珊瑚共附生DMSP降解菌的分離及其多樣性分析

唐小玉，張穎，張文謙，張燕英，楊清松，董俊德,3,4

(1.中國科學(xué)院南海海洋研究所 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510301；2.煙臺大學(xué) 海洋學(xué)院，山東 煙臺 264005；3.中國科學(xué)院海南熱帶海洋生物實(shí)驗(yàn)站，海南 三亞 572000；4.三亞中科海洋研究院 海南省熱帶海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572000；5.中國科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049)

1 引言

珊瑚礁是地球上生物多樣性最高的生態(tài)系統(tǒng)之一，雖然全球珊瑚礁總面積只占全部海域的0.2%左右，但是卻為大約30%的海洋生物提供棲息地和食物來源，同時(shí)為人類社會(huì)提供食物、藥物、旅游、美學(xué)等方面的實(shí)際效益；另外，珊瑚礁在保護(hù)海岸和維持海洋生態(tài)系統(tǒng)碳、氮生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要的作用[1]。然而，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)非常脆弱，在過去的50年里，受人類活動(dòng)（過度捕撈、農(nóng)業(yè)污染、陸地徑流）、全球變暖及海洋酸化等的影響，珊瑚死亡率急劇上升，導(dǎo)致珊瑚覆蓋率大幅下降[2]。1998年和2010年的珊瑚暖化事件在全球范圍內(nèi)影響了48%的珊瑚礁[3–4]；在第3次全球珊瑚白化事件期間（2014?2017年）[5]，所有熱帶珊瑚礁都經(jīng)歷了異常的海洋溫度事件，這些事件以后可能每年都會(huì)發(fā)生。

珊瑚礁被認(rèn)為是海洋天然硫酸鹽的主要來源，珊瑚蟲、共生藻和微生物都能夠產(chǎn)生二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽（dimethylsulfoniopropionate,DMSP）。DMSP 具有滲透壓調(diào)節(jié)、化學(xué)引誘、抗氧化、冷凍保護(hù)等多種生物學(xué)功能[6]。DMSP是生源性氣體二甲基硫（dimethyl sulfide,DMS）的前體物質(zhì)，海洋中的 DMS主要由 DMSP降解產(chǎn)生。DMS在驅(qū)動(dòng)全球硫循環(huán)和調(diào)節(jié)氣候變化中具有重要作用，海洋中產(chǎn)生的DMS通過海?氣擴(kuò)散的方式進(jìn)入大氣后被氧化成硫酸鹽，其氧化產(chǎn)物促進(jìn)氣溶膠的形成，從而增加了云凝結(jié)核的數(shù)量、提高了云層折射率、減少了地面熱量收入，起到了減緩溫室效應(yīng)的作用[7]。高溫會(huì)引起珊瑚共生體細(xì)胞活性氧自由基（Reactive Oxygen Species,ROS）過量釋放，過量的ROS會(huì)氧化細(xì)胞膜、使蛋白變性并破壞核酸，進(jìn)而對宿主細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致珊瑚的白化[8]。Sunda等[9]研究發(fā)現(xiàn)，DMSP的裂解產(chǎn)物DMS和丙烯酸等能夠有效地捕獲羥基自由基和ROS；并且，DMS能夠擴(kuò)散進(jìn)入光合膜中，顯著地增加細(xì)胞內(nèi)水相和脂質(zhì)膜相的抗氧化保護(hù)功能。高溫脅迫下，珊瑚體內(nèi)DMS和丙烯酸的濃度相應(yīng)地降低，其可能參與到ROS的捕獲中，表明DMSP及其降解產(chǎn)物在珊瑚抗逆反應(yīng)中具有重要的作用[10]。

