煙草黑脛病菌分子生物學研究進展

王文靜 王曉強 許永幸 王鳳龍 任廣偉 王東坤

摘 要：煙草黑脛病是煙草主要病害之一，每年給煙草生產(chǎn)造成巨大損失。煙草黑脛病菌隸屬于卵菌綱疫霉屬。近十幾年來隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，煙草黑脛病菌的分子生物學研究有了較大進步。本文總結(jié)了煙草黑脛病菌在病原菌起源和分類命名、全基因組序列、線粒體基因組序列和功能基因等方面的研究進展，并分析了煙草黑脛病菌在分子生物學研究方面的未來發(fā)展方向，以期為煙草黑脛病菌致病機理研究和煙草分子抗黑脛病育種提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛病;全基因組;線粒體基因組;基因

Abstract： Black shank is one of the main diseases in tobacco， which causes vast yield loss each year. Black shank is caused by Phytophthora parasitica var. nicotianae which belongs to oomycetes Phytophthora. In recent years， with the rapid development of molecular biology technology， the molecular biology research of tobacco black shank has made big progress. In this review， we summarize the origin， classification， and designation of the pathogen， as well as the research progresses in nuclear genome sequence， mitochondrial genome sequence， and functional genes in recent years. Future perspectives of molecular biology application in tobacco black shank studies are analyzed as well. This review could provide references for researches on pathogenesis of tobacco black shank and molecular breeding of tobacco resistance to blank shank.

Keywords： Phytophthora nicotianae; whole genome; mitochondrial genome; genes

煙草黑脛病由寄生疫霉菌（Phytophthora nicotianae，又稱Phytophthora nicotianae Breda de Haan， Phytophthora parasitica var. nicotianae）侵染煙草引起，俗稱煙草疫病，為世界性的煙草病害，在美洲、非洲和亞洲都有發(fā)生，是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，每年給煙草生產(chǎn)造成巨大損失。目前在我國除黑龍江以外的各煙區(qū)均有發(fā)生，發(fā)生較重的省份有云南、貴州、四川、河南、山東等[1]。由于黑脛病的巨大危害，多年來相關(guān)學者對該病進行了大量研究，在病害癥狀、病原微生物學特性、病害遺傳規(guī)律以及病害流行規(guī)律等方面取得了較大進展。隨著分子生物學技術(shù)的興起，對黑脛病分子生物學特性的研究也隨之展開，特別是近年來測序技術(shù)的迅猛發(fā)展大力推動了該領域的研究，因此本文總結(jié)了煙草黑脛病病原菌的起源和分類名稱、全基因組序列、線粒體基因組序列以及功能基因等方面的研究進展，探討了利用分子生物學技術(shù)深入開展煙草黑脛病菌研究的未來發(fā)展方向，以期為黑脛病致病機理的解析和煙草抗黑脛病分子育種提供參考。

1 煙草黑脛病菌的起源、分類和名稱由來

煙草黑脛病菌隸屬于藻物界（Chromista）、卵菌綱（Oomycetes）、霜霉目（Peronosporales）、腐霉科（Pythiaceae）、疫霉屬（Phytophthora）[2]?；C據(jù)顯示，最古老的卵菌類似結(jié)構(gòu)可以追溯到360—400百萬年前的泥盆紀時期[3]。卵菌很大程度上起源于海洋環(huán)境，包括很多動物病原菌和植物病原菌，其中植物病原菌占到60%以上[4]。長久以來，卵菌因為與真菌相似的絲狀真核特性，一直被劃分為真菌。但隨著研究的深入，一些特征表明卵菌和真菌有較遠的遺傳關(guān)系，相反與硅藻和褐藻有較近的親緣關(guān)系[5-7]。分子生物學的發(fā)展證明了這種分類的科學性。通過分析保守的DNA序列，比如線粒體COX2（細胞色素氧化酶第Ⅱ亞基），核糖體大亞基（large-subunit ribosomal DNA， LSU rDNA）和核糖體小亞基（small-subunit ribosomal DNA， SSU rDNA）的基因序列，證明卵菌不屬于真菌，而屬于囊泡藻界（Chromalveolata）[8-10]。

煙草黑脛病最早由Breda de Haan于1896年在印度尼西亞的爪哇首次發(fā)現(xiàn)和描述，并將其命名為煙草疫霉（Phytophthora nicatianae van Breda de Haan tobacco nicitine）[11]。經(jīng)過漫長的演化過程，現(xiàn)在普遍采用的命名方式是Phytophthora parasitica var. nicotianae，或者Phytophthora nicotianae[11]。

