TRPV1在胃食管反流病患者發(fā)病中的作用機制

許智超，年媛媛，孟憲梅

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指各種原因使胃、十二指腸內(nèi)容物向上反流入食管引起反酸和(或)胸骨后燒灼感(即燒心)癥狀[1]，根據(jù)內(nèi)鏡下表現(xiàn)，GERD可分為反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)、非糜爛性反流病(non erosive reflux disease，NERD)、Barrett′s食管(Barrett′s esophagitis，BE)[2]。GERD的三種亞型在發(fā)病機制上存在一定差異，其癥狀的嚴(yán)重程度與內(nèi)鏡下食管黏膜受損程度并不完全一致，有研究表明，這與瞬時感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)和內(nèi)臟高敏感(visceral hypersensitivity，VH)有關(guān)。

VH的發(fā)生機制尚不明確，可能是由于TRPV1上調(diào)引起，TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，廣泛分布于胃腸道黏膜層、黏膜下層和肌層，參與胃腸動力、分泌和內(nèi)臟感覺，對食管敏感性和黏膜炎癥有重要的調(diào)節(jié)作用，但其在GERD中的研究報道較少，與VH的具體作用尚不明確[3]。

本研究采用免疫組化、Western-blot、RT-PCR等技術(shù)檢測GERD各亞型患者食管黏膜TRPV1蛋白和mRNA的表達(dá)情況，進(jìn)而了解TRPV1在GERD患者發(fā)病中的作用機制，為GERD的治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 患者資料

選擇2019年1—12月就診于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化病研究所胃鏡室的患者，采用胃食管反流病問卷(gastroesophageal reflux disease questionnaire，GerdQ)初步入組GERD患者和正常對照組患者，根據(jù)臨床癥狀和內(nèi)鏡下食管黏膜表現(xiàn)將入組患者分為RE組、NERD組、正常對照組，收集其食管黏膜標(biāo)本共114例，年齡18～70歲，平均年齡為(42.52±9.10)歲，其中RE組57例，男29例，女28例，平均年齡為(41.95±10.32)歲；NERD組28例，男14例，女14例，平均年齡為(42.50±7.70)歲；正常對照組29例，男15例，女14例，平均年齡為(43.66±7.88)歲。免疫組化共入組54例，RE組37例，NERD組8例，正常對照組9例；Western-blot共入組30例，三組患者各10例；RT-PCR共入組30例，三組患者各10例。各組別患者性別、年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異。因為臨床上RE患者和NERD患者較多見，所以我們只研究TRPV1在GERD的這兩種亞型與正常對照的表達(dá)差異。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

所有入組對象檢查前停用質(zhì)子泵抑制劑≥7 d，停用 H2受體拮抗劑≥3 d，停用促動力藥≥48 h，停用抗酸劑≥6 h[4]。均接受內(nèi)鏡檢查，通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并簽寫內(nèi)鏡檢查及活檢知情同意書。

RE入組標(biāo)準(zhǔn)：具有典型反酸、燒心癥狀且一周出現(xiàn)3次以上，病程大于3個月，GerdQ≥8分，內(nèi)鏡下有食管黏膜破損表現(xiàn)且RE分級≥B級；

NERD入組標(biāo)準(zhǔn)：具有典型反酸、燒心癥狀且一周出現(xiàn)3次以上，病程大于3個月，GerdQ≥8分，內(nèi)鏡下無食管黏膜破損表現(xiàn)；

正常對照入組標(biāo)準(zhǔn)：GerdQ<8分，既無反流癥狀也無內(nèi)鏡下食管黏膜破損表現(xiàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)鏡下有食管裂孔疝、食管腫瘤及食管手術(shù)史者；②有消化道相關(guān)器質(zhì)性病變、消化性潰瘍、賁門遲緩以及消化道手術(shù)史、腫瘤史者；③孕婦、哺乳期婦女；④嚴(yán)重心、肺、腎、肝、腦及惡性腫瘤史者；⑤有重大精神疾病、溝通障礙者；⑥其他嚴(yán)重疾病及意識不清者。

1.3 研究方法

內(nèi)鏡下收集入組患者食管黏膜標(biāo)本，RE患者于食管黏膜糜爛明顯處用活檢鉗取組織標(biāo)本，NERD患者和正常對照組患者于食管齒狀線上方5 cm處用活檢鉗取組織標(biāo)本，分別置于4%甲醛溶液固定、-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 實驗用品

免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供；BCA試劑盒由Solarbio公司提供，TRPV1抗體由Abclonal公司提供，貨號A8564，批號1152430201，β-actin抗體由Servicebio公司提供，貨號GB12001，批號202205；TRPV1引物、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3.2 免疫組化檢測TRPV1蛋白陽性染色情況

