人源性肝小鼠模型及其在藥物代謝及肝毒性研究中的應(yīng)用

陳琦, 金美先, 陳麗琴, 曾佑敏, 祝曉娟, 彭青, 周樹勤,

臨床新藥的研究開發(fā)，包括臨床前研究和臨床一到四期的試驗，周期長，投資大。用于人類臨床試驗的候選藥物，隨后可通過人類使用的監(jiān)管批準只有8%[1-3]。其中，很大的一部分原因是實驗動物模型對人類異種代謝的預(yù)測差。大多數(shù)候選藥物的臨床前試驗是使用動物模型進行的，盡管動物體內(nèi)研究提供了預(yù)測人體體內(nèi)代謝物的可能性，但藥物在人體內(nèi)代謝與動物總是存在物種差異。人源化小鼠的出現(xiàn)，可以很好地減少這一差異[4-6]。

肝臟是包括藥物在內(nèi)的外源性化合物代謝的主要場所。由于許多肝酶是物種特異性的，因此有必要利用人源肝細胞來評估候選藥物的代謝。通過基因工程改造，將在人肝細胞移植到小鼠體內(nèi)，使移植的細胞能夠重新填充肝臟，從而使肝臟人性化，形成人源化肝小鼠模型。人源化肝小鼠模型，能更好模擬藥物在人類體內(nèi)代謝過程，更加準確地預(yù)測藥物在人體內(nèi)的代謝和安全性，使用“人性化”系統(tǒng)進行臨床前試驗是一個安全性較高的選擇[7]。

1 人源化肝小鼠模型

人源化肝小鼠模型，滿足以下兩大條件：①免疫缺陷，以防止移植的人類細胞排斥，②損傷內(nèi)源性小鼠肝細胞，以促進人類肝細胞植入小鼠肝臟內(nèi)。人源化肝小鼠模型的研究領(lǐng)域快速發(fā)展，Dandri等人和Mercer等人兩個研究小組于2001年前后使用alb-uPA株產(chǎn)生了第一批人肝嵌合體小鼠[8, 9]。自2001年至今，已經(jīng)開發(fā)了多種模型，應(yīng)用最多的是以下三種如表1。

1.1 免疫缺陷小鼠

通過基因工程的改造，產(chǎn)生免疫缺陷的小鼠，以滿足人源細胞的移植。目前最常涉及的有以下幾種：

1.1.1 SCID小鼠 SCID(Sever Combined Immunoleficient disease,嚴重聯(lián)合免疫缺陷)小鼠，由常染色體隱性突變而來。該品系小鼠缺失B細胞和T淋巴細胞功能，有正常的NK細胞、巨噬細胞和粒細胞，表現(xiàn)出嚴重的聯(lián)合免疫缺陷癥狀[8, 10]。

1.1.2 Rag2-/-小鼠 Rag2(the recombination activating gene 2,重組激活基因2)是重要的重組酶之一，在V(D)J基因重排和淋巴系細胞發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。Rag2基因的缺失使T/B細胞早期發(fā)育嚴重停滯，從而使外周血中沒有成熟的循環(huán)T/B淋巴細胞，其先天免疫完整，這與SCID相似[9, 11]。

1.1.3 IL2rg-/-小鼠 Interleukin-2受體的gamma鏈(IL-2Rγc，又稱CD132)，與細胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21有共同受體亞基，而這些細胞因子具有重要的免疫功能。該基因敲除后，會導(dǎo)致小鼠機體免疫功能嚴重降低，尤其功能性NK細胞活性幾乎喪失。

當小鼠Rag2基因聯(lián)合IL2rg基因同時缺失時，小鼠先天性、適應(yīng)性免疫功能完全障礙，高度免疫缺陷[11-13]。

1.1.4 NOG小鼠 NOG小鼠(NOD/Shi-scid, IL-2R小鼠)，通過雜交NOD/scid小鼠和γ-鏈IL-2受體敲除(IL2rγKO)小鼠成功建立了一個的小鼠品系。該小鼠的免疫功能嚴重不全，其免疫包容性更強，防止對人源性細胞及組織的排斥[14, 15]。

