發(fā)育時期和植煙海拔對紅花大金元煙花腺毛分泌成分的影響

解勝男 范志勇 付秋娟 韓曉 蒯雁 宗鵬 王德勛 杜詠梅

摘 要：煙草花序富含西柏三烯二醇（CBT-diols）、蔗糖酯（SE）等腺毛分泌成分。為明確發(fā)育時期和植煙海拔對煙花腺毛分泌成分的影響，本研究以云南大理紅花大金元花序為研究材料，應用液相色譜儀、氣質(zhì)聯(lián)用儀分別測定其煙花中的CBT-diols、SE，研究了CBT-diols、SE積累量隨發(fā)育時期及植煙海拔的變化。結(jié)果表明：（1）隨煙花發(fā)育時期推進，煙花花朵及煙草花序中CBT-diols、SE積累量均呈持續(xù)增加趨勢，盛花期煙草花序CBT-diols、SE積累量最高。（2）隨植煙海拔升高，煙草花序生物產(chǎn)量呈顯著降低趨勢，而煙花花朵CBT-diols、SE的積累量則均有顯著升高的趨勢;高海拔（2227 m）產(chǎn)地煙草花序SE積累量最高，而CBT-diols積累量卻顯著低于中高海拔產(chǎn)地（1938 m、1740 m）。（3）煙花發(fā)育時期及植煙海拔對CBT-diols、SE積累量的比值均有顯著影響，煙花發(fā)育初期和高海拔條件下，二者比值較低。本研究為高附加值利用紅花大金元煙花腺毛分泌成分提供了研究基礎。

關鍵詞：煙花;西柏三烯二醇;蔗糖酯;發(fā)育時期;植煙海拔

Abstract： Cembratrien-diols （CBT-diols） and sucrose esters （SE） are abundant in the glandular trichome secretion of Hongda tabacco flowers. To ascertain the effects of developmental stage and tobacco planting altitude on the glandular trichome secretion in tobacco flowers， Honghuadajinyuan tabacco flowers from Dali were selected to determine CBT-diols and SE by ultra-performance liquid chromatography and gas chromatography mass spectrometry. The results showed that： （1） With the progression of developmental stages， the accumulation of CBT-diols and SE in individual flower and inflorescence increased continuously， and the accumulation in inflorescence reached the highest level at full bloom stage. （2） With the increase of planting altitude， the biological yield of inflorescence evidently decreased， but the CBT-diols and SE levels in individual flower appeared to be increased; the SE level in inflorescence was the highest at high planting altitude （2227 m）， yet the level of CBT-diols was significantly lower than that at middle-high planting altitude （1938 m， 1740 m）. （3） The ratio of CBT-diols and SE accumulation was significantly influenced by planting altitude and developmental stage， which was the lowest at early tobacco flower development and high planting altitude. The results from this study provide a basis for the utilization of the waste resources of Hongda tabacco flowers with high added value.

Keywords： tobacco inflorescence; CBT-diols; SE; developmental stage; altitude

煙草花器官及葉片、莖表面均密被腺毛，西柏三烯二醇（cembratrien-diols， CBT-diols）及蔗糖酯類（sucrose esters， SE）化合物是烤煙腺毛分泌物的主要成分，其中西柏三烯二醇含量最為豐富，占腺毛分泌成分的60%以上[1-3]。煙草西柏三烯二醇及蔗糖酯類化合物是卷煙香氣的重要前體物質(zhì)[4]，西柏三烯二醇還具有抑菌、抗蟲、神經(jīng)保護、抗腫瘤等生物活性[5-6]。因此，煙草腺毛分泌物在卷煙本香香料、植物源農(nóng)藥、醫(yī)藥等方面均具有較好開發(fā)價值。據(jù)報道[4]，煙草花朵萼片腺毛分泌物量大于葉片。付秋娟等[7]研究證明，煙花是西柏三烯二醇含量最豐富的器官?？緹熓情_花期打頂作物，目前，煙草花序在大田生產(chǎn)過程中大部分被廢棄。關注煙花發(fā)育過程中表面活性成分的積累狀況和影響因素，對于實現(xiàn)大田廢棄煙花高附加值利用，提高煙草種植的經(jīng)濟效益，具有重要意義。

紅花大金元（簡稱“紅大”）是我國特色優(yōu)質(zhì)烤煙品種，因其香氣量足、香氣質(zhì)好、吃味純凈、清香型風格突出等優(yōu)良特性[8]，深受我國骨干卷煙品牌青睞。陳興等[9]采用超臨界CO2萃取紅大煙花香料成分，并添加到卷煙中，結(jié)果表明，該天然香料對豐富煙香、提高卷煙舒適度具有一定應用價值。付秋娟等[7]通過對我國11份主要烤煙栽培品種分析發(fā)現(xiàn)，紅大煙花西柏三烯二醇含量最高。本研究選擇紅大代表產(chǎn)區(qū)云南大理，分別研究了發(fā)育時期及不同植煙海拔對煙花腺毛主要分泌成分——西柏三烯二醇、蔗糖酯積累的影響，為紅大煙花高附加值開發(fā)利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑與儀器

