玉米品種和淀粉老化處理對其紅外光譜結(jié)構(gòu)與體外發(fā)酵參數(shù)的影響

陳 凱 江為民 賀志雄 賀建華 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，湖南省動物營養(yǎng)生理與代謝過程重點實驗室，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

直鏈淀粉是D-葡萄糖基以α-(1,4)糖苷鍵連接的多糖鏈，支鏈淀粉中葡萄糖分子之間除了以α-(1,4)糖苷鍵相連外，其支鏈?zhǔn)且驭?(1,6)糖苷鍵相連[1]。玉米籽粒中直鏈淀粉占總淀粉的比例在55%～85%的玉米稱之為高直鏈淀粉玉米(簡稱高直玉米)，與普通玉米相比，高直玉米在食品、醫(yī)藥和環(huán)境保護等領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用[2]，但是高直玉米在反芻動物上的研究相對較少。目前，在飼料生產(chǎn)中以玉米-豆粕型為主，然而高谷物飼糧由于其易降解，在瘤胃中快速發(fā)酵，使揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)堆積，易造成亞急性瘤胃酸中毒，對反芻動物健康發(fā)育產(chǎn)生不利影響，并阻礙反芻動物的正常生長[3]。直鏈淀粉含量高的玉米在瘤胃的發(fā)酵緩慢，相比于快速降解的普通玉米，高直玉米可能具有一定程度上緩解瘤胃酸中毒的功能[4]。

反芻動物精飼料的加工方式主要包括淀粉糊化、壓片和制粒等，飼料加工方式對其在瘤胃內(nèi)停留時間及其飼料利用率都有顯著影響[5]。在體外試驗中，淀粉通?？梢苑譃榭焖傧矸?、緩慢消化淀粉和抗性淀粉，在消化道中的消化酶不能分解抗性淀粉，只能在瘤胃或者大腸微生物發(fā)酵作用下分解為VFA，再被機體利用[6]。淀粉通過蒸汽糊化后，呈現(xiàn)高能無序的狀態(tài)，溶解度低，在長時間低溫條件下易沉淀析出，變成凝膠結(jié)晶化，分子重新回到有序的狀態(tài)，此現(xiàn)象為淀粉的回生，又稱之為淀粉老化[7]。淀粉老化過程伴隨著抗性淀粉的形成，抗性淀粉能有效抵抗消化酶的消化，難以被降解[8]。

傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)儀可以在細胞分子水平檢測植物性食品和飼料的分子結(jié)構(gòu)，通過計算樣品分子圖譜的峰面積和峰高度，來比較分子結(jié)構(gòu)差異[9]。FTIR屬分子振動光譜，大多數(shù)是處于基態(tài)的分子振動躍遷而產(chǎn)生，通過不同的分子伸縮振動，顯示不同的特征吸收峰強度，試驗主要包括蛋白質(zhì)區(qū)域(酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū))、非淀粉碳水化合物區(qū)域(β-葡聚糖區(qū)域、纖維化合物區(qū)域)和總碳水化合物區(qū)域(碳水化合物Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū))[10]。紅外光譜技術(shù)通過收集光譜結(jié)構(gòu)特征信息，分析不同飼料和加工方式的分子結(jié)構(gòu)差異，從而在飼料基礎(chǔ)營養(yǎng)成分的鑒定中得到廣泛應(yīng)用[11]。

基于此，本試驗的主要目的是：1)探究玉米品種(普通玉米和高直玉米)以及淀粉老化處理的FTIR分子結(jié)構(gòu)差異；2)通過體外發(fā)酵試驗探究這2種玉米和淀粉老化的發(fā)酵參數(shù)差異(包括氣體生成、VFA產(chǎn)量和營養(yǎng)物質(zhì)降解率)；3)探究FTIR分子結(jié)構(gòu)與體外發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣品常規(guī)分析

本試驗選用的高直玉米(直鏈淀粉含量77.13%)來自海南某科技公司。試驗開始前使用微型粉碎機將玉米粉碎后過1.0 mm篩，然后進行淀粉的老化處理，按照文獻[8]的方法進行：玉米粉加適量水后60 ℃條件下加熱15 min，不斷攪拌，然后在120 ℃條件下蒸壓30 min，最后置于烘箱中65 ℃條件下烘干粉碎后過1.0 mm篩，在4 ℃環(huán)境下保存7 d，得到老化后的普通或高直玉米。獲得的普通玉米、高直玉米、普通老化玉米和高直老化玉米用于光譜分析材料及體外發(fā)酵底物。