2 煙草黑脛病菌基因組測序分析

2.1 煙草黑脛病菌全基因組序列分析

隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，疫霉菌的基因組研究進展迅速。目前，一些重要的植物疫霉種的基因組已經(jīng)完成全基因組測序并公布，如致病疫霉菌，大豆疫霉菌，橡樹疫霉菌，辣椒疫霉菌和煙草黑脛病菌[12-15]（表1）。這些疫霉菌的基因組大小不等，最大的是致病疫霉菌，為240 Mb，最小的為辣椒疫霉菌，為63 Mb。2016年，煙草黑脛病菌全基因組序列發(fā)表，0號生理小種基因組大小為80 Mb，包含17 797個基因;1號生理小種基因組大小為69 Mb，包含14 542個基因[15]?？梢钥闯?，煙草黑脛病菌的基因組大小在已測序的這幾個疫霉菌中處于中間位置，遠小于致病疫霉菌，與大豆疫霉菌大小相近（95 Mb）。

2.2 煙草黑脛病菌線粒體基因組序列分析

煙草黑脛病菌線粒體基因組形狀為環(huán)狀，大小為37 561 bp，包含38個編碼蛋白基因，25個轉(zhuǎn)運RNA （tRNA）基因和2個核糖體RNA （rrnl and rrns）基因[16]。黑脛病菌線粒體基因組大小與其他疫霉種的線粒體大小基本相同（表2）。橡樹疫霉菌線粒體基因組大小為39 314 bp，大豆疫霉菌線粒體基因組大小為42 977 bp，都包含37個相同的蛋白編碼基因和25或26個轉(zhuǎn)運tRNAs。

3 煙草黑脛病菌已克隆基因

煙草黑脛病菌全基因組序列分析顯示，該菌包含大量基因，這些基因在菌絲生長發(fā)育和侵染植物中發(fā)揮重要作用。病原菌基因中包含一類特殊的基因，即效應因子。效應因子具有保守序列，在病原菌侵染植物時被分泌到植物體內(nèi)，作用于植物的各個免疫組分，促進侵染。由于效應因子在病原菌和植物互作中的重要作用，效應因子的研究是近年來國際上植物病理學研究的熱點內(nèi)容。疫霉菌基因組內(nèi)的效應因子主要分為兩類，即RxLR效應因子（Arginine-any amino acid-leucine-arginine motif， RxLR）和CRN效應因子（Crinkle and necrosis proteins， Crinklers）[18]（表1）。近年來，黑脛病菌中共有5個效應因子得到克隆鑒定，同時還有若干其他基因得到克隆分析。

3.1 煙草黑脛病菌中的效應因子

（1）PSE1。PSE1（Penetration-Specific Effector 1）克隆于P.parasitica Dastur isolate 310，是煙草黑脛病菌一個RxLR效應因子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在疫霉菌侵染后幾小時內(nèi)瞬間積累，在擬南芥內(nèi)表達PSE1導致與根尖生長素含量降低相關(guān)的生長紊亂。因此研究者推測，寄生疫霉菌在侵入植物過程中分泌效應因子PSE1來改變侵入點周圍的生長素含量從而促進侵染[19]。

（2）PpE4。PpE4是一個RxLR效應因子，在病原菌侵染早期高水平表達，且在吸器周圍分泌和累積，沉默該基因可以大幅降低疫霉菌對煙草的侵染性，瞬時表達該基因則可以恢復基因沉默菌株的致病性。在煙草和擬南芥中表達該基因可以持續(xù)促進病原菌對植物的侵染[20]。病毒誘導的基因沉默實驗顯示PpE4誘發(fā)的細胞死亡受到熱激蛋白HSP90、磷酸激酶NPK和SGT1（suppressor of the G2 allele of SKP1）的調(diào)控，表明該基因可以被植物免疫系統(tǒng)識別[20]。

（3）PpRxLR2。PpRxLR2是一個RxLR效應因子，能夠完全抑制INF-1誘導的細胞死亡，同時促進病原菌侵染煙草[21]。

（4）PpCRN7和PpCRN20。PpCRN7和PpCRN20克隆于P. parasitica isolate IAC 01/95.1，是CRN效應因子成員，其中PpCRN7的表達可對激發(fā)子INF-1誘導的超敏反應（HR）產(chǎn)生加性效應，而PpCRN20的表達抑制了本生煙葉片的HR反應，雖然它們在超敏反應上的作用相反，但它們都可以增強病原菌的致病性[22]。

