肝細(xì)胞型藥物性肝損傷患者全基因組關(guān)聯(lián)分析

黎鶯輝 劉永萍 李東良

藥物性肝損傷（DILI）是指由各類藥物、保健品、生物制劑、膳食補(bǔ)充劑及其代謝產(chǎn)物乃至輔料所引發(fā)的肝損傷，是最嚴(yán)重和最常見(jiàn)的藥品不良反應(yīng)之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝衰竭，乃至死亡［1-3］。近年來(lái)，藥物性肝損傷的發(fā)病率及致死率有逐年升高的趨勢(shì)，目前DILI的發(fā)病率已經(jīng)躍居肝臟疾病中的第三位［4］。DILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且個(gè)體差異大，不同個(gè)體DNA序列存在多態(tài)性，而這種多態(tài)性可能導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)基因的功能發(fā)生改變，從而導(dǎo)致DILI的發(fā)生。DILI根據(jù)受損靶細(xì)胞可分為肝細(xì)胞型、膽汁淤積型、混合型、肝血管型，其中以肝細(xì)胞型最為常見(jiàn)［5］，而不同分型的DILI可能發(fā)病機(jī)制有所差異。全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是利用芯片在全基因組水平上檢測(cè)與疾病相關(guān)的易感位點(diǎn)、區(qū)域和相關(guān)基因。本研究利用Illumina SNP芯片對(duì)肝細(xì)胞型DILI患者DNA進(jìn)行GWAS，以期發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞型DILI發(fā)病有關(guān)的易感基因，進(jìn)而揭示DILI的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月至2019年12月本院診斷為肝細(xì)胞型DILI 30例（病例組），男14例，女16例，平均年齡為（48.6±10.62）歲。均符合《藥物性肝損傷診治指南（2015年版）》的診斷流程和要點(diǎn)；采用指南推薦的RUCAM評(píng)分量表對(duì)DILI患者進(jìn)行評(píng)分，選取RUCAM評(píng)分≥6分的DILI患者；根據(jù)患者入院時(shí)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）計(jì)算R值，即R=（血清ALT實(shí)測(cè)值/正常值上限）/（ALP實(shí)測(cè)值/正常值上限），R≥5為肝細(xì)胞型，2≤R<5為混合型，R<2為膽汁淤積型。另選擇同時(shí)期體檢健康者30例為對(duì)照組，男15例，女15例，平均年齡（45.8±15.64）歲。兩組間均無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)其他肝膽系統(tǒng)疾病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、遺傳性肝病、膽囊結(jié)石等；不伴有高血壓、糖尿病、精神神經(jīng)疾病等具有遺傳傾向或患有遺傳病；不伴有嚴(yán)重免疫缺陷。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 （1）DNA抽提：所有受試者抽取EDTA抗凝靜脈血3 mL保存在-20 ℃冰箱，提取血細(xì)胞DNA保存在-80 ℃冰箱［6］。（2）全基因組掃描：將提取的DNA外送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，由該公司按照芯片說(shuō)明書(shū)完成DNA與Illumina Global Screening Array芯片雜交，獲得的樣本原始數(shù)據(jù)利用GenomeStudio（V2011.1，Illumina）進(jìn)行分析，獲取每個(gè)樣本基因型數(shù)據(jù)［7］。（3）數(shù)據(jù)處理和關(guān)聯(lián)分析：應(yīng)用Plink（version1.9）軟件過(guò)濾基因型缺失<10%，最小等位基因頻率<0.01，Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)<1E-10的SNP位點(diǎn)，將過(guò)濾后的SNP位點(diǎn)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。（4）富集分析：通過(guò)hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，分別進(jìn)行GO分析和KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，或中位數(shù)（四分位間距）表示，組間差異采用方差分析或秩和檢驗(yàn)。組間性別比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DILI患者一般資料 DILI患者平均住院11（8~17）d；引起肝功能損害的藥物有：中草藥（雷公藤、決明子、柴胡、何首烏、壯骨關(guān)節(jié)丸、尿毒清）14例，西藥（別嘌醇、阿托伐他汀、對(duì)乙酰氨基酚、抗結(jié)核藥、秋水仙堿 ）16例，其中抗結(jié)核藥（異煙肼、利福平、吡嗪酰胺 ）6例；DILI患者血清學(xué)指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 DILI患者入院和出院時(shí)血清學(xué)指標(biāo)