在海洋中，異養(yǎng)細(xì)菌是DMSP最主要的降解者[11]，了解細(xì)菌降解DMSP的機(jī)制，對海洋中硫循環(huán)意義深遠(yuǎn)。海洋微生物對DMSP的降解主要通過兩條途徑：一條為去甲基化途徑，DMSP經(jīng)去甲基化反應(yīng)生成3-巰基丙酸甲酯（MMPA），進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為甲硫醇（MeSH），該途徑不產(chǎn)生DMS；一條為裂解途徑，DMSP在酶的作用下裂解產(chǎn)生DMS[12–13]。目前，研究者從紅桿菌屬（Rhodobacters）、玫瑰桿菌屬（Roseobacters）、硫桿菌屬（Sulfitobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonadales）菌株中鑒定出相關(guān)的DMSP裂解酶，包括DddP、DddY、DddQ、DddW、DddK和 DddL，其催化DMSP裂解產(chǎn)生DMS和丙烯酸；另一種DMSP裂解酶—DddD，催化DMSP裂解產(chǎn)生DMS和3-羥基丙酸，其常見于海洋單胞菌屬（Marinomonas）[14–16]。

研究發(fā)現(xiàn)，某些珊瑚的共附生細(xì)菌具有降解DMSP的功能，并對珊瑚的健康發(fā)揮著重要作用。如Raina等[17]從多孔鹿角珊瑚（Acropora millepora）和癭葉表孔珊瑚（Montipora aeqituberculata）中分離出能夠降解DMSP的細(xì)菌，這些細(xì)菌大都來自于γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）；并且 DMSP 的降解產(chǎn)物能夠影響珊瑚微生物群落結(jié)構(gòu)，對珊瑚的健康具有重要作用。Tandon等[18]通過比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，Endozoicomonas acroporae可以降解DMSP為DMS，使珊瑚避免受到溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的侵害—溶珊瑚弧菌利用DMSP作為信號分子尋找高溫脅迫下的珊瑚，而DMS不能作為其信號分子[19]。珊瑚共附生DMSP降解菌使得海洋中DMS濃度增加，更多的DMS通過海?氣擴(kuò)散進(jìn)入大氣，對氣候調(diào)節(jié)起到了重要的作用。

目前，有關(guān)珊瑚共附生DMSP降解菌的研究還相對較少，鑒于珊瑚共附生DMSP降解菌在珊瑚應(yīng)對高溫脅迫及氣候調(diào)節(jié)上的重要作用，本文利用純培養(yǎng)技術(shù)從多孔鹿角珊瑚（Acropora millepora）、美麗鹿角珊瑚（Acropora formosa）、指狀鹿角珊瑚（Acropora digitifera）、多棘鹿角珊瑚（Acropora echinata）、鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）和叢生盔形珊瑚（Galaxea fascicularis）中分離篩選 DMSP降解菌，探索DMSP降解菌在6種珊瑚中的多樣性與分布特征，并通過火焰光度檢測器?氣相色譜聯(lián)用技術(shù)分析DMSP降解菌的DMS生產(chǎn)能力，以填補(bǔ)國內(nèi)關(guān)于珊瑚共附生DMSP降解菌研究的空缺。

2 材料與方法

2.1 材料

鹿回頭岸礁（長約為 3 km、寬為 250～500 m）位于海南島南岸，毗鄰三亞市區(qū)，1990年被劃入三亞國家級珊瑚礁自然保護(hù)區(qū)。過去50年來，受人類活動(dòng)的影響，鹿回頭岸礁珊瑚群落組成多樣性嚴(yán)重下降，活珊瑚覆蓋率從約85%下降至12%左右[20]。此外，全球變暖導(dǎo)致鹿回頭岸礁海域水溫升高，使該海域多數(shù)珊瑚物種長期處于溫度脅迫狀態(tài)[21]。樣品采集于2019年9月11日和2019年9月22日進(jìn)行。

2.1.1 樣品采集

6 種珊瑚樣品采自三亞鹿回頭岸礁（18°12′19′N，109°28′27′E）1.5～2 m 水深處，每種珊瑚采集 3 個(gè)重復(fù)樣本，直徑為10～15 cm。采集的樣品放置于溫度為28℃、光照強(qiáng)度為200 μmol/(m2·s)的養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)2 d，之后開展珊瑚共附生DMSP降解菌的分離篩選實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 培養(yǎng)基

