高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)不同類型煙葉中的多種生物堿含量

林雨晟 金洪石 張皓楠 金江華 郭偉 李玉娥 趙銘欽 劉鵬飛

摘 要：為快捷準(zhǔn)確地測(cè)定煙葉中生物堿的含量，本研究通過(guò)優(yōu)化提取條件，建立了測(cè)定煙草中煙堿、新煙草堿、假木賊堿和降煙堿的高效液相色譜檢測(cè)方法。優(yōu)化后的檢測(cè)步驟為：干煙葉和5%甲醇的料液比為100 mg/20 mL，在25 ℃下振蕩提取30 min，色譜條件：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉），流動(dòng)相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）。煙堿在0.1～50 μg/mL、其余3種在0.005～2 μg/mL的范圍內(nèi)，4種生物堿均具有較好的線性關(guān)系（R2>0.99）;煙堿檢出限為0.000 65 μg/mL，平均回收率100.79%，RSD 3.11%;新煙草堿檢出限0.088 4 μg/mL，平均回收率98.53%，RSD 3.75%;假木賊堿檢出限0.034 8 μg/mL，平均回收率98.70%，RSD 3.63%;降煙堿檢出限0.150 9 μg/mL，平均回收率101.33%，RSD 4.61%。對(duì)4種不同類型煙葉共11個(gè)不同樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果可靠。該方法前處理簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，重復(fù)性較好，可以滿足煙草樣品中4種生物堿的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：煙草;煙堿;新煙草堿;假木賊堿;降煙堿;液相色譜法

Abstract： In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves， the extraction conditions were optimized， and a method for the determination of nicotine， anatabine， anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows： 100 mg/20 mL solid-liquid ratio， 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min， the chromatographic conditions were C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， mobile phase A （90% water +10% methanol， pH 6.8， 0.15% sodium acetate）， mobile phase B （90% methanol +10% water， pH 3.8）. Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL， with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship （R2 > 0.99）. The limits of detection （LOD） of nicotine were 0.000 65 μg/mL， and the average recoveries were 100.79%， RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL， and the average recoveries were 98.53%， RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL， and the average recoveries were 98.70%， RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL， and the average recoveries were 101.33%， RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested， and the results were reliable. The method is simple and fast， sensitive and repeatable， and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples.

Keywords： tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC

生物堿是一類存在于植物體中的特殊的含氮有機(jī)物，是植物體隨外界環(huán)境變化合成的次生代謝產(chǎn)物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、鎮(zhèn)痛和成癮性[1]。煙草中含有超過(guò)50種生物堿，含量較高的有煙堿（尼古?。⑿聼煵輭A、假木賊堿、降煙堿（去甲基煙堿）等[2]。其中煙堿含量最高，一般占總生物堿組分的90%以上，其他各種生物堿所占的比例一般不超過(guò)10%[3]。不同類型煙葉的生物堿含量差異主要是煙堿和降煙堿的含量差異，而假木賊堿和新煙草堿在各類型煙葉中的含量均較低，且較少出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或降解[4]。

生物堿的組成和含量是影響煙葉質(zhì)量的重要因素，直接影響著煙草制品的勁頭、刺激性、吃味和安全性[5]。煙堿含量對(duì)評(píng)吸質(zhì)量影響極大，過(guò)低勁頭不足，過(guò)高會(huì)造成刺激性大，影響吃味[6-7];在煙堿去甲基酶的作用下，煙堿脫去甲基后形成降煙堿，降煙堿含量高，則會(huì)降解生成麥斯明等物質(zhì)，影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量，并導(dǎo)致煙草特有亞硝胺（TSNAs）含量上升[8-9];假木賊堿與勁頭得分顯著負(fù)相關(guān)，且對(duì)香氣濃度有顯著影響[10];新煙草堿對(duì)香氣質(zhì)、香氣量、刺激性以及TSNAs含量等均有影響[9，11]。因此準(zhǔn)確快速簡(jiǎn)便的測(cè)定煙葉內(nèi)各生物堿含量對(duì)于煙草研究有著重要作用。

