豬流行性腹瀉病毒在美國(guó)的流行及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陳梅娟，張志誠(chéng)，李繼東

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266032)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)為尼多病毒目、冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員[1]，可引起新生仔豬發(fā)生以急性腹瀉、嘔吐、脫水和高死亡率為特征的接觸性腸道傳染病，即豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)。20世紀(jì)70年代初，PED首次出現(xiàn)在英國(guó)，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國(guó)家[2]。2013年5月 美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)PED，且其迅速傳播，導(dǎo)致美國(guó)31個(gè)州的商業(yè)豬存欄數(shù)量在18個(gè)月內(nèi)損失10%[3]。PEDV作為一種感染豬并導(dǎo)致高死亡率的冠狀病毒，雖無(wú)直接證據(jù)表明其和目前全球流行的新型冠狀病毒SARS-CoV-2有直接關(guān)聯(lián)，但其作為冠狀病毒科、α-冠狀病毒亞屬成員，在遺傳變異、致病力、傳播擴(kuò)散以及宿主選擇等方面存在極大的不確定性，同時(shí)其也是國(guó)際貿(mào)易，尤其是當(dāng)前中美生豬及豬肉貿(mào)易中具有重要檢疫意義的病原微生物。為此，本文在分析美國(guó)豬群PED監(jiān)測(cè)和檢測(cè)情況的基礎(chǔ)上，對(duì)PEDV病原學(xué)、檢測(cè)方法等方面的研究進(jìn)行綜述，以期為從美國(guó)的生豬及豬肉制品入境及其檢疫監(jiān)測(cè)技術(shù)提供支持。

1 PEDV簡(jiǎn)介

1.1 病原學(xué) PEDV基因組是單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約28 kb，主要由3個(gè)部分組成，包括5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)，3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)，7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1a，ORF1b，ORF2～6)[4]。ORF共編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白、4種結(jié)構(gòu)蛋白和1種輔助蛋白?；虻捻樞蚍謩e為：5′-ORF1(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′。ORF1a和ORF1b是位于5′端的2個(gè)重疊的開(kāi)放閱讀框，約占據(jù)病毒全基因組的2/3，ORF1a和ORF1b共同編碼的多聚蛋白(Polyprotein，PP1ab)在翻譯后期被程序性切割而產(chǎn)生16種非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp1～Nsp16)，主要參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。ORF2、ORF4～6分別編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(S、M、E、N)，其中S蛋白是PEDV的主要表面抗原，能夠介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且刺激宿主產(chǎn)生中和抗體；M蛋白為跨膜蛋白，在病毒裝配以及出芽的過(guò)程中起到重要作用；E蛋白是PEDV病毒粒子中最小的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒的組裝并在病毒的出芽期發(fā)揮重要作用；N蛋白具有高度的保守性，其抗原決定簇是誘導(dǎo)機(jī)體免疫的重要組成成分，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。ORF3編碼輔助蛋白，與PEDV的細(xì)胞適應(yīng)性及病毒毒力有關(guān)，并且ORF3基因序列分析可以用來(lái)區(qū)分疫苗和野生型PEDV[5]。然而，Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在低致病性弱毒疫苗株中，ORF3基因的49 bp缺失將不再是區(qū)分經(jīng)典減毒疫苗和野毒株的可靠標(biāo)準(zhǔn)。目前已知的PEDV僅有1個(gè)血清型，但是根據(jù)S基因可以將PEDV分為1型基因群(G1)和2型基因群(G2)，每種基因群中均可分為2個(gè)亞型，分別為G1a與G1b亞型和G2a與G2b亞型。

1.2 傳播途徑 患病豬是PEDV的主要傳染源。此外，攜帶PEDV的野豬是病毒的儲(chǔ)存宿主，對(duì)該病的流行和傳播具有重要作用[7]。PEDV主要通過(guò)直接或間接接觸以及氣溶膠進(jìn)行傳播。糞-口途徑，即通過(guò)直接接觸感染豬的糞便和/或嘔吐物傳播，是PEDV傳播的主要途徑。PEDV在農(nóng)場(chǎng)內(nèi)和農(nóng)場(chǎng)之間的間接接觸傳播也很頻繁，特別是在生物安全性較低的情況下，通過(guò)其他受污染的媒介傳播，如運(yùn)輸拖車、農(nóng)場(chǎng)工人的手、靴子和衣服、飼料、飼料成分和添加劑以及用于運(yùn)輸散裝飼料的包裝袋等[8]。糞便-鼻腔途徑是PEDV通過(guò)氣霧化形成顆粒，這種病毒顆粒在哺乳豬中具有傳染性，是該病傳播的另一種途徑[9]。