改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基的配方[22]：基礎(chǔ)鹽溶液[MgSO4·7H2O，2 g；CaCl2，0.57 g；Fe-EDTA，0.295 g；微量元素母液（MnSO4·H2O，1.790 g；H3BO3，2.8 g；CuSO4·5H2O，0.079 g；ZnSO4·7H2O，0.24 g；Na2MoO4·2H2O，1.26 g；ddH2O，100 mL），1 mL；ddH2O，100 mL]，5 mL；維生素溶液（維生素 B12，2 mg；p-氨基苯酸、核黃素、維生素B6、煙酸 B5、維生素 C、維生素 B1、D-(+)-生物素，各10 mg；ddH2O，1 L），0.5 mL；(NH4)2SO4，0.33 g；NaCl，0.585 g；酵母提取物，0.05 g；蒸餾水，500 mL；滅菌前培養(yǎng)基pH調(diào)至6.4，滅菌后培養(yǎng)基pH用磷酸鹽緩沖液調(diào)至6.8。固體培養(yǎng)基加入9 g瓊脂，其中磷酸鹽緩沖液單獨(dú)滅菌。

甜菜堿或DMSP為唯一碳源改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基：基礎(chǔ)鹽溶液，5 mL；維生素溶液，0.5 mL；(NH4)2SO4，0.33 g；NaCl，0.585 g；甜菜堿或 DMSP，終濃度 5 mmol/L；蒸餾水，500 mL；滅菌前pH調(diào)至6.4，滅菌后pH用磷酸鹽緩沖液調(diào)至6.8。固體培養(yǎng)基加入9 g瓊脂，其中DMSP使用孔徑為0.22 μm的濾器單獨(dú)抽濾滅菌。

2.2 方法

2.2.1 DMSP 降解菌的分離篩選

初篩：截取10 g左右的珊瑚樣品，無菌海水沖洗2～3次以除去珊瑚表面非共附生微生物。將沖洗后的珊瑚樣品包裹于滅菌鋅箔中，錘子砸碎勻漿，轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管，加入20 mL滅菌海水混勻，得到珊瑚母液，每次處理1個(gè)珊瑚樣品以避免不同珊瑚樣品之間的污染。取100 μL母液于200 mL改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，搖床溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為 180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間為 4 d。培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁后，吸取 0.5 mL 稀釋得到 10?1～10?5濃度梯度稀釋液，取 200 μL 10?5濃度稀釋液涂布至以甜菜堿為唯一碳源的改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽固體平板上，28℃條件下培養(yǎng)4 d。挑取平板上的單菌落，采用三區(qū)劃線法接種于新的平板，培養(yǎng)4 d后進(jìn)一步劃線純化，直至平板上各菌落的顏色、形態(tài)一致。

復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種于以DMSP為唯一碳源的改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽固體平板上，觀察其是否能夠生長。

2.2.2 16S rRNA 基因擴(kuò)增

用試劑盒 Bacterial DNA Kit（OMEGA，美國）提取細(xì)菌基因組 DNA。引物27 F（5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′）用于擴(kuò)增 16S rRNA基因，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性 4 min；95℃ 變性 15 s，56℃ 退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，循環(huán) 35 次；最后 72℃ 延伸 10 min。擴(kuò)增體系為：rTaq DNA 聚合酶（takara，大連寶生物）12.5 μL，正反向引物各 0.5 μL，細(xì)菌 DNA 1 μL，無菌去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰的送廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行測序。

2.2.3 菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過Chromas軟件查看16S rRNA基因測序獲得的峰圖，將單一無套峰的16S rRNA基因序列（長約為1 300 bp）導(dǎo)入 NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST 同源性比對，獲得最相似種屬并確定其分類地位。下載相似度最高的菌株的16S rRNA基因序列，通過ClustalW進(jìn)行多序列比對，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接（Neighborjoining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中替換模型選擇Kimura雙參數(shù)（Kimura 2-parameter）模型，用于檢驗(yàn)支持率的重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000次。