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 所選取的樣本經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)P>0.05，表明樣本具有代表性，所代表的群體符合遺傳平衡。

2.3 數(shù)據(jù)處理和關(guān)聯(lián)分析 60個(gè)樣本檢測(cè)出的SNP經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到SNP 287769個(gè)，再經(jīng)關(guān)聯(lián)分析后得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的SNP 8352個(gè)（見(jiàn)圖1）。等位基因差異最大的SNP位點(diǎn)（P<0.0001）總共有16個(gè)，對(duì)應(yīng)有7個(gè)基因：CTNNBIP1、LOC105376942、HLA-DQA1、IGF2R、LOC112268039、DNHD1、LACC1，其中第6號(hào)染色體上的差異SNP位點(diǎn)比較集中，其所對(duì)應(yīng)的基因?yàn)镠LA-DQA1和IGF2R（見(jiàn)表2）。

表2 全基因組等位基因關(guān)聯(lián)分析與肝細(xì)胞型DILI有強(qiáng)相關(guān)的SNP

圖1 等位基因關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖

2.4 富集分析 8352個(gè)SNP對(duì)應(yīng)的基因總共有591個(gè)。繪制GO分析的生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）顯著性最小的前10個(gè)注釋基因的條形圖，見(jiàn)圖2。同時(shí)繪制KEGG富集分析結(jié)果中顯著性最小的前12個(gè)通路的氣泡圖，見(jiàn)圖3。最后對(duì)16個(gè)差異最顯著的SNP進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異最顯著的基因?yàn)镠LA-DQA1和IGF2R。見(jiàn)表3，表4。細(xì)胞組分分析顯示這兩個(gè)基因主要存在于高爾基體、細(xì)胞核、細(xì)胞內(nèi)吞小泡、反式高爾基體網(wǎng)、網(wǎng)格蛋白小泡膜上；分子功能分析顯示這兩個(gè)基因主要參與多肽抗原連接、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合、胞內(nèi)維甲酸結(jié)合和MHC II類受體活性。

表3 差異表達(dá)基因生物學(xué)過(guò)程GO分析結(jié)果

表4 差異表達(dá)基因細(xì)胞組分GO分析結(jié)果

圖2 差異表達(dá)基因GO富集圖

圖3 差異表達(dá)基因KEGG富集圖

3 討論

目前DILI的診斷為排他性的診斷，診斷之前需排除其他肝臟疾病，然后根據(jù)可疑藥物接觸史及傳統(tǒng)生物標(biāo)志物ALT、AST、ALP［8］進(jìn)行診斷，加上DILI缺乏特異性的生物標(biāo)志物和典型的臨床表現(xiàn)，因此DILI的診斷難上加難，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)漏診、誤診現(xiàn)象。目前，有1200余種藥物可導(dǎo)致不同程度的肝損傷［9］，國(guó)外以抗菌藥所致的DILI最為常見(jiàn)［10］，我國(guó)以抗結(jié)核藥所致的DILI最為常見(jiàn)［11］，本研究顯示，西藥中導(dǎo)致肝細(xì)胞型DILI最常見(jiàn)的為抗結(jié)核藥，其次為中草藥。我國(guó)DILI的發(fā)病率約為92.95/10萬(wàn)［12］，西方國(guó)家DILI的發(fā)病率達(dá)1~20/1萬(wàn)［13］。據(jù)報(bào)道，多數(shù)DILI 患者的預(yù)后較好，但藥物誘發(fā)引起的肝功能衰竭病死率較高，甚至發(fā)現(xiàn)3周內(nèi)接受肝移植者生存率僅42%［14］。因此早診斷、早治療、早預(yù)防成為降低DILI病死率的關(guān)鍵性因素。