2 PEDV在美國(guó)的流行

2.1 流行史 PED最早于1971年在英國(guó)被記錄為1種類似于傳染性胃腸炎的疾病。1978年，PED的病原在比利時(shí)被鑒定為1種新的冠狀病毒，并被命名為PEDV，原型株為CV777[2]。20世紀(jì)70—80年代，PEDV在歐洲廣泛傳播，如英國(guó)、比利時(shí)、捷克共和國(guó)、匈牙利、法國(guó)、瑞士、德國(guó)和意大利等國(guó)家均有報(bào)道。在亞洲，這種病毒于1982年首次在日本被發(fā)現(xiàn)，并傳播到包括韓國(guó)、中國(guó)、泰國(guó)和越南在內(nèi)的幾個(gè)國(guó)家和地區(qū)，由于其對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的影響較小，并未引起人們足夠的重視。2010年，PEDV毒株變異導(dǎo)致PED發(fā)病率顯著提高，造成大量哺乳仔豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失后，學(xué)者們才開(kāi)始對(duì)PEDV的突變和重組進(jìn)行深入的研究。2013年，PEDV傳入北美，最初在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后傳播到加拿大和墨西哥。2014年夏季，烏克蘭暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情，10日齡以下仔豬受到嚴(yán)重影響，死亡率接近100%[10]。隨后，在德國(guó)、葡萄牙、法國(guó)、荷蘭、意大利和比利時(shí)也發(fā)現(xiàn)了與仔豬水樣腹瀉相關(guān)的PED暴發(fā)[11]。如今，PED已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的流行病，分布在德國(guó)、越南、日本、美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2.2 PEDV在美國(guó)的流行狀況 2013年5月，美國(guó)愛(ài)荷華州暴發(fā)了PED，對(duì)歷史樣本的檢測(cè)則顯示，此前1個(gè)月俄亥俄州就已發(fā)生了PEDV感染。到2014年9月底，PEDV在全國(guó)范圍內(nèi)迅速傳播，并在32個(gè)州的農(nóng)場(chǎng)得到證實(shí)[12]。這次疫情的暴發(fā)導(dǎo)致超過(guò)700萬(wàn)頭仔豬死亡，造成9億～18億美元的經(jīng)濟(jì)損失。截至2017年12月，已經(jīng)有39個(gè)州和超過(guò)3 750個(gè)場(chǎng)所被確認(rèn)為PEDV陽(yáng)性[13]。在美國(guó)，PED是由PEDV的2個(gè)不同基因型(G)引起的，即S INDEL(G1b)和非S INDEL(G2b)毒株[12]。而且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，美國(guó)的所有PEDV毒株都聚集在2a亞組的1個(gè)分支中，并與來(lái)自中國(guó)的1個(gè)毒株(AH2012)密切相關(guān)[14]。Su等[15]從2016—2017年在美國(guó)采集的豬糞便和口腔液樣本中檢測(cè)到4種類型的PEDV變異株，這些變異株的S蛋白存在大量缺失，同時(shí)還檢測(cè)到美國(guó)CV777毒株，這是美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)S1 NTD-del PEDV變異株與美國(guó)原型毒株的共感染現(xiàn)象。2017年2月，Zhang等[16]在俄克拉荷馬州1個(gè) 母豬養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)1種PEDV變異株(USA/OK10240-8/2017)，全基因組序列分析表明，其S基因N端結(jié)構(gòu)域有1個(gè)連續(xù)的600nt(200aa)缺失，這是美國(guó)首次在臨床豬樣本中檢測(cè)到PEDVS基因的大片段缺失。冠狀病毒S基因的突變，尤其是堿基的插入和缺失，可能會(huì)改變冠狀病毒的致病性、抗原性和組織嗜性，并且變異毒株的不斷出現(xiàn)，也為PEDV的防控增加了難度。

