單倍體甜瓜染色體加倍技術(shù)研究

高寧寧 李曉慧 康利允 梁慎 常高正 李海倫 王慧穎 王琰 徐小利 趙衛(wèi)星

摘? ? 要：探究秋水仙素對甜瓜單倍體加倍的影響，以便為甜瓜遺傳育種研究提供新材料。以甜瓜大孢子離體培養(yǎng)獲得的單倍體為試材，利用不同濃度秋水仙素直接加入培養(yǎng)基和浸芽后接種到芽伸長培養(yǎng)基兩種方法進行甜瓜單倍體的加倍試驗。70 mg·L-1秋水仙素直接加入培養(yǎng)基加倍頻率最高為37%，組培苗成活率為67%，700 mg·L-1秋水仙素附加1.5% DMSO浸芽處理2 h加倍頻率最高可達58%，成活率為100%。在不添加秋水仙素的培養(yǎng)基中，添加0.2 mg·L-1 KT加倍率為8%～17%，表明激素KT也能誘導(dǎo)單倍體植株加倍。加倍植株經(jīng)流式細胞儀倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)除存在單倍體、二倍體外，還存在混倍體，100 mg·L-1秋水仙素浸芽處理6 h嵌合體的比例最高為75%。結(jié)果表明，秋水仙素浸芽處理效果好于直接加入培養(yǎng)基，700 mg·L-1秋水仙素浸芽處理2 h加倍頻率最高為58%。

關(guān)鍵詞：甜瓜;單倍體;秋水仙素;染色體加倍

中圖分類號：S652 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）06-028-05

Study on chromosome doubling technique of haploid muskmelon

GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， LIANG Shen， CHANG Gaozheng， LI Hailun， WANG Huiying， WANG Yan， XU Xiaoli， ZHAO Weixing

（Henan Academy of Agricultural Sciences， Horticulture Institute， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to explore the effect of colchicine on haploid doubling of muskmelon and provide new materials for the genetic and breeding research， the haploid muskmelon obtained from megaspore culture in vitro was used as the test material. The haploid doubling test of muskmelon was conduced by adding colchicine with different concentrations to the medium and immersing the buds with colchicine then inoculated into the medium of bud elongation. The maximum doubling frequency of 70 mg·L-1 colchicine directly added to the medium was 37%， and the survival rate of tissue cultured seedling was 67%. The maximum doubling frequency of 700 mg·L-1 colchicine plus 1.5% DMSO immersing buds for 2 h was up to 58%， and the survival rate was 100%. The doubling rate of adding 0.2 mg·L-1 KT to the medium without colchicine was 8%-17%， which indicated that KT could also induce the doubling of haploid plants. In addition to haploid and diploid plants， there were also mixoploid plants by flow cytometry identification. The proportion of chimeras was the highest， up to 75% by immersing buds in 100 mg·L-1 colchicine solution for 6 h. The results suggested that the effect of colchicine immersing buds was better than that of adding directly into the medium， and the doubling frequency was the highest， up to 58% by immersing buds in 700 mg·L-1 colchicine solution for 2 h.