2.2.4 DMS 濃度檢測

采用吹掃捕集?冷阱富集氣相色譜法測定DMS濃度。篩選菌株于含有5 mmol/L甜菜堿的改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)至OD600值為0.3左右；取 300 μL 菌液加入到含有 2 mL 5 mmol/L DMSP 改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽液體培養(yǎng)基的進(jìn)樣瓶中，另設(shè)空白對照，于 28℃、180 r/min 條件下培養(yǎng) 48 h[23]。用高純氮?dú)鈱⑴囵B(yǎng)基中的DMS進(jìn)行吹掃，吹掃出的DMS被捕集在浸泡于液氮中的聚四氟乙烯環(huán)形管中；捕集到的氣體使用90℃熱水加熱解析，注入裝有長為3 m、直徑為3 mm的玻璃柱子和火焰光度檢測器的氣相色譜（安捷倫7890A，美國）中進(jìn)行檢測，玻璃柱子中填充有10% DEGS、Chromosorb W-AW-DMCS 混合物。該方法的檢出限約為 0.4 nmol DMS[24–25]。

3 結(jié)果

3.1 DMSP 降解菌 16S rRNA 序列多樣性分析

從6種珊瑚中共分離獲得DMSP降解菌39株，通過16S rRNA基因測序進(jìn)行分類學(xué)鑒定，隸屬于4個(gè)門、6個(gè)綱、19個(gè)屬。其中，21株隸屬于變形菌門（Proteobacteria），包括 α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）9株、γ-變形菌綱 12株；13株隸屬于厚壁菌門（Firmicutes），4株隸屬于放線菌門（Actinobacteria），1株隸屬于異常球菌?棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）（圖 1）。優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），共10株，占比為25.6%；其次為弧菌屬（Vibrio），共7株，占比為17.9%。從鹿角杯形珊瑚分離獲得的DMSP降解菌最多，共10株，隸屬于7個(gè)屬；其次為叢生盔形珊瑚，共7株，隸屬于7個(gè)屬。4種鹿角珊瑚中，從多孔鹿角珊瑚分離獲得的DMSP降解菌最多，7株，隸屬于6個(gè)屬；其次為美麗鹿角珊瑚，6株，隸屬于5個(gè)屬；指狀鹿角珊瑚共附生DMSP降解菌有5株，隸屬于4個(gè)屬；多棘鹿角珊瑚共附生DMSP降解菌最少，共4株，隸屬于3個(gè)屬。從多孔鹿角珊瑚、美麗鹿角珊瑚和鹿角杯形珊瑚分離獲得的DMSP降解菌均以芽孢桿菌屬為主；從多棘鹿角珊瑚分離獲得的DMSP降解菌以不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）為主；從指狀鹿角珊瑚分離獲得的DMSP降解菌以弧菌屬為主（表 1）。

圖1 DMSP 降解菌分類信息Fig.1 Taxonomic information of DMSP degrading bacteria

3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將DMSP降解菌的16S rRNA基因序列導(dǎo)入NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對，并下載同源性最高的序列進(jìn)行ClustalW多序列比對分析，選擇Kimura雙參數(shù)模型采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從圖2中可以看出，39株DMSP降解菌形成3個(gè)大的分支，菌株P(guān)d3單獨(dú)為一支，剩下的38株菌形成兩個(gè)分支。篩選獲得的39株菌，10株與芽孢桿菌屬聚為一支，相似度最高為100%；7株與弧菌屬聚為一支，相似度最高為99.93%；2株與赤桿菌屬（Erythrobacter）聚為一支，相似度為99.48%；2株與不動(dòng)桿菌屬聚為一支，相似度最高為99.79%；2株與微桿菌屬（Microbacterium）聚為一支，相似度最高為99.28%；2株與類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）聚為一支，相似度最高為98.96%；2株與Fulvimarina聚為一支，相似度最高為99.78%；剩下的12株各單獨(dú)聚為一支。