美國(guó)豬病監(jiān)測(cè)報(bào)告系統(tǒng)(Swine Disease Reporting System,SDRS)2020年的分析[17]顯示，2019—2020年度美國(guó)養(yǎng)殖豬群中的PEDV陽(yáng)性率分布維持在1個(gè)較為寬泛的統(tǒng)計(jì)區(qū)間。2019年上半年各月份監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，PEDV的核酸檢測(cè)水平與2018年度同期持平，所有年齡組的陽(yáng)性檢出率均略為下降。2019年9月份PEDV的陽(yáng)性檢出率為12.98%，與8月份基本一致。其中成年/母豬養(yǎng)殖場(chǎng)的PEDV陽(yáng)性檢出率為5.24%，為PEDV進(jìn)入美國(guó)以來(lái)的歷史最低水平。但在10—12月份，PEDV 陽(yáng)性檢出率則持續(xù)上升。2019年12月，PEDV陽(yáng)性檢出率升至15.64%。12月1—14日，PEDV RNA的檢測(cè)水平高于歷史同期預(yù)期水平，這可能主要是由愛(ài)荷華州市場(chǎng)的斷奶動(dòng)物病例增多造成的。2020年1月份PEDV陽(yáng)性檢出率較2019年12月份有較大幅度上升，其中明尼蘇達(dá)州和北卡羅來(lái)納州的陽(yáng)性檢出率最為顯著，而2020年2—5月的監(jiān)測(cè)顯示，各州中豬各年齡組的PEDV陽(yáng)性檢出率都有所下降，可能和這期間獸醫(yī)公共衛(wèi)生服務(wù)強(qiáng)度及豬群監(jiān)測(cè)范圍大小和取樣數(shù)量等有一定關(guān)聯(lián)?？傮w上看，PEDV在養(yǎng)殖豬群中的分布隨生豬出欄數(shù)量、生長(zhǎng)育肥階段和各地區(qū)養(yǎng)殖狀況不同而有較大差異。

Bowman等(2015年)[18]和Scott等(2016年)[19]研究認(rèn)為，美國(guó)PEDV的發(fā)生是養(yǎng)殖豬群的感染發(fā)生在先，然后傳播擴(kuò)散到了野生豬群，這一結(jié)論的證據(jù)是野生豬群監(jiān)測(cè)的PEDV核酸陽(yáng)性要比養(yǎng)殖豬群的PEDV核酸陽(yáng)性的出現(xiàn)晚1年以上。為了調(diào)查美國(guó)現(xiàn)階段野生豬群PEDV的感染狀況，Bevins等[20](2018年)用基于全病毒建立的PEDV-ELISA檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自美國(guó)37個(gè)州的7 997份野豬血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有253份血清樣品呈冠狀病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.2%。由于PEDV-ELISA方法對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)產(chǎn)生交叉反應(yīng)，所以又使用了基于PEDV S1蛋白建立的熒光微球免疫分析(FMIA)檢測(cè)方法對(duì)這253份陽(yáng)性樣品進(jìn)行了額外的篩查，其中8份呈PEDV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為0.1%，另外245份陽(yáng)性樣品可能感染了TGEV。

2.3 其他冠狀病毒 冠狀病毒科由4個(gè)屬組成：α冠 狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒。α屬的代表性成員有PEDV、TGEV、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine despiratory corouavirus,PRCV)、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。δ屬的成員有豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)。PEDV、TGEV和PDCoV感染豬后主要引起腸道感染，PRCV易感染呼吸道。豬感染腸道冠狀病毒對(duì)豬群健康危害極大，但其對(duì)公共衛(wèi)生的不確定性影響只是近期才被廣泛關(guān)注。TGEV于1946年在美國(guó)首次報(bào)道，能夠引起豬的傳染性胃腸炎，常導(dǎo)致2周齡以內(nèi)的哺乳仔豬因嘔吐和嚴(yán)重腹瀉而死亡[21]。雖然TGEV和PEDV經(jīng)常發(fā)生共感染并導(dǎo)致嚴(yán)重的流行性疾病，但是這2種病毒抗原性不同，不存在交叉保護(hù)。PRCV最早于1984年在比利時(shí)發(fā)現(xiàn)，是TGEV的S基因缺失突變毒株[22]，形態(tài)學(xué)上與TGEV相似，主要在扁桃體和呼吸道復(fù)制，可以引起豬肺炎。2014年，在美國(guó)腹瀉豬中檢測(cè)到1種新的δ冠狀病毒，即PDCoV，臨床表現(xiàn)與PEDV、TGEV感染相似。生產(chǎn)中多見(jiàn)由PDCoV與PEDV、TGEV混合感染導(dǎo)致的豬腹瀉性疾病。PDCoV基因組結(jié)構(gòu)與PEDV等冠狀病毒相似，但與PEDV基因排列順序不同的是PDCoV的NS6位于M基因和N基因之間，NS7位于N基因的ORF中[23]]。2016—2017年，在中國(guó)的腹瀉豬中發(fā)現(xiàn)了另1種新的α冠狀病毒(類似于bat-HKU2)，它的基因組序列與PEDV等冠狀病毒的序列存在差異，但在臨床上與其他病毒感染相似，被命名為SADS-CoV[24]。