Key words： Muskmelon; Haploid; Colchicine; Chromosome doubling

甜瓜（Cucumis melo L.）屬于葫蘆科，是世界十大水果之一，我國擁有豐富的甜瓜資源，但遺傳基礎(chǔ)狹窄。利用常規(guī)育種手段進行甜瓜品種改良的周期長且效率低，單倍體材料的基因型和表現(xiàn)型完全一致，經(jīng)過染色體加倍后可產(chǎn)生純合的二倍體植株，利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)可大大提高育種效率，縮短育種周期。另外，純系群體具有重要的遺傳學(xué)研究價值，可應(yīng)用于基因定位、克隆以及遺傳圖譜的構(gòu)建等。單倍體植株可以通過人工誘導(dǎo)獲得，也可以自發(fā)產(chǎn)生，但在自然界中自發(fā)產(chǎn)生單倍體的頻率極低[1]。人工誘導(dǎo)染色體加倍常用的試劑主要是秋水仙素，其能夠阻止微管的聚合，從而抑制紡錘絲的形成，使染色體不能分向兩極，導(dǎo)致新生細胞染色體加倍。之后發(fā)現(xiàn)萘啶乙烷、吲哚乙酸、藜蘆堿等植物堿、黃草消和氟樂靈等除草劑、植物激素等[2-3]也可以誘導(dǎo)染色體加倍，加倍試劑中通常添加二甲基亞砜（DMSO）來提高加倍效率。染色體加倍常采用的方法有浸泡法、注射法、組織培養(yǎng)法等[4]。1979 年，白守信等[5]利用秋水仙素對單倍體小麥加倍獲得成功，是國內(nèi)最早的有關(guān)單倍體加倍的研究報道。目前，利用秋水仙素進行單倍體加倍的研究在玉米[6-8]、小麥[9]、黃瓜[10]、甜瓜[11-13]等作物上均有報道。對甜瓜單倍體誘導(dǎo)，由于單倍體植株獲得的頻率較低，前人對甜瓜單倍體植株染色體加倍的研究較少。在甜瓜單倍體加倍研究中，不同基因型材料相同化學(xué)試劑處理加倍率差異較大，加倍率受不同基因型材料的影響較大，且加倍率較低、嵌合體發(fā)生頻率高。前人的研究大多集中在移栽后對單倍體植株進行加倍方面，但受到環(huán)境和植株生長周期的影響較大。因此，筆者以甜瓜大孢子培養(yǎng)獲得的單倍體為材料，利用組織培養(yǎng)法將不同濃度秋水仙素加入培養(yǎng)基和不同濃度秋水仙素浸泡離體芽時間長短對單倍體進行加倍，探究最佳的秋水仙素加倍濃度和時間，以獲得純合的二倍體植株，為甜瓜新品種選育和遺傳研究提供材料。

1 材料和方法

1.1 材料

以厚皮甜瓜品種將軍玉（市場上已推廣的雜種1代）大孢子離體培養(yǎng)誘導(dǎo)出的單倍體植株（經(jīng)流式細胞儀倍性鑒定）為材料[14]，研究不同濃度的秋水仙素在甜瓜單倍體加倍中的效果。材料由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西瓜甜瓜研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素加入培養(yǎng)基加倍 以甜瓜芽伸長培養(yǎng)基（MS+0.2 mg·L-1 KT+15%椰汁）作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其中分別添加不同質(zhì)量濃度的秋水仙素 （0、30、50、70、100 mg·L-1）制成加倍培養(yǎng)基，在超凈工作臺切單倍體植株芽生長點1 cm左右，接種到加倍培養(yǎng)基中，在溫度（25±2）℃、光照度3000～4000 lx、光照時間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基中。試驗共5個處理，每個處理接種4個單倍體離體芽，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計加倍處理后幼苗的成活數(shù)。成活率=成活植株數(shù)/處理植株數(shù)×100%。

1.2.2 秋水仙素浸泡離體芽加倍 在超凈工作臺上切取單倍體植株的芽生長點1 cm左右，置于過濾滅菌的不同質(zhì)量濃度的秋水仙素（0、100、400、700、1000 mg·L-1）與1.5%的二甲基亞砜（DMSO）的混合溶液中分別浸泡8 h和6 h、8 h和6 h、6 h和4 h、4 h和2 h、2 h和1 h，用過濾滅菌的1.5%的DMSO浸泡8 h、6 h作為對照，無菌水沖洗3次后接種到芽伸長培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。試驗共10個處理，每個處理接種4個單倍體離體芽，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計加倍處理后幼苗的成活數(shù)。

1.2.3 單倍體加倍植株的倍性鑒定 切取一片新長出的嫩葉，利用德國PARTEC公司生產(chǎn)的CyFlowR Cube 8流式細胞儀對處理成活的植株進行倍性鑒定，以未經(jīng)秋水仙素處理的單倍體植株作為對照，并計算加倍率。加倍率=加倍植株數(shù)/處理存活植株數(shù)×100%。

1.2.4 二倍體植株生根及移栽馴化 將加倍成功的植株轉(zhuǎn)接到芽生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA（0.1、0.2 mg·L-1），待長出粗壯根系后，將其從培養(yǎng)瓶中取出，洗去根上附著的培養(yǎng)基，在清洗時要輕，防止將根系折斷。然后，將植株移栽到含有草炭、蛭石等的基質(zhì)中，于（25±2）℃溫室中馴化7～15 d，最后移栽到田間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 22軟件進行方差分析，采用FCS Express V3軟件對流式數(shù)據(jù)進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素加入培養(yǎng)基加倍分析