目前關(guān)于煙草生物堿的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（GC）[12-15]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[1，6-18]、液相色譜法（LC）[19-21]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[22-24]。與其他方法相比，液相色譜法的樣品前處理步驟少、誤差小，檢測(cè)更快速、重現(xiàn)性更好，更利于廣泛使用。劉正聰?shù)萚25]利用超高效液相色譜法（UPLC）檢測(cè)了卷煙煙絲中的煙堿、降煙堿、麥斯明、新煙草堿和可替寧等5種生物堿，該方法出峰時(shí)間較快，出峰較為密集，目標(biāo)物不容易區(qū)分。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法，建立了同時(shí)檢測(cè)煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿等煙草中含量較高的4種生物堿[2]的方法，該方法前處理步驟簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，同時(shí)檢測(cè)組分多，且峰形良好。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

4種類型煙葉樣品（烤煙4個(gè)，云南;白肋煙2個(gè)，湖北;雪茄煙海南2個(gè)、四川1個(gè);曬紅煙2個(gè)，吉林），共計(jì)11個(gè)。烘干粉碎過(guò)40目篩備用。

煙堿、降煙堿、新煙草堿、假木賊堿標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98%（TRC，加拿大）;醋酸鈉、磷酸、三乙胺、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純（天津大茂）;甲醇為色譜純（天津科密歐）。

電子天平（上海上平，精度0.000 1 g），超聲儀（鄭州生元，SYU-10-300 DT），pH計(jì)（上海豐控，F(xiàn)K-PH10），LC-20 A液相色譜（日本島津，LC20）。

1.2 前處理方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取4種生物堿10 mg，用100 mL甲醇溶解，得到100 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液母液。分別吸取適量母液，配成4種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照優(yōu)化后的檢測(cè)步驟，通過(guò)峰面積繪制校準(zhǔn)曲線，其中，煙堿的濃度為0.1、0.5、2、10、20、50 mg/g，其余3種生物堿濃度為0.005、0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。

1.2.2 生物堿的紫外掃描及色譜條件 取配制好的單標(biāo)溶液稀釋后進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，掃描范圍為200～400 nm。

色譜條件：島津Shim pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉），流動(dòng)相 B（90%甲醇+10%水，pH 3.8），柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

梯度洗脫程序?yàn)椋? min （0% B）-8.0 min （0% B）-15.0 min （4% B）-23.0 min （26% B）-34.0 min （35% B）-38.2 min （36% B）-39.0 min （40% B）-41.5 min （40% B）- 44.6 min （0% B）。

1.2.3 提取溶劑的篩選 分別配制2%、4%、6%的鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氨水溶液以及0%、5%、10%的甲醇水溶液。稱取各煙葉樣品100 mg，分別放入錐形瓶中，加入溶液20 mL，振蕩提取30 min，過(guò)濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中用對(duì)應(yīng)溶液稀釋定容，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH：5（使用甲醇的處理不需要調(diào)節(jié)pH值），待檢測(cè)。

1.2.4 提取時(shí)間的影響 稱取100 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別提取10、15、20、25、30 min，過(guò)濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測(cè)。

1.2.5 提取溫度的影響 稱取100 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，分別在25、30、35、40、45 ℃的條件下提取30 min，過(guò)濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測(cè)。

1.2.6 料液比的影響 分別稱取50、100、150、200、250 mg煙葉樣品，放入錐形瓶中，加入5%甲醇水溶液20 mL，提取30 min，過(guò)濾至50 mL容量瓶中，定容后取10 mL移至100 mL容量瓶中，用5%甲醇水溶液稀釋定容，待檢測(cè)。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 檢出限和定量限 將最小濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以確定檢出限（LOD），當(dāng)信噪比S/N=10時(shí)所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度以確定定量限（LOQ）。