3 PEDV的檢測(cè)方法及其選擇

3.1 檢測(cè)方法的研究

3.1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)LAMP是一種簡(jiǎn)單、特異、經(jīng)濟(jì)高效的核酸擴(kuò)增方法。Yu等[25]為了在缺少設(shè)備的豬場(chǎng)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，建立了PEDV實(shí)時(shí)RT-LAMP 檢測(cè)方法，最低可檢測(cè)的病毒量為0.07 PFU，比一步法RT-PCR敏感100倍，與實(shí)時(shí)RT-PCR 敏感性相當(dāng)。然而，在LAMP試驗(yàn)中使用的熒光染料常常會(huì)引起假陽(yáng)性結(jié)果，且開(kāi)蓋檢測(cè)很容易發(fā)生氣溶膠污染。隨后，有學(xué)者針對(duì)以上問(wèn)題，將垂直流(VF)核酸檢測(cè)試紙條置于可視化條帶盒的密封塑料裝置中以控制擴(kuò)增中產(chǎn)生的污染，并與RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，建立了RT-LAMP-VF PEDV檢測(cè)方法，該方法有較好的特異性，檢測(cè)最低限為10 pg RNA，可在PEDV臨床診斷中推廣應(yīng)用[26]。隨著檢測(cè)要求的不斷提高，Zhou等[27]建立的微流控RT-LAMP芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可同時(shí)檢測(cè)和鑒別診斷PEDV、PDCoV和SADS-CoV，特異性為100%，敏感性分別為92.24%、92.19%和91.23%，最低檢測(cè)限分別為10拷貝/μL，并且其快速、便攜、低成本的特點(diǎn)，適合在偏遠(yuǎn)地區(qū)推廣。

3.1.2 免疫層析技術(shù)(ICA)ICA是20世紀(jì)末發(fā)展起來(lái)的一種快速診斷技術(shù)。為了對(duì)PEDV感染做出早期診斷，進(jìn)而采取嚴(yán)格的生物安全措施以及疫苗接種等措施以控制PEDV的傳播和蔓延。Liu等[28]研發(fā)了基于聚苯乙烯Eu(III)螯合物微粒的橫向流動(dòng)試紙條(LFTSs)，可定量分析糞便拭子中的PEDV N蛋白。該方法的敏感性和特異性為97.8%和100%，最低病毒檢測(cè)限為10 TCID50/mL。為了降低背景熒光的干擾性，Xu等[29]研發(fā)了基于EuNPs-mAb熒光探針的免疫層析試紙條(ICA)，該方法最低可檢測(cè)病毒量為2.725×103TCID50/mL，樣品檢測(cè)與RT-PCR的一致性為86.67%。除了適用于PEDV抗原檢測(cè)的方法，還有學(xué)者建立了可檢測(cè)初乳中PEDV抗體的免疫膠體金檢測(cè)方法。Liu等[30]以純化的G2基因型PEDV-LNCT2顆粒作為捕獲抗原，建立了可檢測(cè)初乳樣品中PEDV抗體的免疫膠體金檢測(cè)方法。這種方法不僅可以同時(shí)檢測(cè)G1和G2基因型毒株，還能通過(guò)測(cè)定SIgA水平監(jiān)測(cè)豬群感染和免疫狀態(tài)，為PEDV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和疫苗免疫研究提供了簡(jiǎn)便、靈敏、特異的檢測(cè)手段。