試驗將不同濃度的秋水仙素添加到芽伸長培養(yǎng)基中，對甜瓜單倍體芽進行加倍處理，利用流式細胞儀進行倍性鑒定。結(jié)果表明（表1），隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高，其加倍率也有所上升，70 mg·L-1秋水仙素加倍率最高可達37%，但秋水仙素為100 mg·L-1時又下降至17%，且成活率最低為50%，植株葉片易黃化枯萎，說明高濃度的秋水仙素對植株有毒害作用。倍性鑒定表明，除單倍體（圖1-A、B）、二倍體（圖1-A、D）外，還存在n+2n的混倍體（圖1-A、C），每個處理中單倍體的占比最高，混倍體占比最低，隨著處理濃度的升高，混倍體的比例也升高，最高可達25%，但秋水仙素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時下降至0。從試驗結(jié)果看，在不添加秋水仙素的芽伸長培養(yǎng)基上，僅添加0.2 mg·L-1的KT，植株成活率為100%，加倍率為8%，表明細胞分裂素KT在一定程度上可以誘導(dǎo)單倍體植株加倍。

2.2 秋水仙素浸泡離體芽加倍分析

試驗利用不同濃度的秋水仙素和1.5%DMSO混合液浸泡離體芽生長點，進行染色體加倍處理，芽成活率均為100%。流式細胞儀倍性鑒定結(jié)果顯示（表2），700 mg·L-1秋水仙素處理2 h加倍頻率最高為58%，其次為秋水仙素700 mg·L-1處理4 h和1000 mg·L-1處理1 h，其加倍頻率為50%，低質(zhì)量濃度秋水仙素100 mg·L-1處理8 h和6 h，加倍頻率最低，為25%。隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高，加倍頻率也逐漸升高，但在質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1時，又有所下降，且再生苗后期黃化較為嚴重。從浸泡處理時間來比較，低質(zhì)量濃度400 mg·L-1秋水仙素處理時，浸泡時間長加倍頻率高，高質(zhì)量濃度700 mg·L-1和1000 mg·L-1秋水仙素處理時，浸泡時間短加倍頻率高，表明高濃度秋水仙素對再生苗的生長有一定的抑制作用。同時，試驗發(fā)現(xiàn)利用100 mg·L-1秋水仙素處理8 h和6 h，混倍體出現(xiàn)概率較高分別為58%和75%，其次為1000 mg·L-1秋水仙素處理2 h，其混倍體的概率為25%。在不添加秋水仙素僅用DMSO浸泡8 h和6 h的芽，加倍率為17%，表明培養(yǎng)基中的KT能夠誘導(dǎo)單倍體植株加倍，經(jīng)過DMSO浸泡處理提高了加倍頻率。

2.3 離體植株生根、移栽及馴化

將單倍體加倍獲得的二倍體植株（圖2-A）在添加0.1、0.2 mg·L-1 IAA的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明，IAA質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時，植株根系生長較快且健壯（圖2-B），IAA質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時，植株根系生長慢且細弱，高濃度的IAA抑制根的形成。移栽時，將根系上的培養(yǎng)基清洗干凈（圖2-C），防止移栽后污染而導(dǎo)致根系腐爛，隨后移栽到盆栽基質(zhì)中（圖2-D），覆蓋塑料膜保溫、保濕，溫度保持在25℃左右，馴化7～15 d，成活率為65%，移栽到田間（圖2-E、F），移栽成活率為92%。

3 討論與結(jié)論

秋水仙素加倍是秋水仙素與正在分裂的植物幼嫩組織細胞接觸，通過維管系統(tǒng)在植物體內(nèi)迅速擴散，抑制紡錘絲的形成，使細胞整齊地阻止在分裂中期，實現(xiàn)植物染色體加倍 [15-16]。筆者在本研究中利用組織培養(yǎng)法將不同濃度秋水仙素加入培養(yǎng)基和不同濃度秋水仙素浸泡離體芽時間長短對單倍體進行加倍，發(fā)現(xiàn)利用秋水仙素浸泡離體芽之后接入芽伸長培養(yǎng)基加倍效果好于秋水仙素直接加入培養(yǎng)基，秋水仙素浸芽處理加倍頻率最高可達58%，成活率為100%，而直接加入培養(yǎng)基加倍頻率最高為37%，植株成活率較低（在50%～75%之間），且植株葉片易黃化，說明秋水仙素加入培養(yǎng)基長時間的吸收滲透對單倍體芽產(chǎn)生了一定的毒害作用，使植株的再生能力變差，這跟賈媛媛等[17]將秋水仙素加入培養(yǎng)基對甜瓜單倍體加倍研究和付文苑等[10]對黃瓜單倍體加倍研究的結(jié)論一致。