供試材料：試驗地點設置在云南省大理州，供試烤煙品種為紅花大金元，當?shù)爻Ｒ?guī)栽培方式種植?？緹熼_花期（2019年6月下旬），選取紅大煙花花朵（蕾）及花序為試驗材料。

試劑：α-和β-2，7，11-西柏三烯-4，6-二醇（純度95%，實驗室制備），蔗糖八乙酸酯（純度98%，美國Sigma公司），N，O-雙三甲基三氟乙酰胺（純度98%，美國AcrosOrganics公司），二甲基甲酰胺、95%乙醇、無水硫酸鈉（分析純，國藥集團），乙腈（色譜純，Merck公司），超純水。

儀器：超高效液相色譜儀，配置紫外可見檢測器（H-Class，美國Waters公司）;氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C，美國Agilent公司）;水浴氮吹儀（WD-12，杭州奧盛儀器有限公司），恒溫烘箱（DHG-9240A，杭州藍天化藥儀器廠）。

1.2 試驗設計

1.2.1 不同發(fā)育時期煙花腺毛分泌成分積累動態(tài) 試驗于大理州巍山縣永建鎮(zhèn)（海拔1740 m）進行，選擇代表田塊面積0.13～0.2 hm2，3次重復。

煙草花序發(fā)育時期設置3個處理（圖1A）：（1）初花期，第一朵中心花開放;（2）盛花前，初花后3～5 d，大部分花朵盛開，但沒有花朵萎謝及青果形成;（3）盛花期，初花后6～8 d，花朵盛開，有的花朵開始萎謝，形成1～2個以上青果。每田塊選擇不同花序發(fā)育時期的代表煙株30株，采集花序，稱取其質(zhì)量，計算不同時期打頂每公頃煙花產(chǎn)量，并用于提取花序腺毛分泌成分，每處理3次重復。

煙花花朵發(fā)育時期（圖1B）設置6個處理：（1）蕾苞（長1.7 cm±0.1 cm），（2）花蕾（長3.5 cm±0.2 cm），（3）近開花（5.5 cm±0.2 cm），（4）盛開花（5.7 cm±0.2 cm），（5）近謝花（5.3 cm±0.2 cm），（6）青果（直徑2.0 cm±0.1 cm）。于盛花期在代表田塊選擇生長一致的代表煙株15～20株，每株采集不同發(fā)育時期的花朵2～3朵，稱量并計算各時期花朵的平均質(zhì)量，每時期選取平均質(zhì)量±0.01 g的5朵花朵進行測定，每田塊2次重復，每處理共6次重復。

1.2.2 不同植煙海拔煙花腺毛分泌成分積累量的差異 設置3個處理：（1）大理州巍山縣永建鎮(zhèn)，海拔高度1740 m，（2）大理州洱源縣三營鎮(zhèn)，海拔高度1938 m，（3）大理州劍川縣甸南鎮(zhèn)，海拔高度2227 m。各處理選擇長勢均勻的初花期代表田塊0.037～0.1 hm2，每處理3次重復。

煙草花序取樣：初花期，各田塊選擇代表性煙株30株，花序采集及生產(chǎn)量的計算同1.2.1。

煙花花朵取樣：各田塊選取代表煙株10～15株，分別選取發(fā)育時期一致的近開花花朵材料，花朵取樣方法及重復設置同1.2.1。

1.3 煙花腺毛分泌成分提取

1.3.1 煙花花朵或青果腺毛分泌成分提取 分別取稱重后的5朵煙花花朵或青果，花蕾開放端朝下，放入50 mL具塞離心管中，準確加入20 mL 95%乙醇，室溫下渦旋提取2 min，提取完成后，迅速傾出提取液，0～4 ℃冷藏保存，待測。

1.3.2 煙草花序腺毛分泌成分提取 將稱重后的煙草花序材料放入不銹鋼盆中，以95%乙醇為提取溶劑，液料比10：1，輕輕涮動提取，提取3次，每次提取時間2 min，將提取液合并、混勻，精確量取提取液體積，0～4 ℃冷藏保存，待測。