圖2 DMSP 降解菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of DMSP degrading bacteria

3.3 DMS 濃度檢測結(jié)果分析

將篩選獲得的菌株接種到含有5 mmol/L DMSP的改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后，使用火焰光度檢測器?氣相色譜聯(lián)用技術(shù)檢測DMSP降解產(chǎn)物DMS。結(jié)果顯示，可以降解DMSP產(chǎn)生DMS的菌株有20株，分別為Ad1、Ad2、Ad3、Ae1、Ae2、Ae3、Af1、Af2、Am1、Am2、Am3、Am4、Gf1、Gf2、Gf3、Gf4、Gf5、Pd1、Pd2、Pd3，產(chǎn)量為 3.759～16.240 μmol/L；其中，有 9 株菌產(chǎn) DMS能力較強(qiáng)，分別為 Ad1、Ad2、Ad3、Ae1、Af2、Am4、Pd1、Pd2、Pd3，產(chǎn)量分別為 11.826 μmol/L、16.185 μmol/L、16.240 μmol/L、15.220 μmol/L、13.843 μmol/L、10.473 μmol/L、9.430 μmol/L、9.976 μmol/L、9.265 μmol/L（圖 3）。所篩選獲得的DMS產(chǎn)生菌株中，有3株來源于指狀鹿角珊瑚、3株來源于多棘鹿角珊瑚、2株來源于美麗鹿角珊瑚、4株來源于多孔鹿角珊瑚、5株來源于叢生盔形珊瑚、3株來源于鹿角杯形珊瑚。

圖3 DMSP 降解菌株 DMS 產(chǎn)量柱形圖Fig.3 Histogram of DMS production of DMSP degrading bacteria

4 討論

大型有機(jī)體與微生物的共生有助于其對不斷變化的環(huán)境條件的適應(yīng)，對宿主的健康和進(jìn)化具有重要作用[26]。在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中，共生細(xì)菌為珊瑚宿主提供營養(yǎng)物質(zhì)，并通過占用生態(tài)位和分泌抗菌化合物保護(hù)珊瑚不受致病菌的侵害[27–29]。盡管珊瑚共附生DMSP降解菌對珊瑚健康意義重大[17]，但有關(guān)珊瑚共附生DMSP降解菌的研究還相對較少。本研究利用純培養(yǎng)技術(shù)首次分離篩選三亞鹿回頭6種造礁石珊瑚共附生DMSP降解菌，并對其多樣性及降解特性進(jìn)行了分析。早期研究發(fā)現(xiàn)[30]，珊瑚共附生DMSP降解菌主要來自于變形菌門，且大多分布于α-變形菌綱與γ-變形菌綱[11]。本研究獲得9株α-變形菌綱菌、12株γ-變形菌綱菌，其中橙單胞菌科（Aurantimonadaceae）、紅桿菌科（Rhodobacteraceae）、海洋螺菌科（Oceanospirillaceae）和弧菌屬在先前的研究中已被證實(shí)可降解 DMSP[31–33]；然而，玫瑰單胞菌屬（Roseomonas）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、赤桿菌屬、Thalassotale、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、副球菌屬（Paracoccus）和不動(dòng)桿菌屬首次被發(fā)現(xiàn)具有降解DMSP的能力。珊瑚共附生微生物群落組成具有時(shí)間和空間上的差異性，并且不同珊瑚物種具有獨(dú)特的微生物群落多樣性[34]，新的DMSP降解菌的發(fā)現(xiàn)不足為奇。Wagner和Stadtman[35]早在1962年首次發(fā)現(xiàn)了厚壁菌門中可降解DMSP的菌株，并指出該菌株隸屬于梭菌屬（Clostridium）。本研究中，芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和魯梅爾芽孢桿菌屬（Rummeliibacillus）被證明也具有降解DMSP的能力，這擴(kuò)大了厚壁菌門中可降解DMSP菌株的范圍。放線菌門細(xì)菌是常見的珊瑚共附生菌，其可通過產(chǎn)生重要的次生代謝產(chǎn)物保護(hù)珊瑚的健康[36]。林鈺等[37]從馬里亞納海溝沉積物中分離獲得來自于放線菌門的菌株，并通過DMSP降解能力測定發(fā)現(xiàn)某些微桿菌屬、微球菌屬（Micrococcus）細(xì)菌可降解DMSP。本研究分離獲得來自于微桿菌屬、微球菌屬的DMSP降解菌，這與林鈺等的研究結(jié)果相一致。此外，本研究獲得1株隸屬于異常球菌?棲熱菌門的DMSP降解菌，首次證明異常球菌?棲熱菌門菌株具有降解DMSP的能力。假單胞菌屬（Pseudomonas）為典型的珊瑚共生菌并被發(fā)現(xiàn)具有降解DMSP的能力[17]；本研究未獲得該屬的菌株，分析其原因可能是由于本次研究樣品處理過程中黏液丟失過多，而假單胞菌屬細(xì)菌主要存在于珊瑚黏液中[38]。