1.3.2 儀器精密度試驗(yàn) 取同一濃度的混標(biāo)溶液在1.2.2的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，以各對(duì)照品的信息，計(jì)算各成分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3 方法重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一份烤煙樣品5份，每份100 mg，按優(yōu)選后的提取方法進(jìn)行提取，得到樣品溶液，在1.2.2的色譜條件下分別進(jìn)樣，計(jì)算樣品中各成分的含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD）。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一份烤煙樣品5份，每份100 mg，按優(yōu)選后的提取方法進(jìn)行提取，得到樣品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)3 d檢測(cè)同一樣品溶液，每次進(jìn)行5個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算RSD。

1.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 以實(shí)際樣品含量為參考，根據(jù)所對(duì)應(yīng)成分含量的0.5、1、2倍進(jìn)行低、中、高加樣回收率試驗(yàn)。

1.3.6 樣品檢測(cè) 每個(gè)樣品稱取100 mg，放入錐形瓶中，按照篩選出的最優(yōu)前處理?xiàng)l件進(jìn)行提取，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 5（若使用甲醇的處理則不需要調(diào)節(jié)pH值），過(guò)濾至50 mL容量瓶中定容，取10 mL移至100 mL容量瓶中用篩選后溶劑稀釋定容，待檢測(cè)。在1.2.2的色譜條件下分別進(jìn)樣，計(jì)算各樣品中4種生物堿的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以外標(biāo)法進(jìn)行定性和定量測(cè)定，以Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

從生物堿紫外掃描圖可以看出（圖1），4種生物堿均在259 nm處有最大吸收峰，在236 nm處于谷底，超過(guò)282 nm后無(wú)紫外吸收。甲醇在大于250 nm以后均無(wú)紫外吸收干擾，因此選擇259 nm作為4種生物堿的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

如圖2所示，4種生物堿與雜質(zhì)峰分離較好，保留時(shí)間較為適宜。25 min后4種生物堿出峰完成，后續(xù)洗脫時(shí)加大流動(dòng)相B（90%甲醇+10%水，pH 3.8）的比例以沖洗樣品中的醇溶性成分，減少對(duì)色譜柱的污染。煙草中極性較強(qiáng)的生物堿能被弱極性的C18柱吸附和分離，原因在于流動(dòng)相A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸鈉）處于中性的pH 6.8，抑制了生物堿的離子化，增強(qiáng)其與填料之間的吸附力。煙草中的生物堿為弱堿，在水溶液中以游離態(tài)或單質(zhì)子態(tài)等形態(tài)存在，在檢測(cè)時(shí)，不同pH的流動(dòng)相會(huì)直接影響到生物堿的存在狀態(tài)。酸性水溶液pH較小，生物堿離子化導(dǎo)致與色譜柱吸附作用降低，因此保留時(shí)間減少，難以與溶劑峰、雜質(zhì)峰分離，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè);隨著pH的提高，生物堿電離作用減弱，提高了其與填料的吸附力，也就延長(zhǎng)了其保留時(shí)間。例如，陳燕舞[20]等研究了流動(dòng)相pH對(duì)煙堿保留時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)隨著pH的增加，煙堿的保留時(shí)間出現(xiàn)明顯的延長(zhǎng)，當(dāng)流動(dòng)相pH為3.00時(shí)，煙堿保留時(shí)間為4.15 min，而當(dāng)pH為7.00時(shí)，保留時(shí)間延長(zhǎng)至13.37 min。但是流動(dòng)相pH須小于8.00，否則煙草生物堿不穩(wěn)定，且會(huì)降低柱效和影響色譜柱壽命。