3.1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)(PCR)常規(guī)和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rRT-PCR)等分子診斷方法與傳統(tǒng)的其他方法相比具有更高的診斷敏感性和特異性，是實(shí)驗(yàn)室診斷PEDV的首選方法。美國(guó)大多數(shù)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室在收到臨床樣本后24 h內(nèi)報(bào)告rRT-PCR結(jié)果，因此可以快速實(shí)施干預(yù)和控制措施，以降低病毒進(jìn)一步傳播的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前PEDV在全球逐漸呈現(xiàn)經(jīng)典和變異毒株共同流行的復(fù)雜態(tài)勢(shì)，為PEDV的診斷和防控增加了一定的難度。Su等[31]根據(jù)此流行態(tài)勢(shì)建立了新型的基于TaqMan探針的雙重實(shí)時(shí)RT-qPCR，用于檢測(cè)和區(qū)分PEDV經(jīng)典和變異毒株。隨著儀器的革新和納米技術(shù)的應(yīng)用，多種PCR優(yōu)化及衍生方法被建立，如Luo等[32]建立的基于功能化磁珠富集和特異性納米技術(shù)擴(kuò)增的雙重超靈敏納米粒子DNA探針的PCR(dual UNDP-PCR)方法，能同時(shí)檢測(cè)和鑒別診斷PEDV和TGEV。雙重UNDP-PCR對(duì)PEDV和TGEV單次或多次感染的檢出限為25拷貝/g，比目前已知的雙重RT-PCR敏感性高400倍，表現(xiàn)出更好的特異性和敏感性，且不與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。目前，基于PCR的檢測(cè)方法主要用于檢測(cè)疑似感染該病毒動(dòng)物的糞便、直腸拭子或腸道樣本中的PEDV基因組。為此，Puente等[33]建立了RT-qPCR方法，能夠快速選擇性檢測(cè)熱處理后可能感染的PEDV，用于推斷其傳染性，在養(yǎng)豬業(yè)飼料成分監(jiān)測(cè)方面也具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)ELISA是免疫學(xué)檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的方法之一，一直被作為血清學(xué)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，可用來(lái)檢測(cè)PEDV的抗原和抗體。PEDV捕獲ELISA試劑盒已被開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)糞便樣本中的PEDV。然而，臨床樣本中病毒的檢測(cè)可能受到幾個(gè)因素的影響，包括樣品采集的時(shí)間、樣品儲(chǔ)存條件和運(yùn)輸溫度。因此，建議在感染急性期，即出現(xiàn)臨床癥狀后不久就采集樣本，并低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。有研究者建立了間接ELISA來(lái)評(píng)估口腔液中是否存在PEDV特異性IgG和IgA抗體[34]。Okda等[35]建立并驗(yàn)證了幾種檢測(cè)PEDV抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法，包括基于N蛋白的間接和阻斷ELISA。結(jié)果表明，這些方法之間具有良好的相關(guān)性，并呈現(xiàn)出類似的診斷敏感性和特異性(iELISA分別為97.9%和97.6%；bELISA分別為98.2%和98.0%)。與間接ELISA相比，阻斷ELISA的主要優(yōu)點(diǎn)是其特異性更高，其檢測(cè)特異性取決于阻斷抗體的亞型及其對(duì)靶抗原的特異性。

目前建立的間接ELISA方法，一般是通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組病毒蛋白(S、N 和 M)，用于包被抗原的大量生產(chǎn)。但是，使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)可能缺少適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊以及翻譯后修飾(例如糖基化)，進(jìn)而影響蛋白的生物活性，這可能導(dǎo)致ELISA試劑盒的敏感性和特異性降低。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，Chang等[36]在人胚胎腎(HEK)-293細(xì)胞分別表達(dá)S基因的全長(zhǎng)及其截?cái)嗟鞍?，以此建立?種間接ELISA方法，與基于N蛋白的商用ELISA試劑盒相比，基于全長(zhǎng)S蛋白的ELISA的敏感性為97.8%，特異性為94%，基于截?cái)郤蛋白的ELISA的敏感性更高，為98.9%，特異性為99.1%。目前建立的用于PEDV診斷的間接ELISA方法，非常耗時(shí)且昂貴，而納米抗體其易于表達(dá)和高度穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)可以克服這些問(wèn)題，為此Ma等[37]建立了基于生物素化的納米抗體新型封閉ELISA(bELISA)，并用該方法對(duì)150份臨床血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，bELISA的靈敏度和特異性分別為100%和93.18%，與商用ELISA試劑盒的符合率為94%。