3.2 煙草黑脛病菌中的其他基因

除了效應因子在病原菌的侵染中發(fā)揮重要作用外，還有其他基因在病原菌的的形態(tài)建成和侵染過程中進行調(diào)控，目前克隆的相關(guān)基因具體研究進展如下。

（1）ParA1。ParA1是一個類似于PAMP（microbial- associated molecular pattern）的激發(fā)子，是一個20個氨基酸的信號肽。1993年，KAMOUN等[23]對9個寄生疫霉菌寄主分離物的ParA1進行了研究，結(jié)果顯示，不同寄主分離物產(chǎn)生ParA1的分子機制不同，有的分離物基因組包含ParA1基因序列，也產(chǎn)生ParA1激發(fā)子;但有的分離物基因組雖然包含ParA1基因序列，但最終卻不產(chǎn)生ParA1激發(fā)子。在Northern檢測中，產(chǎn)生ParA1的分離物都檢測到RNA，而不產(chǎn)生ParA1的分離物都沒有檢測到RNA。在此試驗里兩個煙草分離物都不產(chǎn)生ParA1激發(fā)子，但其中一個煙草分離物基因組中確實包含ParA1基因序列，表明起碼在這個分離物里ParA1的產(chǎn)生受到了RNA水平上的調(diào)控[23]。

（2）NPP1。NPP1 （Necrosis-inducing Phytophthora protein 1，GenBank accession No. AAK19753），大小為24 kDa，克隆于P.parasitica 1828分離物，可以激活歐芹上Pep-13（peptide fragment）相似的抗性反應[24]。Pep-13分離自細胞壁谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，存在于疫霉屬多個種內(nèi)，在歐芹上激活多個層面的抗性反應[18]。NPP1同時存在于致病疫霉菌和大豆疫霉菌中，其結(jié)構(gòu)上的同源物在卵菌和真菌細胞中都有，但是在植物中沒有發(fā)現(xiàn)。將NPP1注射擬南芥Col-0植株會導致抗病相關(guān)基因的表達，以及活性氧和乙烯的產(chǎn)生[24]。

（3）pppg1。pppg1，克隆于P. parasitica isolate 98151 （Taiwan Agricultural Research Institute），是一個胞外多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶（endopolygalacturonase）。pppg1基因具有疫霉菌標準的核心啟動子和內(nèi)含子序列pppg1，預測的蛋白大小為39.7 kDa，pI值為5.2，在N端包含一個20個氨基酸的信號肽。在培養(yǎng)基中，pppg1的轉(zhuǎn)錄受到葡萄糖的抑制，但是可以被果膠誘導。另外，pppg1在病原菌與植物的互作中高水平表達，表明它在病原菌侵染中發(fā)揮作用。在寄生疫霉菌中又克隆到pppg2-pppg10共9個基因，這些基因在病原菌侵染植物過程中發(fā)揮不同作用[25-26]。

（4）PpPDI1。PpPDI1（Phytopthora parasitica Protein disulfide isomerase 1， PpPDI1）在煙草黑脛病菌侵染時與吸器結(jié)構(gòu)的發(fā)育有關(guān)，同時與病原菌的致病性相關(guān)[27]。PpPDI1可以誘導強烈的煙草葉片細胞死亡，其CGHC功能結(jié)構(gòu)區(qū)對誘導細胞死亡是必須的;PpPDI1特異性累積在吸器，并且菌的吸器明顯增多，增強了病原菌的定殖能力，這些結(jié)果表明，在侵染過程中PpPDI1可能作為一個毒性因子對病原菌侵染寄主植物發(fā)揮重要作用[27]。

（5）DLC1。疫霉菌的雙鞭毛游動孢子是促進疫霉菌侵染寄主植物的重要工具，在疫霉菌侵染過程中發(fā)揮重要作用，而鞭毛的組裝和功能取決于許多基于動力蛋白的分子馬達，它們促進鞭毛內(nèi)逆行運輸和鞭毛軸絲中相鄰微管雙倍的滑動[28]。動力蛋白輕鏈1（Dynein light chain 1， DLC1）是動力蛋白外臂多蛋白復合物中的一種，是一個22 kDa的富含亮氨酸的蛋白，結(jié)合在動力蛋白β重鏈上[28]。煙草疫霉菌中DLC1同源物PnDLC1是單拷貝基因，通過篩選煙草疫霉菌BAC基因組文庫而獲得，主要在孢子菌絲發(fā)育中發(fā)揮作用，其在孢子菌絲中比在營養(yǎng)菌絲、游動孢子或萌發(fā)囊中基因表達水平更高[28]。RNAi介導的PnDLC1基因沉默轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生了無鞭毛、靜止的游動孢子，表明PnDLC1基因在煙草黑脛病菌的孢子發(fā)育中發(fā)揮作用[28]。