2.3 提取條件

煙草4種生物堿屬于分子量較小的極性有機(jī)物，易溶于水、甲醇等溶劑，研究者常用不同濃度的酸、堿、乙醇、甲醇等作為提取溶劑。例如，師君麗等[26]和羅瓊等[21]使用10%的氫氧化鈉浸泡提取了煙堿降煙堿麥斯明等8種生物堿;劉正聰?shù)萚25]選擇了5%氫氧化鈉水溶液和無(wú)水乙醇混合液提取了可替寧、降煙堿、麥斯明、新煙草堿和煙堿;廖坤等[27]認(rèn)為單純用異丙醇作提取溶劑萃取時(shí)間太長(zhǎng)，0.5%的乙酸與異丙醇的混合溶劑提取煙堿效果更好;譚芳等[28]認(rèn)為將甲醇作為提取溶劑來(lái)提取煙堿效果最好。表1結(jié)果表明，6%的鹽酸對(duì)煙堿和新煙草堿的提取效果較好，但是對(duì)假木賊堿的提取效果很差;各濃度的氫氧化鈉溶液對(duì)4種生物堿的提取效果均較差;不同濃度氨水對(duì)于新煙草堿提取效果較好，但對(duì)于其他3種生物堿的提取效果較差;而5%和10%甲醇對(duì)4種生物堿的提取效果均較優(yōu)。由于甲醇為中性溶劑，用甲醇提取的溶液用于HPLC檢測(cè)前不需要調(diào)節(jié)pH，因此在處理步驟上更加簡(jiǎn)便快捷，并且甲醇具有較好的抑菌性，有利于樣品溶液的儲(chǔ)存，因此綜合考慮后采用5%的甲醇作為提取溶劑。

羅瓊等[21]選擇振蕩30 min提取生物堿;廖坤等[27]認(rèn)為振蕩30 min提取煙堿的效果較好。表2示出，5%甲醇的振蕩提取25 min和30 min時(shí)各生物堿的提取率均高于提取10、15、20 min，提取25 min和30 min無(wú)顯著差異，為保險(xiǎn)起見(jiàn)，本試驗(yàn)選擇30 min的振蕩提取時(shí)間。

羅瓊等[21]、劉正聰?shù)萚25]、張瑞等[24]、譚芳等[28]均采用了室溫（25 ℃）下提取生物堿。從表3的試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著溫度的升高，4種生物堿的提取率有小幅度增加，假木賊堿和新煙草堿在35 ℃條件下提取率有輕微降低，但各處理間沒(méi)有顯著差異;并且隨著溫度的升高，提取液明顯可見(jiàn)顏色加深，提取液中色素等雜質(zhì)的含量也隨之升高，考慮到雜質(zhì)對(duì)液相色譜柱的影響，本試驗(yàn)選擇25 ℃作為提取溫度。

儲(chǔ)志兵等[19]選擇的料液比為1：40;丁麗等[13]選擇1：50的料液比;肖遂等[17]進(jìn)行正交對(duì)比試驗(yàn)認(rèn)為1：40的料液比更好。從表4的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，50 mg/20 mL和100 mg/20 mL的料液比條件下提取的生物堿含量差異不顯著，數(shù)值近似，提取完全，而料液比在150 mg/20 mL以上4種生物堿均有降低。與前人研究相比后，決定采用100 mg/20 mL即1：200的料液比作為本試驗(yàn)樣品的前處理?xiàng)l件。

綜上，最終選擇100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振蕩30 min的提取條件。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限 分別對(duì)各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)各個(gè)生物堿的色譜峰面積及其濃度進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表5）。由表5看出，新煙草堿、假木賊堿、降煙堿的線性范圍為0.005～2 μg/mL;煙堿的線性范圍為0.1～50 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.996。煙堿的檢測(cè)限為0.006 5 μg/mL，定量限為0.021 7 μg/mL，新煙草堿的檢測(cè)限為0.088 4 μg/mL，定量限為0.294 8 μg/mL，假木賊堿的檢測(cè)限為0.034 8 μg/mL，定量限為0.116 1 μg/mL，降煙堿稍高，檢測(cè)限為0.150 9 μg/mL，定量限為0.503 1 μg/mL。各生物堿的檢出限和定量限均較低，可以滿足各種類型煙草的檢測(cè)要求。