1.4 煙花腺毛分泌成分檢測

西柏三烯二醇檢測：參考付秋娟等[10]方法，將上述提取液用60%乙腈稀釋至適宜濃度，過0.22 μm有機濾膜，液相色譜測定，2次重復。

蔗糖酯檢測：參考蔡莉莉等[11]方法，分別取上述提取液5 mL，氮氣吹干，加入含有蔗糖八乙酸酯的乙酸乙酯內(nèi)標溶液（0.06 mg/mL）50 μL，氮氣吹干。加入500 μL 二甲基甲酰胺和N，O-雙三甲基三氟乙酰胺混合液（體積比1：1），在75 ℃加熱（衍生化）1 h，過0.22 μm有機濾膜，GC/MS測定，以蔗糖八乙酸酯為內(nèi)標進行半定量分析。GC/MS色譜條件為：色譜柱為HP-MS，30 m×250 μm×0.25 μm，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，進樣口溫度290 ℃，分流模式進樣，進樣量1 μL，分流比3：1，色譜柱起始溫度230 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至270 ℃，保持2 min，以1℃/min升至290 ℃，保持4 min。質(zhì)譜傳輸線溫度：280 ℃;四級桿溫度150 ℃;EI離子源溫度230 ℃;電離能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

1.5 煙花花朵/花序腺毛分泌成分積累量計算

煙花花朵或青果西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量分別以兩種方式表示：（1）每朵煙花或青果目標化合物的積累量，單位為μg/朵;（2）單位鮮質(zhì)量煙花花朵或青果目標化合物的積累量，單位為μg/g。煙草花序西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量以每公頃煙株花序生產(chǎn)目標化合物的質(zhì)量表示，單位為kg/hm2。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SAS 9.4軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Duncan新復極差法分析數(shù)據(jù)顯著性，p<0.05為顯著差異，p<0.01為極顯著差異，并利用Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 發(fā)育時期對煙花腺毛分泌成分積累量的影響

2.1.1 不同發(fā)育時期煙花花朵腺毛分泌成分積累動態(tài) 由表1可以看出，隨著發(fā)育進程推進，單位質(zhì)量煙花和單朵煙花中西柏三烯二醇、蔗糖酯的積累規(guī)律并不一致。從單位質(zhì)量煙花來看，西柏三烯二醇積累量在蕾苞至近開花時期變化不顯著，均處于較低水平，盛開花時期開始顯著升高，于近謝花時期達最高水平后迅速降低;蔗糖酯的積累量在蕾苞期和花蕾期即處于較高水平，近開花時期開始下降，且與盛開花、近謝花時期無顯著差異，青果形成后又顯著降低。從單朵煙花來看，西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量均呈上升趨勢，并于煙花近謝時期達最高水平，青果形成后，西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量又顯著降低。

在不同發(fā)育時期，煙花西柏三烯二醇與蔗糖酯積累量的比值也存在較大差異。蕾苞至花蕾期，二者比值較低，煙花接近開放時二者比值迅速升高并穩(wěn)定保持至盛開期及近謝期，至青果形成時二者比值又迅速升高。

2.1.2 不同發(fā)育時期煙草花序腺毛分泌成分積累動態(tài) 由表2看出，隨發(fā)育時期推進，煙草花序產(chǎn)量呈極顯著升高趨勢，西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量及其二者比值也呈極顯著升高的趨勢。盛花期打頂煙草花序西柏三烯二醇、蔗糖酯的積累量分別是初花期的3.2、2.3倍。因此，隨打頂時期推遲煙草花序西柏三烯二醇和蔗糖酯積累量增加，盛花期打頂可得到最高積累量。

2.2 植煙海拔對煙花腺毛分泌成分積累量的影響

2.2.1 不同植煙海拔煙花花朵腺毛分泌成分積累動態(tài) 由表3看出，隨植煙海拔升高，紅大煙花花朵西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量呈升高趨勢。其中，劍川（海拔2227 m）和洱源（海拔1938 m）煙花花朵西柏三烯二醇積累量差異不顯著，但顯著高于巍山（海拔1740 m）;劍川（海拔2227 m）煙花花朵蔗糖酯積累量顯著高于洱源（海拔1938 m）、巍山（海拔1740 m），而洱源、巍山之間差異不顯著。不同海拔之間，煙花花朵西柏三烯二醇積累量最高值（劍川）是最低值（巍山）的1.3倍，而蔗糖酯積累量最高值（劍川）是最低值（巍山）的1.6～1.7倍，因此，植煙海拔對煙花蔗糖酯積累量的影響更大。高海拔條件下，煙花花朵西柏三烯二醇與蔗糖酯積累量的比值最低。

2.2.2 不同植煙海拔煙草花序腺毛分泌成分積累動態(tài) 由表4看出，隨植煙海拔升高，紅大煙草花序產(chǎn)量呈降低趨勢，這可能與隨海拔高度增加，煙花生長期內(nèi)的積溫降低有關。高海拔（2227 m）產(chǎn)地劍川煙花花序蔗糖酯的積累量最高，顯著高于巍山、洱源，而巍山、洱源之間差異不顯著。高海拔（2227 m）產(chǎn)地劍川煙花花序西柏三烯二醇積累量相對較低，顯著低于巍山、洱源。不同植煙海拔條件下，煙草花序西柏三烯二醇與蔗糖酯積累量的比值也存在較大差異，高海拔條件下，二者比值最低。