1.2 損傷內(nèi)源性小鼠肝細胞

1.2.1 alb-uPA小鼠 Alb-uPA小鼠是第一個可以用人類肝細胞重新填充肝臟的小鼠模型。該模型本是一個凝血模型，1990年由Heckel等人開發(fā)，旨在研究新生兒出血性疾病[16]。其原理是利用轉(zhuǎn)基因alb-uPA小鼠(在白蛋白啟動子下表達的尿激酶型纖溶酶原激活物)建立的，許多alb-uPA小鼠在新生兒時期就因為出血而死亡，大約一半的轉(zhuǎn)基因幼崽可以存活下來，但在出生幾周后出現(xiàn)了肝功能衰竭，少數(shù)小鼠在兩次危機后幸存下來，尿激酶型纖溶酶原激活物(UPA)血清水平在2個月內(nèi)逐漸恢復(fù)到正常水平。對這些小鼠的分析顯示，肝臟內(nèi)有看似健康的結(jié)節(jié)，這些結(jié)節(jié)在幾個月的時間里不斷擴大，最終完全取代了患病的肝臟。這種自然選擇現(xiàn)象后來被認為是一種有希望的方法去有效地擴大移植健康肝細胞在病變的肝臟。Rhim等人[17]于1994首次用健康小鼠肝細胞作為供體來源在alb-uPA小鼠中證明了這一假設(shè)。2001年Dandri等人和Mercer等人使用alb-uPA株產(chǎn)生了第一批人肝嵌合體小鼠[8-9]。

雖然在alb-uPA開啟了人類肝嵌合體的大門。然而，alb-uPA小鼠有幾個缺點：組成性uPA表達引起的小鼠肝損傷；移植時間窗有限；內(nèi)出血導(dǎo)致產(chǎn)后高死亡率；uPA基因的自發(fā)缺失減少了人肝細胞的再增殖，增加了肝癌的發(fā)病率；易患腎臟疾?。惑w型和體重?。慌陨痴系K；人類肝細胞的高增殖需要抑制宿主固有免疫反應(yīng)和/或人類補體[8-9]。

為了克服以上缺點，一直在不斷完善Alb-uPA小鼠。如MUP-uPA SCID/Bg小鼠模型，是通過攜帶MUP啟動子驅(qū)動的uPA基因的轉(zhuǎn)基因小鼠與SCID/Beige小鼠雜交獲得的。與原系相比，MUP-uPA-SCID/Bg小鼠更健康，肝細胞移植的時間窗長，可達12個月[12]。半合子cDNA-uPA/SCID，利用胚胎干細胞技術(shù)，并獲得了合適的uPA表達水平。該模型腎臟疾病較少，體重較高，存活率較長等優(yōu)點[18]。

1.2.2 FRG小鼠 FRG系小鼠(Fah-/-/IL2rg-/-/Rag2-/-小鼠)為三重敲除小鼠模型。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)的缺失導(dǎo)致肝毒性代謝物積累，從而導(dǎo)致肝損傷并致死。通過給與2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?1,3-環(huán)己二酮(NTBC)可阻斷羥苯丙酮酸雙加氧酶飼喂，可防止肝毒性代謝物的積累、肝損傷并使FRG小鼠保持健康狀態(tài)。當NTBC停藥后，移植人源性干細胞，小鼠肝臟可以重新充滿人肝細胞。2007年，兩個獨立研究小組建立了FRG小鼠品系作為人類肝嵌合小鼠模型，并證明了成年FRG小鼠的新鮮和冷凍人肝細胞均能穩(wěn)定繁殖[11, 19]。

FRG模型具有較高的嵌合率、易于繁殖、任何年齡都可肝細胞移植和絕對不存在自發(fā)的轉(zhuǎn)基因修改優(yōu)勢；但其缺點包括：人肝細胞再增殖需要小分子藥物(NTBC)、FAH缺乏性腎病、肝癌多發(fā)等[13, 20-21]。

為了建立一個更好的人類特異性藥物代謝的動物模型，PIRF小鼠模型。基于細胞色素P450家族雖然數(shù)量眾多，但所有細胞色素只有一個電子供體，即NADPH-P450氧化還原酶(Por)，利用這一原理，通過條件敲除小鼠Porc/c基因，并刪除了純合合子中的IL2rg-/-、Rag2-/-和Fah-/-基因，獲得了PIRF小鼠模型。該模型很容易與人肝細胞重組，并反映了小鼠Porc/c基因缺失后的人類外源代謝。因此，這些人源化PIRF小鼠可用于預(yù)測人類藥物代謝，很有利于臨床前藥物的藥物[13]。