4%甲醛液固定組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片；進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，PBS洗滌，內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑滴加在切片組織上，室溫靜置10 min；PBS洗滌，加入一抗、二抗、顯色劑等，然后復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢觀察TRPV1在各組食管黏膜的著色情況。

免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，陰性(-)：細(xì)胞未顯示著色；弱陽性(+)：細(xì)胞為淺黃色；陽性(++)：細(xì)胞為棕黃色；強陽性(+++)：細(xì)胞為棕色。如果陽性細(xì)胞數(shù)>10%，則切片呈陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野,光鏡下按陽性染色的細(xì)胞數(shù)和染色深淺分級[5]。

1.3.3 Western-blot檢測TRPV1蛋白表達(dá)量

從-80 ℃冰箱中取出食管黏膜組織標(biāo)本，提取各組織總蛋白；按照BCA試劑盒檢測組織蛋白濃度；制備濃縮膠和分離膠，按上樣體積上樣、電泳；進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、一抗和二抗孵育、化學(xué)發(fā)光；將凝膠圖像掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)量。

1.3.4 RT-PCR檢測TRPV1 mRNA表達(dá)量

從-80 ℃冰箱中取出食管黏膜組織標(biāo)本，Trizol法提取食管黏膜組織總RNA，嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，引物序列如下，內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GGA AGC TTG TCA TCA ATG GAA ATC-3′，下游引物：5′-TGA TGA CCC TTT TGG CTC CC-3′，擴增產(chǎn)物168 bp；TRPV1上游引物：5′-GTG ACG CTG ATT GAA GAC-3′，下游引物：5′-CCG ATG GTG AAC TTG AAC-3′，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次，延伸60 ℃ 30 s。熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。結(jié)果用2-ΔΔCT法計算TRPV1 mRNA表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，等級資料用百分率表示，不同組別百分率的比較采用非參數(shù)秩和檢驗，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料用M(Q1，Q3)表示，不同組別差異的比較采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，兩組間差異的比較采用Dunn′s 法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPV1蛋白陽性染色結(jié)果

TRPV1蛋白在食管鱗狀上皮和腺上皮的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿均有表達(dá)，以細(xì)胞膜表達(dá)為主，三組總體比較，TRPV1蛋白在食管鱗狀上皮陽性表達(dá)較多，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，在食管腺上皮陽性表達(dá)較少，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。進(jìn)一步兩兩比較示，在食管鱗狀上皮中，RE組和正常對照組、NERD組和正常對照組間TRPV1蛋白陽性表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，其中食管鱗狀上皮細(xì)胞膜陽性表達(dá)顯著，RE組陽性、強陽性表達(dá)較多，NERD組陽性表達(dá)較多，正常對照組弱陽性表達(dá)較多；食管鱗狀上皮細(xì)胞漿陽性表達(dá)欠佳，RE組僅可見極個別細(xì)胞漿陽性表達(dá)，NERD組細(xì)胞漿無陽性表達(dá)，正常對照組可見部分細(xì)胞漿弱陽性表達(dá)；RE組和NERD組間TRPV1蛋白陽性表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1 三組患者TRPV1蛋白陽性染色免疫組化圖譜(×200)

表1 NERD、RE、正常對照患者TRPV1蛋白陽性染色結(jié)果比較 [n(%)]

2.2 TRPV1蛋白表達(dá)量結(jié)果

總體比較，TRPV1蛋白表達(dá)在三組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較示，與RE組和正常對照組相比，NERD組TRPV1蛋白表達(dá)更為顯著(P<0.05)；RE組和正常對照組間TRPV1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見圖2、表2。

2.3 TRPV1 mRNA表達(dá)量結(jié)果

總體比較，TRPV1 mRNA表達(dá)在三組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，與NERD組和正常對照組相比，RE組TRPV1 mRNA表達(dá)更為顯著(P<0.05)；NERD組和正常對照組間TRPV1 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

圖2 NERD、RE、正常對照患者TRPV1蛋白表達(dá)量條帶圖(1為NERD組，2為RE組，3為正常對照組)

表2 NERD、RE、正常對照患者TRPV1蛋白表達(dá)量結(jié)果比較

表3 NERD、RE、正常對照患者TRPV1 mRNA表達(dá)量結(jié)果比較

3 討論

近些年我國GERD的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量[6]，部分GERD患者對抑酸藥治療效果不佳[7]，因此明確GERD癥狀產(chǎn)生機制對其治療具有重要意義。已有研究證實，VH與NERD和功能性燒心顯著相關(guān)，其在RE中研究較少。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，RE患者中也有較普遍的焦慮現(xiàn)象且與功能性胃腸病重疊存在，因此我們推測，除了NERD，VH也參與了RE的發(fā)生。

