大鯢虹彩病毒和嗜水氣單胞菌混合感染的診療

李亮亮，孫樂(lè)天，張 卓，衛(wèi)澤珍

（太原動(dòng)物園，太原 030009）

大鯢（Andrias davidanus）俗稱(chēng)娃娃魚(yú)，屬于兩棲綱脊索動(dòng)物門(mén)有尾目隱鰓鯢科大鯢屬，是現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，體長(zhǎng)1 m左右，最長(zhǎng)可達(dá)2 m，體重20～25 kg[1]，為國(guó)家重點(diǎn)Ⅱ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物，世界自然保護(hù)聯(lián)盟（International union for conserva?tion of nature，ICUN）紅色名錄中為極危級(jí)（CR級(jí)），具有重要的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái)由于環(huán)境等原因造成野生大鯢的數(shù)量急劇減少[2]。

大鯢虹彩病毒（Andrias davidianusiridovirus,ADIV）屬于蛙病毒屬（Ranavirus）成員，為雙股DNA病毒。感染該病毒后發(fā)病速度快、傳染性極強(qiáng)，幼鯢病發(fā)致死率可高達(dá)100%，成鯢死亡率亦在90%以上，在陜西[3-4]、貴州[5]報(bào)道發(fā)生過(guò)大鯢虹彩病毒感染，并且造成大鯢大量死亡，目前尚無(wú)有效的治療方法[6]。2017年9月—11月份，山西某地飼養(yǎng)的大鯢陸續(xù)有7只死亡，體表和四肢可見(jiàn)多處潰爛、充血及出血。解剖可見(jiàn)肝臟腫脹、脾臟上有針尖狀的白點(diǎn)，腸道上有彌漫性出血。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，診斷為嗜水氣單胞菌和大鯢虹彩病毒混合感染。通過(guò)有效的防治措施，大鯢病情得到有效控制?，F(xiàn)將診治過(guò)程報(bào)道如下。

1 病料的采集及相關(guān)耗材

1.1 病料的采集

病料采集于山西省某單位。大鯢死亡后立即采集病料，放于自封袋內(nèi)，置于-20℃冰箱中凍存。

1.2 主要試劑

常規(guī)藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、Ex Taq，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；基因組提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

PCR儀，美國(guó)MJ公司產(chǎn)品；多用途電泳儀，北京六一儀器廠產(chǎn)品，DYY-12型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)UVP公司產(chǎn)品。

1.4 引物的合成

根據(jù)虹彩病毒主要核衣殼蛋白（MCP）基因序列設(shè)物，引物序列為如下，F(xiàn)：5'-GACTTGGCCACT?TATGAC-3'，R：5'-GTCTCTGGAGAAGAAGAA-3'，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及染色鏡檢

無(wú)菌條件下采集肝臟組織，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色及鏡檢；另外，挑取單個(gè)菌落劃線進(jìn)行純化培養(yǎng)。

在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，菌落呈淡黃色、邊緣整齊、微凸、圓形。

經(jīng)革蘭氏染色后，在鏡下觀察，可見(jiàn)菌落為革蘭氏陰性，形狀呈短桿狀，略呈弧狀，兩端鈍圓，單個(gè)分散排列。

2.2 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果以抑菌圈直徑（mm）作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇10種常規(guī)藥敏紙片法測(cè)定抗菌素對(duì)分離菌株的抗藥譜，接種分離菌株，然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑。

分離菌株對(duì)10種藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，該菌株對(duì)頭孢曲松鈉、恩諾沙星敏感，對(duì)阿米卡星和復(fù)方新諾明中度敏感，對(duì)青霉素、慶大霉素、氟苯尼考、卡那霉素、氨芐西林和阿莫西林具有耐藥性。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3 細(xì)菌生化試驗(yàn)