（6）CBEL。煙草黑脛病菌質(zhì)外體效應蛋白CBEL（Cellulose-Binding Elicitor Lectin）位于細胞壁，是一個大小為34 kDa的糖蛋白，推測其由兩個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的直接重復序列組成，這兩個重復序列由一個富含Thr/Pro （脯氨酸）的區(qū)域連接[29]。感染試驗表明，CBEL沉默后不會大幅影響病原菌致病性，但是在與寄主植物根部接觸時會形成聚集性菌絲，表明CBEL在感知寄主纖維素時起作用，而不是在菌絲聚集時起作用[29]。有趣的是，CBEL的缺失與體外乳頭狀細胞壁增厚的異常形成有關(guān)，提示CBEL參與了疫霉菌細胞壁的沉積[30]。試驗證明，沉默CBEL基因會使細胞壁增厚，減少與細胞表面的連接，但是對菌絲生長沒有影響，同時對病原菌的致病性也沒有明顯影響[30]。另外，該基因?qū)z細胞壁的結(jié)構(gòu)和對植物細胞表面的粘附是必需的[30]。

（7）PnPMA1。PnPMA1克隆于P. parasitica分離物Pp016，其蛋白包含10個跨膜螺旋和3個細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中蛋白C端插入環(huán)伸入到細胞外空間[31]。PnPMA1是一個非典型質(zhì)膜H+-ATPase，在孢子生長過程中發(fā)揮作用，在病原菌中沉默PnPMA1基因，會導致無鞭毛和畸形的孢子產(chǎn)生[31]。研究者推測PnPMA1通過影響離子平衡和細胞壁質(zhì)膜相互作用來調(diào)控孢子的生長發(fā)育過程[31]。

4 總結(jié)和展望

隨著分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，疫霉菌的分子生物學研究取得了飛速發(fā)展，尤其在致病疫霉菌和大豆疫霉菌的功能基因組學研究方面進步迅速，成果顯著，但相比較而言，引起煙草黑脛病的寄生疫霉菌的分子生物學研究進展緩慢，已經(jīng)鑒定克隆的基因數(shù)量較少，功能基因研究沒有深入開展，落后于致病疫霉菌和大豆疫霉菌在這方面的研究。寄生疫霉菌侵染寄主廣泛，除侵染煙草引起煙草黑脛病外，還可侵染柑橘、擬南芥和番茄等200多種植物，是農(nóng)林生產(chǎn)中的重要病原菌。相比于寄主范圍狹窄的致病疫霉菌（侵染馬鈴薯和番茄）和大豆疫霉菌（只侵染大豆），寄生疫霉菌的特性研究對疫霉屬更有代表性，因此對寄生疫霉菌的研究應更加深入。

煙草黑脛病未來應加強黑脛病病原小種的分子鑒定和功能基因兩方面的研究。病原鑒定歷來是病害研究的基礎，也是難點。國際上黑脛病生理小種雖然明確為0、1、2、3四個，以前的研究認為國內(nèi)煙區(qū)的黑脛病生理小種主要為0號和1號[32-34]，但是近幾年關(guān)于黑脛病生理小種的研究報告很少。過去的鑒定方法多采用傳統(tǒng)的生物學鑒定方法，費時費力，且結(jié)果不穩(wěn)定，因此選用分子生物學方法來鑒定黑脛病菌生理小種應是未來重要的研究方向。

煙草黑脛病菌全基因組測序已經(jīng)完成并公布，但是其基因組中包含的數(shù)目龐大的效應因子卻一直未得到更深入的鑒定研究，這在一定程度上阻礙了煙草黑脛病菌致病機理的研究。因此，效應因子應成為未來黑脛病研究中的重要內(nèi)容，包括分離克隆效應因子，鑒定效應因子在煙草體內(nèi)的作用靶標，構(gòu)建效應因子與煙草免疫系統(tǒng)相互作用的分子網(wǎng)絡，分析這些效應因子在煙草體內(nèi)的作用方式，從而為解析黑脛病菌的致病機理奠定基礎，為煙草分子抗病育種提供理論指導。

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