本研究針對RE、NERD患者食管黏膜的免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRPV1蛋白在食管鱗狀上皮細(xì)胞膜陽性表達(dá)顯著，在RE組陽性、強陽性表達(dá)較多，在NERD組陽性表達(dá)較多，在正常對照組弱陽性表達(dá)較多；TRPV1蛋白在食管鱗狀上皮細(xì)胞漿陽性表達(dá)欠佳，在RE組僅可見極個別細(xì)胞漿陽性表達(dá)，在NERD組細(xì)胞漿無陽性表達(dá)，在正常對照組可見部分細(xì)胞漿弱陽性表達(dá)。本研究RT-PCR結(jié)果顯示TRPV1 mRNA表達(dá)在RE組顯著高于NERD組和正常對照組?？傮w來說，TRPV1在RE中表達(dá)更為顯著。前期有本研究組其他成員做的動物實驗為基礎(chǔ)，將大鼠賁門肌部分切開加幽門部分結(jié)扎作為RE模型[8]，發(fā)現(xiàn)TRPV1在RE大鼠模型下丘腦組織中表達(dá)增高。這與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

TRPV1為非選擇性陽離子通道[9]，是一種傷害性感受器，對酸尤其敏感，廣泛存在于脊髓背角神經(jīng)元的初級傳入神經(jīng)、三叉神經(jīng)、迷走神經(jīng)等，可被多種理化因素、炎癥介質(zhì)直接激活或敏化[10]，該通道激活后，大量鈣離子內(nèi)流，引起神經(jīng)末梢去極化產(chǎn)生動作電位，釋放降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)和P物質(zhì)(Substance P，SP)[11]，這些物質(zhì)可導(dǎo)致滲出和炎癥反應(yīng)[12]，引起痛覺敏感和燒心癥狀[13]。同時TRPV1蛋白上的多個調(diào)控位點可增強和敏感化TRPV1通道，使內(nèi)臟敏感性增高，對其功能的實現(xiàn)具有重要作用，這可能是TRPV1引起GERD的主要機制。

文獻(xiàn)報道TRPV1的表達(dá)與RE嚴(yán)重程度相關(guān)，RE患者食管黏膜損傷越重，其TRPV1表達(dá)越高[14]。實驗表明，注酸大鼠背根神經(jīng)中的TRPV1表達(dá)比未注酸大鼠顯著升高[15]，而TRPV1敲除的大鼠對注酸反應(yīng)不明顯[16]。推測TRPV1通路可能會啟動并維持酸介導(dǎo)的食管黏膜炎癥、上皮屏障損害及食管高敏狀態(tài)，且該過程與酸暴露時間、黏膜損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17]。

NERD患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的反酸、燒心癥狀卻無內(nèi)鏡下食管黏膜受損表現(xiàn)，所以又稱其為“癥狀性GERD”[18]，且這部分患者中有很大比例表現(xiàn)出對抑酸劑效果欠佳，我們猜想，抑酸效果差的NERD患者出現(xiàn)癥狀是由于食管黏膜敏感性增高所致[19]。本研究Western-blot結(jié)果顯示，TRPV1蛋白表達(dá)在NERD組顯著高于RE組和正常對照組，推測與RE組相比，VH在NERD的發(fā)病機制中作用更顯著。研究表明，當(dāng)發(fā)生酸反流時，食管黏膜的TRPV1表達(dá)升高，胃腸道、下丘腦等其他部位的TRPV1表達(dá)也升高，使初級傳入神經(jīng)纖維和脊髓背角神經(jīng)元興奮，進(jìn)而刺激中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)興奮[20]，使食管黏膜敏感性增加，對酸反應(yīng)及疼痛的閾值下降，進(jìn)而更易引起反酸、燒心癥狀。大量關(guān)于腸易激綜合征的研究已經(jīng)證實TRPV1 可以增高內(nèi)臟敏感性，動物實驗表明，TRPV1阻滯劑可降低內(nèi)臟的敏感性[21]，而給予離體細(xì)胞酸刺激后TRPV1蛋白和mRNA表達(dá)均增加[22]。結(jié)合本研究結(jié)果及文獻(xiàn)報道，我們推測TRPV1可能通過參與內(nèi)臟高敏感而引起GERD發(fā)病[23]。

此外，本研究標(biāo)本數(shù)量較少，研究范圍較局限，問卷調(diào)查結(jié)果主觀性較強，可能對實驗結(jié)果造成一定影響。今后需擴大樣本量、完善動物干預(yù)實驗，進(jìn)一步對TRPV1與GERD的關(guān)系及分子機制進(jìn)行深入研究。

綜上所述，TRPV1可能參與RE和NERD患者的食管黏膜損傷、內(nèi)臟高敏感機制，可能為探索GERD藥物治療提供新靶點。