3 討 論

本研究表明，煙花在蕾苞期即具有較高的西柏三烯二醇、蔗糖酯積累水平，隨著發(fā)育進程推進，西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量升高，至煙花凋謝前達最高，形成青果后，由于部分腺毛隨花冠脫落而遺失，個體青果中西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量顯著低于花朵。隨煙花發(fā)育時期推進，煙草花序產(chǎn)量及其西柏三烯二醇、蔗糖酯的積累量均呈持續(xù)增加趨勢。大田生產(chǎn)中，盛花期打頂，花序中提取獲得的煙花西柏三烯二醇、蔗糖酯的量最多。但在實際應用中，要根據(jù)煙草開花期的大田長勢、長相，綜合考慮打頂時期對烤煙煙葉產(chǎn)量、質(zhì)量、經(jīng)濟性狀以及煙花西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量的影響，確定適宜的打頂時期。

海拔高度對溫度、光照、降雨及土壤等生態(tài)條件均有重要影響，也是影響煙草腺毛分泌成分的重要環(huán)境因素。但是，不同研究者有關植煙海拔對煙草腺毛分泌成分影響的報道存在差異。韓錦峰等[12]研究表明，河南產(chǎn)區(qū)620～1000 m海拔范圍內(nèi)，隨海拔升高，中部煙葉西柏三烯二醇含量呈降低趨勢;畢慶文等[13]發(fā)現(xiàn)，恩施產(chǎn)區(qū)海拔800～1200 m區(qū)域各等級煙葉類西柏烷物質(zhì)總量均明顯高于500～800 m區(qū)域;趙華新等[14]研究表明，貴州畢節(jié)產(chǎn)區(qū)840～2100 m海拔范圍內(nèi)，云煙87和云煙97烤煙成熟期的西柏三烯二醇含量表現(xiàn)為高海拔地區(qū)>低海拔地區(qū)，而畢納1號無論在低海拔和高海拔地區(qū)西柏三烯二醇含量均較高。本研究表明，植煙海拔1740～2227 m范圍內(nèi)，紅大煙花花朵西柏三烯二醇、蔗糖酯積累量均隨海拔升高呈顯著升高趨勢。以上研究結(jié)果存在較大差異的原因，一方面由于不同研究者選擇的海拔區(qū)間差異較大，植煙海拔對煙草腺毛分泌成分的影響規(guī)律可能存在較大差異;另一方面，可能與選擇的煙草品種有關，不同品種腺毛分泌成分量對海拔高度的敏感性可能存在差異。

根據(jù)本研究結(jié)果，煙花發(fā)育時期及植煙海拔對煙花西柏三烯二醇與蔗糖酯的比值均有顯著影響，煙花發(fā)育初期和高海拔條件下，二者比值均較低。作為卷煙香氣成分的重要前體物，西柏三烯二醇、蔗糖酯對卷煙香味和風格特征貢獻的效應不同。卷煙燃燒過程中，西柏三烯二醇熱解，生成茄酮、降茄二酮等香味成分，賦予卷煙甜的酮味，增加煙草本香使煙氣更加豐滿醇和;蔗糖酯熱解可以釋放出低級羧酸，賦予煙氣吸味芳香特征，能使煙氣變得細膩、醇和[1]。因此，提取物中西柏三烯二醇、蔗糖酯組成比例的差異，也會對卷煙香吃味品質(zhì)及其風格特征產(chǎn)生較大影響。因此不同卷煙品牌可根據(jù)需求選擇適宜發(fā)育時期及植煙海拔的煙草花序作為提取原料。

煙草西柏三烯二醇不僅對蘋果腐爛病等植物病原真菌具有較好抑制活性[15-16]，對人體肝癌細胞系HepG2也具有良好抑制效果[17]，在植物源殺菌劑、醫(yī)藥方向具有較好開發(fā)價值。因此，本研究也為開發(fā)大田廢棄煙花在植物源殺菌劑、醫(yī)藥方向的利用價值提供了研究基礎。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，隨煙花發(fā)育時期的推進，煙花花朵及煙草花序中CBT-diols、SE的積累量均呈持續(xù)增加趨勢，盛花期煙草花序中CBT-diols、SE積累量最高;隨海拔升高，煙花花朵中CBT-diols、SE積累量均有顯著升高的趨勢;高海拔產(chǎn)地煙草花序SE的積累量較高，而CBT-diols積累量卻顯著較低;煙花發(fā)育初期和高海拔條件下CBT-diols/SE的比值較低。本研究為高附加值利用紅大煙花廢棄資源提供了研究基礎。

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