%(10/43)、19.5%(8/41)和18.4%(7/38)，E3基因型分別為60.5%(26/43)、68.3%(28/41)和68.4%(26/38)，E4基因型分別為16.3%(7/43)、12.2%(5/41)和13.2%(5/38)。36例健康體檢者E2、E3和E4基因型分別占22.2%(8/36)、36.1%(13/36)和41.7%(15/36)。ApoE各基因型在CKD組和健康對(duì)照組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.695，P<0.05)，E3基因型在CKD組中所占比例明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。CKD組3、4、5期患者的ApoE各基因型分別與健康對(duì)照者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.876、12.236、11.845，P<0.05)。

2.2不同基因型患者的ApoE水平在各CKD分期中比較 本次共檢測(cè)122例CKD患者血清ApoE水平，經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)E3基因型患者血清ApoE水平在CKD各期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其水平隨著病情進(jìn)展呈逐漸升高趨勢(shì)，而在E2及E4基因型患者中未發(fā)現(xiàn)ApoE水平有升高或下降趨勢(shì)。見表1。

表1 不同基因型患者的ApoE水平在各CKD分期中比較

2.3ApoE水平與eGFR的相關(guān)性分析 在不同基因型組間比較發(fā)現(xiàn)，E3基因型患者中ApoE水平與eGFR呈負(fù)相關(guān)(r=-0.35，P<0.05)。見圖1。

圖1 E3基因型患者ApoE水平與eGFR的相關(guān)性

3 討 論

CKD是一種慢性進(jìn)展性腎臟疾病，除腎臟移植外，暫無有效的治愈方法[8]。在CKD患者病情進(jìn)展過程中只能靠透析以維持生命，患者晚期的各種并發(fā)癥也嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量[9]。因此，實(shí)現(xiàn)早期對(duì)CKD患者的病情評(píng)估及診斷有著重要意義。

ApoE是一種參與脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸?shù)奶堑鞍譡10]，而CKD患者常常會(huì)出現(xiàn)各類血脂代謝問題[11]，本研究針對(duì)ApoE基因多態(tài)性及水平在CKD各期患者中的變化特點(diǎn)，從而探討其在CKD輔助診斷及臨床分期中的應(yīng)用價(jià)值。本研究共檢測(cè)122例CKD患者，其中E2、E3和E4基因型分別占20.5%(25/122)、65.6%(80/122)和13.9%(17/122)，在所有CKD患者中E3基因型占比高達(dá)65.6%，明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究結(jié)果與之前的一項(xiàng)研究結(jié)果一致[12]。此外，本研究結(jié)果表明，在E3基因型患者中，血清ApoE水平隨著CKD病情的進(jìn)展而出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？赡茉蚴菍?duì)于E3基因型的CKD患者，ApoE水平對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用，隨著疾病的進(jìn)展而逐漸升高，是一種非保護(hù)性因子[13-14]。在E2及E4基因型患者中血清ApoE水平未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的變化趨勢(shì)[15]。后期將繼續(xù)對(duì)E3基因型患者ApoE對(duì)疾病的影響機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)CKD患者腎臟的濾過屏障損傷，腎小球?yàn)V過功能受損導(dǎo)致eGFR降低，這一結(jié)果與國內(nèi)外諸多報(bào)道相符[16-17]。本研究還增加eGFR與ApoE基因型的相關(guān)性分析，研究發(fā)現(xiàn)在E3基因型患者中ApoE水平與eGFR呈負(fù)相關(guān)[18]。出現(xiàn)這一情況進(jìn)一步說明E3基因型患者的ApoE可能參與腎臟損傷過程，ApoE可能是一種非保護(hù)性因素，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道高ApoE水平是一種非保護(hù)機(jī)制相一致。

綜上所述，CKD E3基因型患者ApoE水平與CKD病情進(jìn)展有一定的相關(guān)性，在E3基因型患者中，ApoE水平越高越不利于保護(hù)腎臟。