相關(guān)研究表明[39]，50%～90%的DMSP通過去甲基化途徑轉(zhuǎn)化為MMPA，剩余部分的DMSP通過DMSP裂解酶轉(zhuǎn)化為DMS和丙烯酸。通過去甲基化途徑降解DMSP的細(xì)菌多發(fā)生于玫瑰桿菌屬（Roseobacter）[40]，然而本研究未獲得來自于該屬的菌株。Newton等[41]研究發(fā)現(xiàn)，相比于可培養(yǎng)細(xì)菌，通過去甲基化途徑降解DMSP的玫瑰桿菌屬細(xì)菌多為不可培養(yǎng)細(xì)菌，這為本研究未獲得玫瑰桿菌屬細(xì)菌提供了解釋。能夠降解DMSP產(chǎn)生DMS的細(xì)菌多來自于玫瑰桿菌屬、紅桿菌屬（Rhodobacter）、海洋單胞菌屬及硫桿菌屬（Sulfitobacter）等[42]。Curson 等[14]發(fā)現(xiàn)Fulvimarina菌株含有dddL基因，并證明該菌株具有產(chǎn)DMS能力。本研究篩選獲得的39株DMSP降解菌中，有20株菌的降解產(chǎn)物中可檢測到DMS，表明其通過裂解途徑降解DMSP，剩余19株菌通過去甲基化途徑降解DMSP，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的不同DMSP降解途徑占比相符合。本研究獲得的9株高產(chǎn)DMS菌株中，有3株分別來自于α-變形菌綱中的Fulvimarina、鞘脂單胞菌屬和赤桿菌屬，表明α-變形菌綱中DMS產(chǎn)生菌有廣泛的分類地位。此外，微桿菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌在本研究中也被發(fā)現(xiàn)具有高產(chǎn)DMS的能力，這進(jìn)一步擴(kuò)大了可降解DMSP產(chǎn)生DMS的菌株的范圍。孫浩等[43]研究發(fā)現(xiàn)，可降解DMSP的硫桿菌屬細(xì)菌多分布于深層水體，本次研究樣品采集多位于淺層水體，這可能是導(dǎo)致未獲得硫桿菌屬DMSP降解菌的主要原因。Zhang等[44]對鹿回頭海域4種珊瑚的共附生微生物的功能基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Thalassiobium等菌株具有dmdA基因。然而，在其他區(qū)域的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中，并未發(fā)現(xiàn)珊瑚共附生Thalassiobium菌株具有降解DMSP的功能，表明不同區(qū)域的珊瑚共附生DMSP降解菌存在差異，這為本研究獲得的DMSP降解菌與前人有所差別提供了解釋。此外，本研究以甜菜堿為唯一碳源的改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基對DMSP降解菌進(jìn)行初篩，導(dǎo)致能夠利用DMSP而不能利用甜菜堿的潛在菌株的遺失，這可能是本研究未獲得前人所報(bào)道的DMSP降解菌株的重要原因。

