幽門螺旋桿菌感染與胃間質(zhì)瘤相關危險因素的相關性研究

吳湛彬，周榮佳，林樹洪，陳浩軍

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)作為消化道腫瘤的其中一種，來源于胃腸道肌間神經(jīng)叢附近的間葉組織，其發(fā)病率占所有消化道腫瘤的5%[1]，GIST可發(fā)生于食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸等，其中GSTs發(fā)生率最高。在目前需病理學檢查確定形態(tài)，再通過免疫組化方法檢查酪氨酸CD117和骨髓干細胞抗原CD34來鑒別于其他間質(zhì)起源的腫瘤(如平滑肌瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤等)[2]。雖然GSTs大多數(shù)為良性腫瘤，并不能單靠良惡性來區(qū)分GSTs，將間質(zhì)瘤進行危險程度分級已作為一種指導臨床治療的手段[3]，目前更多輔助檢查例如超聲內(nèi)鏡、CT、MR等檢查對胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)現(xiàn)、診斷、危險分級、治療方式起指導性作用[4-10]。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染成為目前上消化道疾病等頭等因素，例如H.pylori感染大大的增加了上消化道潰瘍、胃癌、慢性萎縮性的概率[11]。本文研究幽門螺旋桿菌感染是否與GSTs的惡性程度及瘤體大小、出血存在一定關系。為臨床的治療及復查跟蹤提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年1月8至2021年4月2日廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院就診的40例GSTs患者，年齡為32歲～77歲，平均年齡(58.78±14.41歲),其中<60歲有22例，≥60歲有18例，男性、女性患者各20例，收集患者的資料包括：性別、年齡、住院時間，觀察指標：腫瘤部位、瘤體內(nèi)壞死、起源部位、細胞的異型程度、腫瘤的危險程度、瘤體破裂出血、瘤體的大小納入標準:①經(jīng)胃鏡和病理學、免疫組化檢查確診為GSTs；②患者簽署知情同意書。排除標準：①嚴重肝腎脾等臟器器質(zhì)性病變者；②曾有進行過化療、放療的患者；③精神疾病等嚴重影響本研究者；④不能通過病理或免疫組化等方法確診的；⑤不能進行危險度分級；⑥缺乏相應的臨床資料;⑦標本組織較少。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 石蠟切片 采用10%的福爾馬林固定活檢標本，使用不同濃度的乙醇進行脫水，然后進行石蠟包埋，切成4 μm厚度的切片。

1.2.2 病理學檢查 其中GSTs的危險程度是根據(jù)NIH 2008改良版原發(fā)GIST術后危險程度來進行判定見表1。

1.2.3 免疫組化 采用免疫組化SP法，測定Desmin、OG-1、SMA、S-100、Ki-67、CD34、CD117、CgA、SDHB等蛋白標志物在GSTs組織中的表達情況。標本石蠟塊切片4 μm厚，在75 ℃恒溫箱中放置4 h，取出后自然冷卻。將切片脫蠟、水合，放置于高壓水浴鍋內(nèi)的枸櫞酸鈉緩沖液中進行熱修復，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑， 37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加山羊血清封閉液，37 ℃靜置40 min后，滴加Desmin、DOG-1、SMA、S-100、Ki-67、CD34、CD117、CgA、SDHB抗體(1∶200)切片在4 ℃過夜。復溫、PBS緩沖液洗片后滴加生物素標記的第二抗體，37 ℃靜置30 min，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片后滴加DAB顯色液，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，脫水，最后用中性樹膠封片。圖1A為CD34陽性表達，圖1B位CD117陽性表達，圖1C為ki67陽性表達，圖1D為腫瘤細胞核分裂相。

表1 原發(fā)GIST術后危險程度分級(NIH 2008改良版)

1.2.4H.pylori檢查 采用改良Giemsa染色法和13C呼氣試驗對H.pylori進行檢測，改良Giemsa染色法：將石蠟切片常規(guī)脫蠟復水后，采用2%的Giemsa染色劑進行30 min的染色，采用自然水洗后置入純酒精內(nèi)進行脫水，應用二甲苯進行透明，樹膠進行封固，在油鏡下觀察，染色結(jié)果H.pylori呈藍色，形狀為短桿狀、點狀或略呈“S”型，以胃小凹最多見。13C呼氣試驗：讓患者空腹6 g以上后再收集100 mL呼氣，口服13C標記的尿素再收集100 mL呼氣，連接13C標記的紅外線能譜儀的檢測孔進行檢測，DOB>2.5則為陽性。結(jié)果判定標：改良Giemsa染色法和13C呼氣試驗均為陽性則為陽性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 H.pylori感染與間質(zhì)瘤各項特性的相關性