1.1.3 TK-NOG小鼠 單純皰疹病毒1型胸苷激酶(HSVtk)轉(zhuǎn)基因在高度免疫缺陷小鼠株(NOG)的肝臟中表達，以產(chǎn)生TK-NOG轉(zhuǎn)基因小鼠[15]。NOG小鼠先天性(IL2rg-/-) 以及適應(yīng)性(SCID)免疫反應(yīng)缺失。HSVtk使藥物更昔洛韋磷酸化，導(dǎo)致細胞中毒，而沒有轉(zhuǎn)基因的人肝細胞對藥物不敏感。肝細胞移植前給予更昔洛韋，誘導(dǎo)小鼠肝細胞中毒。無持續(xù)性肝毒性使人源化肝在無外源性藥物治療的情況下穩(wěn)定維持6個月以上。嵌合TK-NOG肝表達mRNAs，編碼人細胞色素P450(CYP450)酶、轉(zhuǎn)運體和轉(zhuǎn)錄因子，它們在與供體人肝細胞相同的水平上影響藥物代謝。此外，人肝CYP3A4蛋白廣泛表達，嵌合TK-NOG小鼠可介導(dǎo)人特異性藥物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。TK-NOG小鼠被用于預(yù)測正在開發(fā)的藥物的人類藥物代謝模式和人類藥物-藥物相互作用的發(fā)生，并確定影響臨床重要藥物代謝的人類遺傳因素[22]。

表1 人源性肝小鼠模型

2 藥物代謝及肝毒性研究

藥物從研發(fā)到用于人類治療，很大程度上取決于臨床前研究的動物模型。但由于臨物種差異，動物模型無法很好地預(yù)測人類異源生物代謝，因此許多候選藥物在臨床試驗中均無法通過。例如CYP450家族成員，它是藥物在肝內(nèi)降解第Ⅰ相反應(yīng)的主要代謝酶。在小鼠中，這些CYP450由72個功能基因編碼，而人類只有27個功能基因。這就決定了藥物在小鼠和人類中的代謝總會存在差異。藥物代謝物會驅(qū)動藥物毒性，其存在與否取決于藥物代謝酶的物種特異性[23]。

已經(jīng)在具有人源化肝臟的嵌合小鼠的肝臟中檢測出了人類藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平以及活性。人源化的uPA/SCID小鼠肝臟中人CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1和CYP3A4的mRNA表達譜與供體肝相似甚至更高。而且，在人源化小鼠肝臟中還表達了其他大量的人類I和II相酶，轉(zhuǎn)運蛋白和核受體。證明了人源化小鼠模型可以對測試藥物進行人類特異性生物轉(zhuǎn)化[24-25]。

雖然，小鼠剩余肝臟以及其他鼠類器官(腎臟、腸道等)介導(dǎo)了許多重要的藥物肝外清除。[26]。但是，小鼠的人源化肝臟對于研究人類藥物代謝仍然具有廣闊的前景，這些小鼠對于需要延長給藥時間的毒理學(xué)研究尤其有價值。

FIAU(fialuridine，氟尿苷)是一種核苷類似物，意在開發(fā)用于治療乙型肝炎病毒感染。 FIAU在臨床前動物模型中沒有表現(xiàn)出任何毒性，但當患者長期服用該藥物治療時，則發(fā)生了乳酸性酸中毒，從而導(dǎo)致肝臟并發(fā)癥和胰腺炎，因此已在II期臨床試驗中終止。2014年，Xu等人在TK-NOG人源化嵌合小鼠證實了劑量依賴性的肝毒性。高劑量的FIAU(400 mg /kg)處理的TK-NOG小鼠體內(nèi)的人源肝臟組織呈現(xiàn)出脂質(zhì)的積累，且通過電子顯微鏡分析顯示出人類肝細胞中的線粒體異常，這與先前已證明是人類肝衰竭的原因一致。這也充分顯示了人源化小鼠對于藥物毒理學(xué)研究的獨特優(yōu)勢[27]。

