miR-93通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)活性對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

李光曙，寇繼光，鐘碧波，周中銀，周銳

胃癌(gastric cancer)是常見的消化道惡性腫瘤之一，全球胃癌死亡率在全部惡性腫瘤中位居第二位[1]。雖然臨床上的治療方法的進(jìn)展使胃癌發(fā)病率和死亡率的趨勢(shì)有所降低，但由于缺乏早期診斷，低資源地區(qū)的發(fā)病率和死亡率仍然很高[2]。微小RNA(miRNA)是一組具有18個(gè)核苷酸序列的非蛋白質(zhì)編碼RNA，其通過(guò)與靶mRNA的3′突變區(qū)域中的互補(bǔ)序列結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而影響轉(zhuǎn)錄后抑制和mRNA降解[3]。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)人類多種癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-93過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞[5]、鼻咽癌細(xì)胞[6]、食管癌細(xì)胞[7]的增殖，miR-93過(guò)表達(dá)還與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。提示 miR-93在癌癥中發(fā)揮著癌基因的作用。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)是一種促細(xì)胞凋亡蛋白，一般情況下，Bax表達(dá)水平越高，則更加有利于促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而B淋巴細(xì)胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)是一種抗細(xì)胞凋亡蛋白[9]。當(dāng)Bax和Bcl-2比例改變時(shí)，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡情況，當(dāng)Bcl-2過(guò)表達(dá)時(shí)，細(xì)胞具有抗凋亡作用；相反，當(dāng)Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞易發(fā)生凋亡[10]。因此，本課題將研究miR-93是否調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)活性對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移與凋亡產(chǎn)生影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床上治療胃癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常胃細(xì)胞GES-1細(xì)胞系和胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞系購(gòu)自上海癌癥研究所(中國(guó))。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和TRIzol試劑均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。RIPA裂解液購(gòu)自北京索萊寶公司。Bax、Bcl-2和GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。miR-93-inhibitor、及miR-93陰性對(duì)照由Genepharma(中國(guó)上海)合成。LipofectamineTM2000購(gòu)自上海吉瑪公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京Vazyme公司。PVDF膜購(gòu)自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、SGC-7901細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，一般2 d更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)成分。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SGC-7901細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組(control組)：空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組；②miR-93-NC組：轉(zhuǎn)染100 nmol/L的陰性對(duì)照質(zhì)粒; ③miR-93-inhibitor組：轉(zhuǎn)染100 nmol/L的miR-93-inhibitor質(zhì)粒，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率至60%左右時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。各組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后結(jié)束培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種于60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。15 d后，用結(jié)晶紫染色溶液染色細(xì)胞，并計(jì)數(shù)含有≥50個(gè)細(xì)胞的集落，用奧林巴斯熒光倒置顯微鏡拍攝代表性集落并統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用200 μL無(wú)菌槍頭沿培養(yǎng)皿底做直線劃痕，形成間隙。PBS重復(fù)洗3遍，加入不含血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后在奧林巴斯熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞愈合程度并拍照，測(cè)量細(xì)胞間的劃痕距離。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞用冷的PBS清洗兩次，然后在結(jié)合緩沖液中重懸并稀釋至每1 mL液體中含1×105個(gè)細(xì)胞。嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6 qPCR 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，用Nanodrop 2000儀器檢測(cè)樣品RNA濃度。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照qPCR試劑盒說(shuō)明書配置相應(yīng)的體系，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qPCR。qPCR的條件如下：95 ℃ 30 s (1循環(huán))，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40循環(huán))。使用StepOnePlus儀器完成實(shí)驗(yàn)后，采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。其中使用的引物見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot

轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞用蛋白酶抑制劑裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量。取等量蛋白質(zhì)樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后加入稀釋后的Bax、Bcl-2、GAPDH一抗，4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入對(duì)應(yīng)于一抗種屬來(lái)源的HRP標(biāo)記的二抗，在室溫?fù)u床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析

1.2.8 Caspase-3活性檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞在冷的PBS中洗滌兩次。用BD Cytofix/CytopermTM溶液重懸細(xì)胞，并在冰上孵育20 min。棄去BD Cytofix/CytopermTM溶液，并用1×BD Perm/WashTM緩沖液在室溫下洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞重懸于上述緩沖液中，并在室溫下與抗體一起溫育30 min。洗滌細(xì)胞，重懸于0.5 mL 1×BD Perm/WashTM緩沖液中，使其含有1×106個(gè)細(xì)胞，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-93在GES-1細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)水平

應(yīng)用qPCR法檢測(cè) miR-93在GES-1細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)水平，如圖1所示，與GES-1細(xì)胞組比較，在SGC-7901細(xì)胞中miR-93表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)。

