不可逆電穿孔對不同分化結腸癌細胞殺傷作用的實驗研究

李夏西，陳澤敏，胡威，黃思霖，龔偉

結腸癌是發(fā)病率第三的惡性腫瘤，全世界2020年有190萬新病例，93萬人死亡[1-2]。國內流行病學研究顯示，結腸癌的發(fā)病率持續(xù)升高[3-4]，很多患者診斷時已經發(fā)生遠處轉移，5年生存率低于10%[5-6]，且近年來發(fā)病年齡呈現年輕化趨勢[7]。對于結腸癌，手術和化療是首選的治療方式，但創(chuàng)傷大[8]。近年來出現很多新型治療如靶向治療、基因治療[9-10]以及各類治療方法聯(lián)合[11]。特別是內鏡技術結合消融技術為結腸癌的治療開發(fā)了新方向。

基于非熱效應殺傷細胞的不可逆電穿孔(irreversible electroporation, IRE)是一種新興的腫瘤消融技術。近年來以納米刀(nanoknife)治療儀的形式被引入治療不能實施手術的實體腫瘤和局部晚期癌癥，包括前列腺癌、腎癌、肝癌、骨癌和胰腺癌等靠近重要結構的癌灶，且已展現出良好的治療和生存改善效果[12-15]。 然而目前IRE對結腸腫瘤有效治療的報道仍較少，其作用機制也不甚清楚。因此，本研究旨在通過探討IRE對不同分化程度結腸腫瘤細胞株增殖的抑制作用，考察IRE對結腸腫瘤治療的有效性，期望未來能為將IRE技術常規(guī)應用于治療結腸腫瘤提供可靠證據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

實驗選取結腸癌低分化細胞株HCT116，中分化細胞株SW480和SW620，高分化細胞株LoVo。癌細胞培養(yǎng)基：內含10%胎牛血清(fetal clf srum, FBS)，100 U/mL青霉素(penicillin, P)、100 μg/mL鏈霉素(streptomycin, S)的DMEM培養(yǎng)基；KYSE-150培養(yǎng)基：45% RPMI-1640+45% Ham’s F-12+10% FBS+1% P/S；KYSE-410培養(yǎng)基：90% RPMI-1640+10% FBS+1%P/S。以上所有細胞均為貼壁生長，于37℃、CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 不可逆電擊實驗及細胞活性檢測

取對數生長期的結腸癌細胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化后重懸于培養(yǎng)基中。用血球計數板進行計數，將細胞種植在平行板電極間距為2 mm的電擊杯(620 electroporation cuvettes，美國Harvard Apparatus公司)，置于安全操作池(BTX, 美國Harvard Apparatus公司)中，連接生物醫(yī)療脈沖發(fā)生器BPG 300(蘇州泰思特公司)，根據所設置的電場參數(表1)進行電擊實驗。隨后種至96孔板，分別設置空白組(僅加培養(yǎng)基)、對照組(0 V/cm對應的不進行IRE處理的細胞)、實驗組(分別經各組參數電擊后的細胞)。每組設置6個復孔，每孔約8000～10000個細胞，放回培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，將96孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，去掉上清液，每孔加入100 μL的DMSO，搖床100 rpm搖勻5 min，酶標儀測定在570 nm處的OD值，計算脈沖電場刺激下的細胞存活率，繪制細胞增殖曲線。

根據文獻[16-20]報道，本實驗需要的參數為4個：脈沖頻率(Hz)、脈沖電場強度(V/cm)、脈沖寬度(μs)及脈沖個數(個)。

參數具體選取為：脈沖頻率固定為1 Hz，脈沖電場強度為0～2 000 V/cm(選取參數為0、500、1 000、1 500、2 000 V/cm)；脈沖寬度為0～100 μs(選取參數為25、50、75、10μs)；脈沖個數為0～100個(選取參數為1、10、20、40、80個)；。每次實驗分別從脈沖頻率、脈沖寬度、脈沖個數、電場強度選1個參數進行實驗。

2 結果

2.1 不同參數下低分化結腸癌細胞的增殖結果

MTT細胞增殖實驗顯示，當電場強度達到1 500 V/cm，脈沖個數達到40個，不同脈寬作用均可明顯抑制HCT116細胞的增殖(圖1)，顯示低分化HCT116細胞對于IRE具有較高的敏感性。

圖1 不同脈沖參數IRE對低分化結腸癌細胞株HCT116生存率的影響

2.2 不同參數下中分化結腸癌細胞的增殖結果

與IRE對于HCT116細胞的作用類似，在高場強(>1 500 V/cm)和高脈沖個數(>40個)的作用下，不同脈寬均可對SW620和SW480細胞的增殖產生顯著抑制作用(圖2和圖3)，顯示IRE對于中分化結腸癌細胞也具有良好的抑制效果。

圖2 不同脈沖參數IRE對中分化結腸癌細胞株SW480生存率的影響

圖3 不同脈沖參數IRE對中分化結腸癌細胞株SW620生存率的影響

2.3 不同參數下高分化結腸癌細胞的增殖結果

與前三株細胞相比，不同參數的IRE對LoVo細胞增殖的影響明顯減弱。在高場強(>1 500 V/cm)和高脈沖個數(>40個)的作用下，LoVo細胞的增殖亦未受到明顯抑制(圖4)，提示該細胞對IRE作用具有較高的耐受性。同時實驗結果也表明，IRE對于分化程度不同的結腸癌細胞的增殖具有選擇性，表現為對于中等分化和低分化的結腸癌細胞具有顯著的抑制作用，對于高分化結腸癌細胞的增殖抑制作用不明顯。

圖4 不同脈沖參數IRE對中分化結腸癌細胞株LoVo生存率的影終誘導細胞凋亡程序啟動，導致細胞死亡。本研究中，我們通過體外實驗證實IRE對不同分化程度的結腸癌細胞株具有不可逆的殺傷作用，其殺傷作用因結腸癌的分化程度不同而具有選擇性，IRE電場強度達到1 500 V/cm，脈沖個數高于40時，可明顯抑制中低分化結腸癌細胞株的增殖，對于高分化結腸癌細胞株LoVo細胞增殖的影響明顯減弱。高分化結腸癌細胞的增殖抑制相對中等分化和低分化的結腸癌細胞來說，可能需要更強電場強度或頻率等參數。當前，內鏡治療操作難度相對較大，且存在出血、穿孔等嚴重并發(fā)癥風險。我們的研究結果可為今后研發(fā)適用于消化道系統(tǒng)的IRE治療儀，應用于消化道早癌內鏡下治療提供實驗依據。

3 討論

國內外的研究表明IRE對于多種腫瘤均具有殺傷作用[21-25]，通過高壓脈沖電擊使細胞膜上產生不可逆電穿孔，造成細胞內外離子失衡，胞內重要的細胞器腫脹破裂丟失等，IRE對常見結腸腫瘤具有明顯的不可逆殺傷作用，未來有望成為一種可供選擇的治療結直腸癌的方法。