目前，DILI的發(fā)病機(jī)制尚未明確。有學(xué)者認(rèn)為機(jī)體免疫在DILI的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，并提出半抗原假說(shuō)和基因多態(tài)性假說(shuō)。同時(shí)，部分研究機(jī)構(gòu)展開(kāi)了候選基因關(guān)聯(lián)分析及全基因組關(guān)聯(lián)分析的深度研究，并發(fā)現(xiàn)一些風(fēng)險(xiǎn)遺傳因子，發(fā)現(xiàn)某些涉及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基因多態(tài)性與個(gè)體發(fā)生DILI的易感性有關(guān)［15-18］。且不同分型的DILI遺傳易感性可能存在差異，有研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DQB1*0602和HLA-DRB1*1501與阿莫西林克拉維酸引起的膽汁淤積型DILI有關(guān)［19］，而HLA-A*3002和HLA-B*1801與阿莫西林克拉維酸引起的肝細(xì)胞型DILI有關(guān)［20］。本研究針對(duì)肝細(xì)胞型藥物性肝損傷患者進(jìn)行GWAS結(jié)果顯示，與肝細(xì)胞型DILI相關(guān)性最顯著的基因是胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體（IIGF-2R）和人類白細(xì)胞抗原-DQA1（HLA-DQA1），其中HLA-DQA1基因的SNP位點(diǎn)rs9272780和IGF2R基因的SNP位點(diǎn)rs4709391與肝細(xì)胞型DILI的發(fā)病呈強(qiáng)相關(guān)性，且差異最顯著的SNP位點(diǎn)主要集中在6號(hào)染色體上。

IGF2R基因定位于常染色6q26區(qū)域，全長(zhǎng)約136kb，含有48個(gè)外顯子，屬I型跨膜糖蛋白［21］。近年來(lái)研究顯示，IGF2R在體內(nèi)、體外均可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)于抑制細(xì)胞過(guò)度增殖和促進(jìn)凋亡具有重要調(diào)節(jié)作用［22］。目前研究發(fā)現(xiàn)，IGF2R基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等［23-25］，IGF2R被稱為腫瘤的抑癌基因。且有研究發(fā)現(xiàn)IGF2R基因的突變可能抑制機(jī)體的免疫功能［26］，而免疫性損傷及細(xì)胞凋亡在DILI的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用，本研究對(duì)16個(gè)差異最顯著的SNP進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，IGF2R基因主要與生長(zhǎng)因子、高爾基體有關(guān)，因此作者推測(cè)，IGF2R基因多態(tài)性可能與肝細(xì)胞型DILI的易感性有關(guān)。

HLA基因位于人體第6號(hào)染色體短臂上，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類3個(gè)基因區(qū)，其中Ⅱ類基因區(qū)主要包括HLA-DR、DP、DQ3個(gè)亞區(qū)，主要參與外源性抗原提呈和免疫應(yīng)答，因此HLA與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答有著密切的關(guān)系。雖然DILI發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但目前很多研究表明HLA基因突變是導(dǎo)致DILI的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素［27］。楊志明等［28］研究發(fā)現(xiàn)HLADQA1*0103等位基因可能是慢性丙型肝炎的拮抗基因，而HLA-DQA1*0501等位基因可能會(huì)抑制轉(zhuǎn)氨酶升高，減慢肝功能損害的進(jìn)程，最終影響疾病的轉(zhuǎn)歸。且也有研究［29］發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1基因多態(tài)性與慢性乙型病毒性肝炎易感性有關(guān)。MENG等［30］研究發(fā)現(xiàn)HLADQA1*0102為抗結(jié)核藥物所致肝損傷的保護(hù)因素。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1基因多態(tài)性與肝細(xì)胞型藥物性肝損傷易感性有關(guān)。

藥物性肝損傷是與多基因相關(guān)的，是包括環(huán)境、遺傳、藥物等多種因素引起的復(fù)雜性肝病。IGF-2R和HLA-DQA1基因多態(tài)性可能與肝細(xì)胞型藥物性肝損傷易感性有關(guān)，下一步作者將加大樣本量、針對(duì)單一藥物或某一類藥物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，為DILI的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，以及為篩查DILI的易感人群和診斷DILI提供可行的方法。