目前，有關(guān)珊瑚益生菌的研究越來越受到科學(xué)家的關(guān)注，如Rosado等[45]通過向珊瑚接種益生菌而增加了珊瑚對白化的抵抗力。DMSP是影響細(xì)菌趨化作用的重要化學(xué)因子，Garren等[19]發(fā)現(xiàn)，溶珊瑚弧菌對DMSP具有一定的趨化反應(yīng)，這對于其致病性具有關(guān)鍵意義。珊瑚共附生DMSP降解菌對DMSP的降解減少了溶珊瑚弧菌對珊瑚的侵害，有力地促進(jìn)了珊瑚的健康。蟲黃藻產(chǎn)生的DMSP主要存在于囊泡、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，其不僅為重要的細(xì)菌趨化因子，并對珊瑚微生物群落結(jié)構(gòu)有著重要的影響[46]。由于珊瑚微生物群落結(jié)構(gòu)與珊瑚健康密切相關(guān)[47]，珊瑚共附生DMSP降解菌通過降解DMSP影響珊瑚微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)而間接影響珊瑚健康。DMS產(chǎn)生菌降解DMSP產(chǎn)生DMS和丙烯酸[13]，捕獲珊瑚因高溫脅迫產(chǎn)生的ROS[8]，減少了ROS對珊瑚的損傷，極大地促進(jìn)了珊瑚對全球氣候變暖的響應(yīng)。DMSP降解菌代謝 DMSP 產(chǎn)生原二植酸（Tropodithietic Acid，TDA），有效抑制了珊瑚致病菌—溶珊瑚弧菌和歐式弧菌（Vibrio owensii）的生長[48]。這些研究表明，珊瑚共附生DMSP降解菌為重要的珊瑚益生菌；然而，有關(guān)珊瑚共附生DMSP降解菌的益生效應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?zāi)壳吧腥狈Α１狙芯刻岢龅亩喾NDMSP降解菌作用機(jī)制，為以后開展DMSP降解菌對珊瑚的益生效應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。

5 結(jié)論及展望

通過以DMSP為唯一碳源的選擇性改良基礎(chǔ)營養(yǎng)鹽培養(yǎng)基，從三亞鹿回頭岸礁6種造礁石珊瑚中分離獲得共附生DMSP降解菌39株，分布于19個(gè)屬。其中，21株菌來自于變形菌門，13株菌來自于厚壁菌門，4株來自于放線菌門，1株來自于異常球菌?棲熱菌門。6種珊瑚中，從鹿角杯形珊瑚中篩選獲得的共附生DMSP降解菌最多，其次為叢生盔形珊瑚。所選的4種鹿角珊瑚中，多孔鹿角珊瑚的共附生DMSP降解菌最多，多棘鹿角珊瑚共附生DMSP降解菌最少。所獲得的菌株中，20株具有產(chǎn)DMS的潛力，9株具有高產(chǎn)DMS的能力。本研究獲得的DMSP降解菌在不同的珊瑚物種之間出現(xiàn)了部分重疊。本研究只關(guān)注了6種珊瑚共附生DMSP降解菌的多樣性分布特征及降解特性，沒有探討DMSP降解菌對珊瑚應(yīng)對高溫脅迫是否具有益生作用，后續(xù)研究可以進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DMSP降解菌是否可以協(xié)助珊瑚應(yīng)對高溫脅迫，為三亞鹿回頭海域的珊瑚保護(hù)提供參考。

致謝：感謝中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所張升輝老師的技術(shù)支持；感謝中國科學(xué)院海南熱帶海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)站為本研究提供實(shí)驗(yàn)平臺。