將不同濃度的秋水仙素添加到芽伸長培養(yǎng)基中，對甜瓜單倍體芽進行加倍處理，隨著秋水仙素濃度的升高，其加倍率也有所上升，70 mg·L-1秋水仙素加倍率最高可達37%，但秋水仙素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時又下降至17%，研究結(jié)果高于賈媛媛等[17]將甜瓜單倍體芽放入添加不同濃度秋水仙素培養(yǎng)基中獲得的最高7.8%的加倍率，同時也高于付文苑等[10]用1000 mg·L-1的秋水仙素添加到培養(yǎng)基中的研究，植株全部死亡，加倍率為0;但低于Bouvier等[18]對蘋果單倍體加倍的研究，利用低質(zhì)量濃度10 mg·L-1秋水仙素處理30 d，加倍頻率高達77.8%，這可能與作物種類及秋水仙素濃度不同有關(guān)。在不添加秋水仙素的培養(yǎng)基中，添加0.2 mg·L-1 KT加倍率可達8%，這與許衡[19]利用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的研究結(jié)果一致，添加0.2 mg·L-1 KT的培養(yǎng)基能夠提高植物變異率，認為可能是由于KT有利于促進細胞分裂，從而使處于有絲分裂時期的細胞增多。在倍性鑒定中發(fā)現(xiàn)除存在單倍體、二倍體植株外，還存在混倍體。前人Lotfi等[20]用500 mg·L-1秋水仙素處理6 h混倍體的概率高達86%，在本研究的培養(yǎng)基中添加70 mg·L-1秋水仙素嵌合體的比例最高可達25%，100 mg·L-1秋水仙素浸芽處理6 h嵌合體的比例最高可達75%，原因可能是秋水仙素處理過程中有絲分裂不穩(wěn)定而有混倍組織產(chǎn)生。

利用不同濃度的秋水仙素和1.5%DMSO混合液浸泡離體芽生長點，進行染色體加倍處理。隨著秋水仙素濃度的升高，加倍頻率也逐漸升高，但在質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1時，又有所下降。秋水仙素低質(zhì)量濃度100 mg·L-1處理8 h和6 h，加倍頻率最低為25%;700 mg·L-1秋水仙素處理2 h，加倍頻率最高為58%。研究結(jié)果高于賈媛媛等[17]和張永兵等[21]利用250 mg·L-1秋水仙素溶液浸泡甜瓜單倍體芽8 h的處理，加倍率分別為13.7%和29.4%，說明在本研究中設(shè)置的秋水仙素質(zhì)量濃度700 mg·L-1處理2 h效果較好，比前人研究的甜瓜單倍體加倍率分別提高了3.2倍和1.0倍。但低于Yetisir等[11]利用500 mg·L-1秋水仙素浸泡甜瓜離體芽的加倍率（90%），及付文苑等[10]利用0.1%的秋水仙素加5%的DMSO處理黃瓜莖尖1 h的加倍率（72.5%），這可能與不同基因型材料及秋水仙素使用濃度有關(guān)，有研究表明不同基因型材料的單倍體染色體加倍率差異較大[22]。在不添加秋水仙素僅用DMSO浸泡8 h和6 h的芽，其加倍率為17%，比未經(jīng)浸泡芽的加倍率提高了1.1倍，表明芽分化培養(yǎng)基中添加激素KT能夠誘導(dǎo)單倍體植株加倍，經(jīng)過DMSO浸泡處理提高了其加倍率。Sanders等[23]在懸鉤子染色體加倍液中加入DMSO，加倍率提高了4 倍。DMSO是一種助滲劑，本身對染色體的加倍沒有作用，但是可以提高植物組織的穿透力，促進秋水仙素、KT等滲入分生組織，進而提高加倍效率[5]。

單倍體植物可以在短時間內(nèi)獲得純合的二倍體，快速選育自交系，提高育種效率。因此，提高單倍體加倍效率是今后研究的重點。筆者在本研究中建立的組織培養(yǎng)染色體加倍及再生體系，不受環(huán)境以及植株生長發(fā)育周期的影響，將為甜瓜遺傳育種和基礎(chǔ)研究等提供新材料，提高甜瓜育種效率，快速實現(xiàn)育種目標(biāo)。

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