2.2 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01，P<0.05)(圖2A，2C)；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞遷移能力下降(P<0.01，P<0.05)(圖2B，2D)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明miR-93抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移。

圖1 miR-93在GES-1和SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)水平(與GES-1組比較，**P<0.01)

2.3 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)(P<0.01)，以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明miR-93促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。見圖3。

圖3 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的情況 與control組比較，***P<0.001；與miR-93-NC組比較，###P<0.001

2.4 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Bax/Bcl-2表達(dá)的影響

qPCR和Western blot結(jié)果顯示：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞中Bax mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，且Bax/Bcl-2的比例上調(diào)(P<0.001)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明miR-93能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)活性促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。見圖4。

圖4 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Bax/Bcl-2的表達(dá)情況 A:miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Bax/Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況;B:miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。與control組比較，**P<0.01， ***P<0.001；與miR-93-NC組比較，##P<0.01，###P<0.001

2.5 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3活性的影響

Caspase-3活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3的活性提高。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明miR-93能通過(guò)體影響Caspase-3活性促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。見圖5。

圖5 miR-93對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3活性的影響 與control組比較，***P<0.001；與miR-93-NC組比較，##P<0.01

3 討論

胃癌(gastric cancer,GC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，東亞占年度病例的一半以上[11]，而我國(guó)是GC高發(fā)國(guó)家之一，每年GC的新發(fā)病例和死亡病例約占全球的42.6%和45.0%[12]。對(duì)于局部GC患者，手術(shù)仍然是基本治療方法，然而即使接受了外科手術(shù)治療，5年生存率仍低于30%[13]。此外，大多數(shù)患者被診斷為GC晚期，此時(shí)不再進(jìn)行根治性手術(shù)，并且現(xiàn)有治療方案的結(jié)果仍不令人滿意[14]。超過(guò)一半的晚期GC患者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡[15]。因此，找到胃癌的綜合治療模式，以提高其生存率是多年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

miR-93位于染色體7q22的宿主基因Mcm7的第13位[16]。已經(jīng)報(bào)道了miR-93在幾種類型的癌癥中的異常表達(dá)，例如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和肝細(xì)胞癌[17-19]。以前的研究表明，miR-93可以作為致癌基因的癌基因，可以加速腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和血管生成。但也有報(bào)道認(rèn)為miR-93抑制卵巢癌細(xì)胞中的腫瘤發(fā)生[20]。相反的結(jié)論可能歸因于miR-93在分化程度和癌癥類型中發(fā)揮特定功能的事實(shí)。此外，顯示miR-93也參與胃癌的發(fā)生或發(fā)展[21]。然而，miR-93的生物學(xué)功能和分子機(jī)制在胃癌中尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡與存活的一個(gè)重要控制器，凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax均屬于Bcl-2家族，是兩種標(biāo)志性的凋亡蛋白[22]，促凋亡蛋白Bax與抑凋亡蛋白Bcl-2間形成同源二聚體或異源二聚體，分別起抑制或促進(jìn)凋亡的作用[23]。Bax/Bcl-2的比率是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，當(dāng)兩者之間的比率上調(diào)時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，當(dāng)兩者之間的比率下調(diào)時(shí)，可使細(xì)胞凋亡受到抑制[24]。Bcl-2可以抑制Caspase-3的激活和合成，從而抑制細(xì)胞的凋亡，破壞細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[25]。因此，Bax/Bcl-2的表達(dá)活性影響細(xì)胞的凋亡情況。

本實(shí)驗(yàn)中我們先確定了miR-93在胃癌中的表達(dá)情況，qPCR結(jié)果顯示，與人正常胃細(xì)胞組相比，胃癌細(xì)胞中miR-93表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。為了研究miR-93是否對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與凋亡產(chǎn)生影響，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞增殖能力下降(P<0.01，P<0.05))；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞遷移能力下降(P<0.01，P<0.05)；細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)(P<0.01)。進(jìn)一步探討了miR-93與Bax/Bcl-2表達(dá)活性的關(guān)系，qPCR和Western blot結(jié)果顯示：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞中Bax mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，且Bax/Bcl-2的比例上調(diào)(P<0.001)。之后測(cè)定了Caspase-3活性，結(jié)果表明：與control組和miR-93-NC組相比，miR-93-inhibitor組SGC-7901細(xì)胞中Caspase-3的活性提高。因此，miR-93通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)來(lái)抑制進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，miR-93在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)miR-93的表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、Caspsae-3的表達(dá)活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能的機(jī)制與Bax/Bcl-2的表達(dá)活性調(diào)控有關(guān)。