3.2 檢測(cè)方法的選擇與評(píng)估 豬的4種腸道冠狀病毒感染引起的臨床癥狀難以區(qū)分。因此，鑒別診斷是控制豬病毒性腹瀉的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。特別是對(duì)區(qū)間移動(dòng)以及生豬和豬肉貿(mào)易中的風(fēng)險(xiǎn)控制與口岸監(jiān)測(cè)篩查而言，選擇合適的檢測(cè)試劑和方法，是降低PEDV傳入風(fēng)險(xiǎn)的最重要手段。敏感性更高的診斷測(cè)試可以提供更高的置信度來(lái)解釋樣品的污染/感染狀態(tài)，故而最低檢測(cè)限-分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)和臨床診斷敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)在監(jiān)測(cè)技術(shù)的選擇中應(yīng)綜合考慮[38]。當(dāng)樣品病毒含量接近最低檢測(cè)限時(shí)，陽(yáng)性檢出的不確定性會(huì)非常大，同時(shí)也預(yù)示著樣品來(lái)源場(chǎng)感染風(fēng)險(xiǎn)的極大不確定性。在出口貿(mào)易檢疫監(jiān)測(cè)中，針對(duì)此類風(fēng)險(xiǎn)，一是增加抽樣監(jiān)測(cè)的數(shù)量，二是需要重復(fù)多次開(kāi)展檢測(cè)。當(dāng)前，基于PEDV免疫反應(yīng)的不同血清學(xué)檢測(cè)方法使用較為廣泛，但每種檢測(cè)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。因此，一套完整的測(cè)試方法有助于PEDV抗體的初步鑒定和高效、高通量的定量分析。Okda等[35]在iELISA、bELISA和FMIA之間觀察到相似的Kappa值，表明這3種檢測(cè)方法之間存在顯著的一致性。Gimenez-Lirola等[39]研究發(fā)現(xiàn)，感染后基于全病毒的ELISA檢測(cè)到的IgG抗體比IFA檢測(cè)的時(shí)間長(zhǎng)。檢測(cè)PEDV抗體不僅能反映出抗體的分布和豬群的免疫水平，而且能反映未經(jīng)免疫的豬群的感染史，因?yàn)榭贵w在豬體內(nèi)的持續(xù)和存在時(shí)間要比PEDV病毒在豬體內(nèi)排毒時(shí)間更長(zhǎng)[2]。所以，PEDV的抗體檢測(cè)試劑也可以用于對(duì)PEDV流行病學(xué)的回顧性研究。然而，PEDV毒株的進(jìn)化是一個(gè)連續(xù)過(guò)程，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)PEDV變異毒株。針對(duì)不同毒株單個(gè)抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，用任何一種抗體檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其效率的評(píng)估是不可或缺的，但鮮有相關(guān)報(bào)道。故而在口岸入境監(jiān)測(cè)檢測(cè)中，不僅需要選擇合適的檢測(cè)方法和試劑，同時(shí)試劑的準(zhǔn)確性、可靠性和有效性等驗(yàn)證參數(shù)，如分析敏感性(Analysis sensitivity,ASe)、分析特異性(Analysis specificity,ASp)、檢測(cè)敏感性(Diagnosis sensitivity,DSe)、檢測(cè)特異性(Diagnosis specificity,DSp)、參考樣品的選擇和數(shù)量等，也是必需要考慮的重要因素。

4 結(jié)語(yǔ)

美國(guó)豬病監(jiān)測(cè)研究[17]顯示，2019—2020年度美國(guó)豬群中的PEDV表觀陽(yáng)性率分布維持在1個(gè)較高的統(tǒng)計(jì)區(qū)間(P=0.035 0～0.253 0)，其分布值隨生豬出欄數(shù)量、生長(zhǎng)育肥階段和各地區(qū)養(yǎng)殖狀況不同而有較大差異。而且從監(jiān)測(cè)研究中可以看出，PEDV感染對(duì)仔豬危害尤其大，死亡率超過(guò)50%，而成年豬感染后的死亡率較低。生豬移動(dòng)以及豬肉制品的貿(mào)易交流是PEDV傳播和擴(kuò)散的主要方式。來(lái)自中國(guó)海關(guān)及有關(guān)口岸監(jiān)測(cè)的數(shù)據(jù)顯示，近些年來(lái)，中國(guó)與美國(guó)生豬以及豬肉貿(mào)易交流非常頻繁且數(shù)量巨大，故而美國(guó)PEDV毒株通過(guò)生豬出口以及豬肉貿(mào)易交易傳入我國(guó)的可能性很大，需要加強(qiáng)檢測(cè)方法的研發(fā)、監(jiān)測(cè)疫情并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析與評(píng)估。