挑取普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上可疑的菌落，再接種到普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于培養(yǎng)箱中37℃，培養(yǎng)24 h后，挑取2個(gè)菌落到2 mL 0.9%的生理鹽水中，制成McFarland（麥?zhǔn)媳葷岱ǎ?.5濁度的菌懸液，再用滅菌管接種到生化發(fā)酵管內(nèi)，石蠟封口。于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行判定。

生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，分離的細(xì)菌能夠使葡萄糖產(chǎn)氣，發(fā)酵甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、水楊苷，不能發(fā)酵乳糖和肌醇，水解七葉苷，吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)為陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧為陰性。與第8版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)照，符合的嗜水氣單胞菌生化鑒定特征。

表2 生化鑒定結(jié)果

2.4 PCR檢測(cè)

稱(chēng)取病死大鯢的肝臟組織1 g，利用基因組DNA提取試劑盒提取DNA。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為510 bp。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包括10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，Mix 8 μL，去離子水10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

從患病大鯢肝臟組織提取的基因組中均擴(kuò)增出約510 bp的DNA片段，見(jiàn)圖1，與預(yù)期結(jié)果一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列和GenBank中虹彩病毒的主要核衣殼蛋白編碼基因有高度同源性，核苷酸相似性達(dá)98%，確定患病大鯢感染虹彩病毒。

圖1 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

3 診斷

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、解剖結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確斷患病大鯢為嗜水氣單胞菌和大鯢虹彩病毒混合感染。

4 防治措施

用聚維酮碘對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境和用具進(jìn)行徹底的消毒?；疾〈篥F進(jìn)行單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，肌肉注射頭孢曲松鈉進(jìn)行治療。

對(duì)未發(fā)現(xiàn)癥狀的大鯢進(jìn)行預(yù)防：首先使用1‰高錳酸鉀或2%聚維酮碘浸泡30 min，然后再加入黃芪多糖、維生素C、頭孢曲松鈉、電解多維進(jìn)行浸泡。對(duì)投喂的泥鰍用2%聚維酮碘浸泡30 min，沖洗干凈后再投喂。經(jīng)過(guò)上述方法預(yù)防后，病情達(dá)到有效的控制。

5 討論

嗜水氣單胞菌廣泛存在于自然界的水域中[7]，是一種條件性致病菌，引起魚(yú)類(lèi)及其他水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病的一種重要的致病菌[8-11]。當(dāng)環(huán)境溫度過(guò)高時(shí)，容易使水體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)剩，造成水體污染，嗜水氣單胞菌會(huì)大量的繁殖，由于環(huán)境的惡化造成，動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降，從而造成嗜水氣單胞菌入侵機(jī)體引發(fā)動(dòng)物感染[12]。同時(shí)當(dāng)飼養(yǎng)密度過(guò)大、養(yǎng)殖水體循環(huán)緩慢，從而為嗜水氣單胞菌的增殖和感染提供了有利條件。

已經(jīng)有多名研究者相繼報(bào)道了大鯢感染蛙虹彩病毒和（或）嗜水氣單胞菌[3-4]，對(duì)大鯢的養(yǎng)殖場(chǎng)造成很大的危害。大鯢虹彩病毒感染后死亡率達(dá)90%以上，并且還沒(méi)商品化的疫苗可以使用[6]。因此在日常生活中加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好餌料的消毒和新引入大鯢的隔離檢疫工作。

同時(shí)需要建立大鯢疾病的快速診斷技術(shù)，來(lái)指導(dǎo)臨床上的疾病治療。在本例病例上，細(xì)菌的鑒定采用了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和生化試驗(yàn)相結(jié)合的方法，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來(lái)為臨床治療工作提供指導(dǎo)。使用了PCR技術(shù)對(duì)大鯢虹彩病毒進(jìn)行了檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，敏感性高，結(jié)果準(zhǔn)確，容易推廣。鑒于該病的傳染性強(qiáng)、死亡率高，可以對(duì)新引入的大鯢，利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，虹彩病毒確定為陰性后方可混養(yǎng)。