隨著老齡化人口的增加，同時合并多種慢性疾病的個體也不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，美國57歲以上人口中有30%以上服用五種或更多處方藥，藥物相互作用存在肝損傷及藥物毒性是不容輕視的問題。人源化肝小鼠模型更能準確模擬藥物人體代謝過程，也可以增強我們預(yù)測候選藥物在人體內(nèi)發(fā)生相互作用的能力[28]。

藥物代謝個體化差異是藥物特異性毒性的一個重要原因[4, 29]。例如代謝酶CYP2C19是具有高度多態(tài)性，其等位基因變體至少25個，這對藥物代謝或不良反應(yīng)的敏感性產(chǎn)生重大影響。S-mephenytoin(S-美芬妥英)通過CYP2C19向其4-羥基代謝物S-4-OH mephenytoin的生物轉(zhuǎn)化，并且該代謝產(chǎn)物的個體產(chǎn)生率差異取決于CYP2C19的基因型。通過將九個CYP2C19等位基因不同的人肝細胞移植到嵌合小鼠中，這些等位基因具有低速，中速或超快速的酶活性。給予S-mephenytoin后測定S-4-OH mephenytoin的生成速度，嵌合小鼠中，這種代謝產(chǎn)物的生成速率相差了10倍，而這種差異是由移植的人肝細胞的CYP2C19基因型決定的[30, 31]。

3 小結(jié)與展望

人源化肝小鼠模型被認為是能夠?qū)崿F(xiàn)“人性化”臨床前實驗很有前景的選擇。但是小鼠肝臟內(nèi)殘留的鼠源肝細胞，以及鼠類器官的藥物代謝仍然是一個復(fù)雜的問題。通過基因工程，使用抗人類補體因子活性藥物等多種技術(shù)聯(lián)合使用，不斷提高人源性肝小鼠模型的人源化肝細胞的替代指數(shù)(RI, replacement index)。利用高RI的小鼠模型好處是多方面的[32-34]。一般建議是使用具有盡可能高RI的小鼠，以避免由于殘留的小鼠肝細胞對肝功能的補償，從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。高RI小鼠內(nèi)的人肝細胞表現(xiàn)出終末分化肝細胞的特征，從而概括了人類肝臟中肝細胞的細胞生物學(xué)動態(tài)平衡；然而，低RI鼠肝臟中增殖的人肝細胞集落顯示出不充分的成熟程度。因此，細胞移植后存活率、高RI小鼠的高精度生產(chǎn)能力和易操作性也是選擇小鼠模型的重要因素[35]。

人源化肝嵌合小鼠模型缺乏人源性適應(yīng)性免疫系統(tǒng)這一弊端在病毒性肝炎的研究中格外顯著，因為病毒感染細胞后，獲得性免疫反應(yīng)在肝臟壞死性炎癥的發(fā)展中起著核心作用。缺乏獲得性免疫在某些方面對該模型在代謝性肝病和藥物性肝損傷研究中的可靠性同樣也被提出質(zhì)疑[36-38]。近年來，通過重建人性化的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)來緩解這一約束。通過移植造血干細胞，以重建小鼠模型中的人類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。為了生產(chǎn)雙人源化的小鼠模型，需要使用沒有功能NK細胞和巨噬細胞的高度免疫缺陷模型，如NOG小鼠、Rag2-/-/IL2rg-/-小鼠系統(tǒng)[39-40]。

代謝酶在人類群體中具有高度多態(tài)性；等位基因變異對藥物新陳代謝和藥物不良反應(yīng)易感性有重要影響[41]。由于人源化肝臟可以使用人類iPSC(induced pluripotent stem cells，誘導(dǎo)多能干細胞)來源的細胞，因此可以從任何個體制備人源化小鼠。特殊的肝毒性也是許多藥物在得到藥物批準后停藥的一個重要原因。該方法可以實現(xiàn)個性化的藥品安全檢測。有證據(jù)表明iPSC來源的肝細胞可以預(yù)測體外藥物代謝的個體差異。從阿爾珀斯綜合征患者的iPSC中制備的嵌合小鼠可以用來識別會導(dǎo)致線粒體毒性的藥物，并表征線粒體毒性的潛在機制。在體外將iPSC分化為肝細胞和利用嵌合小鼠識別人類特異性藥物毒性方面取已經(jīng)得了很大的進展，個性化嵌合小鼠被用于優(yōu)化藥物選擇或降低患者藥物毒性在未來擁有更多的可能。