根據(jù)本實驗所收集的標本中有19例提示陽性(H.pylori+)，21例提示陰性(H.pylori-)，其中性別、腫瘤部位、瘤體內(nèi)壞死、起源部位、細胞的異型程度與H.pylori感染均無明顯統(tǒng)計學意義；而腫瘤的危險程度、瘤體破裂出血、瘤體大小、年齡與H.pylori感染表現(xiàn)出相關性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 CD34、CD117、ki-67的陽性表達及核分裂相(A:CD34; B:CD117;C:ki-67;D:核分裂相)

表2 不同間質(zhì)瘤特性的H.pylori感染比較 [n(%)]

2.2 H.pylori感染對黏膜下層間質(zhì)瘤的影響分析

黏膜下層GSTs中有10例提示陽性(H.pylori+)，6例提示陰性(H.pylori-)，在H.pylori感染下明顯增加了瘤體破裂出血的風險，瘤體內(nèi)細胞壞死及細胞異型程度與H.pylori感染無明顯相關性。見表3。

3 討論

GIST作為消化道系統(tǒng)的常見腫瘤之一，其起源的最常見原因是受體酪氨酸激酶的突變[12]，大約有10%～30%的GSTs存在惡性的傾向，例如周圍器官的侵襲及轉(zhuǎn)移[13]。GSTs臨床癥狀有腹痛、腹部腫塊，可伴惡心、嘔吐或胃腸道出血，當出現(xiàn)這類臨床癥狀時往往腫瘤體積都比較大，造成胃腸道堵塞、腫瘤的破潰，對周圍器官的侵犯[14]。近年來隨著胃腸鏡及超聲內(nèi)鏡檢查的普及，能夠及早發(fā)現(xiàn)GSTs，同時內(nèi)鏡下的切除操作更是早期GSTs的首要治療方案。但目前GSTs的發(fā)生機制仍未明確，亦沒有相關研究中提及H.pylori感染與GSTs的關系。

表3 H.pylori對黏膜下層GSTs的影響分析 [n(%)]

H.pylori能夠在胃酸這種極端環(huán)境中生存，能夠通過鞭毛及表面分子定植于胃黏膜，但機體的免疫系統(tǒng)無法將其清除，從而造成胃黏膜的慢性炎癥[15]，經(jīng)過時間越長，對黏膜組織的損傷越大，最終導致胃黏膜細胞萎縮、化生和異常增生，增加胃癌風險，同時胃黏膜抵抗酸的能力下降導致消化道潰瘍、出血的風險增加[16]。 相關研究提示H.pylori感染后可促進組織中相關分子的表達，如腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、 白細胞 介素 (interleukin，IL)、MIF、P27、環(huán)氧化酶Ⅱ (COX 2)、TRAP1、CagA等, 這類細胞因子能夠增加細胞變異的風險，從而導致腫瘤發(fā)生，以及促進腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[17-25]。

雖然本研究中未能證明幽門螺旋桿菌感染與GSTs細胞的生長存在一定關系，可能樣本例數(shù)較少，但是GSTs發(fā)生于黏膜層及黏膜下層時，是否H.pylori更為容易的影響到GIST細胞的突變，同時誘導一系列的炎癥細胞因子釋放改變腫瘤細胞的微環(huán)境，從而增加腫瘤細胞的侵襲、形變、轉(zhuǎn)移等能力，我們可以在后續(xù)實驗中增加樣本例數(shù)，以及檢測H.pylori感染中GSTs瘤體內(nèi)相關蛋白及基因的變化，從而加強證明H.pylori在GSTs的形成及發(fā)展有一定的作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)H.pylori感染可能增加了GSTs的出血風險，可能性有：①在H.pylori感染基礎下胃腺體細胞的萎縮，造成黏膜變薄，局部瘤體更容易突破黏膜，在胃酸腐蝕下造成出血；②H.pylori感染可能通過改變GSTs細胞的微環(huán)境，促進腫瘤細胞的生長，增加瘤體破裂出血風險。所以H.pylori感染可能作為GSTs的發(fā)生、發(fā)展的一種危險因素。雖然目前仍未證明H.pylori的感染與GSTs的產(chǎn)生存在一定關系，希望能在更多樣本例數(shù)中得到結(jié)論，同時進一步研究H.pylori感染誘導GSTs產(chǎn)生的條件及機制，如何通過改變腫瘤細胞的微環(huán)境進一步促進腫瘤細胞的生長、變異、侵襲及轉(zhuǎn)移。