2.4.2 方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性 如表6和表7所示，方法精密度RSD為1.24%～2.56%，重復(fù)性RSD為1.62%～4.27%，穩(wěn)定性RSD為1.55%～3.36%，平均加標(biāo)回收率在98.17%～102.65%之間，RSD在3.64%～4.08%之間。綜合來(lái)看，該方法重復(fù)性較好，儀器精密度較高，方法穩(wěn)定性較好，加標(biāo)回收率好，適合用于樣品檢測(cè)。

2.4.3 樣品測(cè)定 按上述方法對(duì)不同類型的煙葉樣品進(jìn)行檢測(cè)后得表8。選用了烤煙、白肋煙、雪茄煙和曬紅煙4種不同類型的煙葉樣品。從表8中可以看出，4種不同類型煙草樣品各生物堿含量差異與文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道基本一致。

3 結(jié) 論

本文建立了HPLC法測(cè)定煙葉中煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等4種生物堿的方法。通過(guò)單一因素篩選，以100 mg/20 mL（1∶200）料液比，5%甲醇在25 ℃室溫下振蕩30 min效果最好;HPLC檢測(cè)結(jié)果的線性相關(guān)系數(shù)高，檢出限和定量限低，靈敏度高，重復(fù)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率均較好。本方法前處理步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果可靠，適合批量檢測(cè)不同類型煙葉樣品中的生物堿含量。

參考文獻(xiàn)

[1]程皖燕，王紅娟，陳歡，等. 煙堿偏好模型不同階段大鼠海馬組織中23種細(xì)胞因子水平的變化[J]. 煙草科技，2020，53（9）：25-32.

CHENG W Y， WANG H J， CHEN H， et al. Variations of 23 cytokine levels in rat hippocampus at different stages of a nicotine preference model[J]. Tobacco Science & Technology， 2020， 53（9）： 25-32.

[2]韓富根. 煙草化學(xué)[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：87-97.

HAN F G. Tobacco chemistry[M]. Beijing： China Agricultural Press， 2010： 87-97.

[3]史宏志，黃元炯，劉國(guó)順，等. 我國(guó)煙草和卷煙生物堿含量和組成比例分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2001，7（2）：8-12.

SHI H Z， HUANG Y J， LIU G S， et al. Analysis of alkaloid content and composition ratio of tobacco and cigarette in China[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2001， 7（2）： 8-12.

[4]趙曉丹，魯喜梅，史宏志，等. 不同煙草類型煙葉中性致香成分和生物堿含量差異[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2012，33（2）：7-11.

ZHAO X D， LU X M， SHI H Z， et al. Comparison of composition and contents of neutral aroma components and alkaloids in different types of tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2012， 33（2）： 7-11.

[5]李常軍，宮長(zhǎng)榮，肖鵬，等. 施氮水平和烘烤條件對(duì)烤后煙葉品質(zhì)和含氮組分的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2001，22（1）：6-9.

LI C J， GONG C R， XIAO P， et al. Effects of nitrogen application level and curing conditions on quality and nitrogen content of cured tobacco leaves[J]. Chinese Tobacco Science， 2001， 22 （1）： 6-9.

[6]黃元炯，傅瑜，董志堅(jiān)，等. 河南煙葉營(yíng)養(yǎng)元素和還原糖、煙堿含量及其與評(píng)吸質(zhì)量的相關(guān)性[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1999，20（1）：3-5.

HUANG Y J， FU Y， DONG Z J， et al. The contents of nutritive elements， reducing sugar and nicotine in Henan tobacco leaf and their correlation with evaluation quality[J]. Chinese Tobacco Science， 1999， 20（1）： 3-5.

[7]杜詠梅，郭承芳，張懷寶，等. 水溶性糖、煙堿、總氮含量與烤煙吃味品質(zhì)的關(guān)系研究[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2000，21（1）：9-12.

DU Y M， GUO C F， ZHANG H B， et al. Study on the relationship between water soluble sugar， nicotine， total nitrogen content and taste quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2000， 21（1）： 9-12.

[8]史宏志，李進(jìn)平，Bush L P，等. 煙堿轉(zhuǎn)化率與卷煙感官評(píng)吸品質(zhì)和煙氣TSNA含量的關(guān)系[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2005，11（2）：9-14.

SHI H Z， LI J P， BUSH L P， et al. The relationship between nicotine conversion rate and cigarette sensory evaluation quality and TSNA content [J]. Acta Tabacaria Sinica， 2005， 11（2）： 9-14.

[9]周迪，孫雨琦，史宏志，等. 16個(gè)雪茄煙品種的煙堿轉(zhuǎn)化率及與發(fā)酵后煙葉TSNAs含量的關(guān)系[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2020，26（4）：18-25.

ZHOU D， SUN Y Q， SHI H Z， et al. Nicotine conversion rate of 16 cigar varieties and its relationship with TSNAs content in fermented tobacco leaves[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2020， 26（4）： 18-25.

[10]高志強(qiáng)，鄧小華，曾忠平，等. 烤煙生物堿與評(píng)吸質(zhì)量的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，168（6）：82-85.

GAO Z Q， DENG X H， ZENG Z P， et al. Relationship between alkaloids and evaluation quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2008， 168（6）： 82-85.

[11]孟莉，郭世英，符云鵬，等. 吉林曬煙中的生物堿組成及其對(duì)煙葉內(nèi)在質(zhì)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（5）：287-290.

MENG L， GUO S Y， FU Y P， et al. Composition of alkaloids in suncured tobacco in Jilin and its effect on the internal quality of tobacco leaves[J]. Jiangsu Agricultural Sciences， 2015， 43（5）： 287-290.

[12]黃龍，王進(jìn)元，胡素霞，等. 煙草生物堿的毛細(xì)管氣相色譜分析[J]. 煙草科技，2004（9）：29-32.

HUANG L， WANG J Y， HU S X， et al. Capillary gas chromatographic determination of alkaloids in tobacco[J]. Tobacco Science & Technology， 2004（9）： 29-32.

[13]丁麗，盛良全，童紅武，等. 溶劑萃取-毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定煙草中主要生物堿[J]. 分析化學(xué)，2004，32（9）：1161-1164.

DING L， SHENG L Q， TONG H W， et al. Determination of main alkaloids in tobacco by capillary gas chromatography with solvent extraction [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry， 2004， 32（9）： 1161-1164.

[14]YANG S S， SMETENA I， HUANG C B. Determination of tobacco alkaloids by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2002， 373（8）： 839-843.

[15]CAI J， LIU B Z， LIN P， et al. Fast analysis of nicotine related alkaloids in tobacco and cigarette smoke by megabore capillary gas chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2003， 1017： 187-193.

[16]王保興，楊式華，侯英，等. 全掃描-選擇離子數(shù)據(jù)采集技術(shù)應(yīng)用于煙草中生物堿的快速測(cè)定[J]. 色譜，2008，26（3）：314-317.

WANG B X， YANG S H， HOU Y， et al. Rapid determination of alkaloids in tobacco using gas chromatography-mass spectrometry with full scan-selectedion monitoring mode[J]. Chinese Journal of Chromatography， 2008， 26（3）： 314-317.

[17]肖遂，周冀衡，楊虹琦，等. 氣-質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）法測(cè)定煙草生物堿的方法優(yōu)化[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，36（1）：22-25.

XIAO S， ZHOU J H， YANG H Q， et al. An improvement of method for tobacco alkaloids determination by chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences）， 2010， 36（1）： 22-25.

[18]肖遂. 煙草生物堿組分的分析技術(shù)研究及應(yīng)用[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

XIAO S. Research and application of analysis techniques of alkaloids in tobacco[D]. Changsha： Hunan Agricultural University， 2010.

[19]儲(chǔ)志兵，周新光，水恒福，等. 超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定煙草中煙堿含量[J]. 化學(xué)與生物工程，2006，36（12）： 59-60， 62.

CHU Z B， ZHOU X G， SHUI H F， et al. Determination of nicotine content from tobacco by HPLC[J]. Chemistry & Bioengineering， 2006， 36（12）： 59-60， 62.

[20]陳燕舞，尹篤林，廉世勛，等. 反相高效液相色譜法測(cè)定煙草中煙堿的優(yōu)化[J]. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（3）：52-54

CHEN Y W， YIN D L， LIAN S X， et al. Optimization on the reversed-phase high performance liquid chromatography analysis for nicotine in tobacco[J]. Journal of Natural Science of Hunan Normal University， 2005， 28（3）： 52-54.

[21]羅瓊，李青. 高效液相色譜法測(cè)定煙草中煙堿含量[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018， 718（8）：242-246.

LUO Q， LI Q. Determination of nicotine content in tobacco by high performance liquid chromatography[J]. Modern Agricultural Science and Technology， 2018， 718（8）： 242-246.

[22]鄭慶霞，劉萍萍，陳霞，等. 基于氣質(zhì)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的煙草鮮煙葉代謝組學(xué)分析流程[J]. 煙草科技，2019，52（6）：59-71.

ZHENG Q X， LIU P P， CHEN X， et al. Metabolomic workflow and analysis of fresh tobacco leaves based on GC-MS and LC-MS[J]. Tobacco Science & Technology， 2019， 52（6）： 59-71.

[23]王文達(dá). 煙草中生物堿的提取及生物活性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

WANG W D. Extraction and bioactivity of tobacco alkaloids [D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2018.

[24]張瑞，陸舍銘，丁麗婷，等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測(cè)定卷煙煙絲中的6種生物堿[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2011，30（7）：760-763，768.

ZHANG R， LU S M， DING L T， et al. Rapid determination of six alkaloids in tobacco by ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis， 2011， 30（7）： 760-763， 768.

[25]劉正聰，陸舍銘，桂永發(fā)，等. 超高效液相色譜法測(cè)定卷煙煙絲中的生物堿[J]. 煙草科技，2008，255（10）：43-46.

LIU Z C， LU S M， GUI Y F， et al. Determination of alkaloids in cut tobacco with ultra pressure liquid chromatography[J]. Tobacco Science & Technology， 2008， 255（10）： 43-46.

[26]師君麗，逄濤，李勇，等. 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定煙草中8種生物堿[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33（3）：334-338.

SHI J L， FENG T， LI Y， et al. Simultaneous determination of 8 alkaloids in tobacco by gas chromatography-triple quardrupole mass spectrometry[J]. Journal of Instrumental Analysis， 2014， 33（3）： 334-338.

[27]廖坤，彭春鳴，張翼，等. 氣相色譜法測(cè)定煙草中的煙堿含量[J]. 煙草科技，2003（3）：32-34.

LIAO K， PENG C M， ZHANG Y， et al. Determination of nicotine in tobacco with gas chromatography [J]. Tobacco Science & Technology， 2003（3）： 32-34.

[28]譚芳，王海明，胡麗，等. 高效液相色譜法測(cè)定煙草中煙堿含量[J]. 寧夏農(nóng)林科技，2012，53（10）：146-147.

TAN F， WANG H M， HU L， et al. Determination of nicotine content in tobacco by HPLC[J]. Ningxia Journal of Agriculture and Forestry Science and Technology， 2012， 53（10）： 146-147.