1.1.1 常規(guī)營養(yǎng)成分含量測定

干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量的測定參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》[12]的方法進行。

1.1.2 總淀粉含量測定

總淀粉含量的具體測定方法參見雷龍等[13]，稱取0.1 g樣品于帶螺旋帽的玻璃試管中，加入0.2 mL 80%的乙醇，蓋試管蓋蝸旋30 s，將飼料打碎混勻后繼續(xù)加入2.0 mL 2.0 mol/L的氫氧化鉀(KOH)振蕩進一步破壞淀粉結(jié)構(gòu)，加入適量乙酸(1.2 mol/L)調(diào)節(jié)pH，使反應(yīng)處于弱堿條件下，加入0.3 mL耐熱α-淀粉酶溶液(100 U/mL)和0.3 mL淀粉葡萄苷酶(300 U/mL)，蝸旋均勻置于50 ℃恒溫振床30 min，淀粉充分轉(zhuǎn)化為葡萄糖后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶用乙酸緩沖液(0.01 mol/L)定容，取2 mL溶液與3 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液沸水浴反應(yīng)15 min，冷卻后，使用多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO，瑞士)測定在540 nm下的吸光度，通過繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出葡萄糖含量，之后通過以下公式得出總淀粉含量：

總淀粉含量(%)=葡萄糖含量(g/L)×

0.9×[100/樣品重(mg)]。

式中，0.9為葡萄糖轉(zhuǎn)化為淀粉的系數(shù)。

1.1.3 抗性淀粉含量測定

抗性淀粉含量按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，試劑盒由江蘇酶免實業(yè)有限公司提供。

1.2 光譜采集與分析

樣品粉碎完成后，啟動FTIR儀(Nicolet iS50，美國)，掃描波長在500～4 000 nm，掃描次數(shù)為64次，每個樣品平行掃描6次，總共24個圖譜。圖譜結(jié)果出來后利用OMNIC 7.3圖譜軟件分析普通和高直玉米以及其淀粉老化樣品的各個區(qū)間官能團的峰面積和峰高，包括蛋白質(zhì)區(qū)域(酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅱ區(qū)以及酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)的面積比、峰高比)，非淀粉碳水化合物區(qū)域(β-葡聚糖區(qū)域、纖維化合物區(qū)域)和總碳水化合物區(qū)域(碳水化合物Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū))。

1.3 體外發(fā)酵

1.3.1 試驗動物與材料

選取3只體重[(16.77±1.23) kg]相近裝有永久性瘤胃瘺管的母性成年湘東黑山羊(湖南)。試驗羊飼喂300 g稻草和200 g精料，早晚各飼喂1次，自由飲水，精料組成如下：玉米47.00%、豆粕24.00%、麥麩22.00%、食鹽0.77%、石粉2.23%和預(yù)混料4.00%。每千克預(yù)混料含800 mg銅、1 530 mg鐵、5 000 mg鋅、3 000 mg錳、460 mg硒、3 060 mg碘、740 mg鈷、840 000 IU維生素A、168 000 IU維生素D和3 360 IU維生素E，其他為載體。

本試驗使用全自動體外模擬瘤胃發(fā)酵設(shè)備，主要由發(fā)酵瓶、三通電磁閥、培養(yǎng)箱、壓力傳感器、計算機和氣象色譜儀組成[14]。培養(yǎng)箱設(shè)定振蕩頻率為50 r/min，溫度為39.5 ℃。發(fā)酵瓶通過導(dǎo)管與三通電磁閥和壓力傳感器相連。壓力傳感器與計算機相連，每分鐘測定瓶中的壓力，通過壓力與氣體體積關(guān)系計算總氣體生成量。三通電磁閥受計算機控制，當(dāng)發(fā)酵瓶中壓力大于6 kPa，電磁閥打開，氣體排出通過導(dǎo)管進入氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)，測出甲烷和氫氣產(chǎn)氣量。甲烷和氫氣產(chǎn)氣量根據(jù)發(fā)酵瓶頂部空間大小、壓力與氣體體積間轉(zhuǎn)化系數(shù)以及甲烷和氫氣含量進行計算[15]。

1.3.2 體外發(fā)酵試驗操作

體外發(fā)酵參考Menke等[16]的試驗步驟進行，晨飼前采集山羊瘤胃液，經(jīng)6層紗布過濾，濾液倒入配制好的人工瘤胃營養(yǎng)液中(體積比1∶4，人工瘤胃營養(yǎng)液配制好后放置于39.5 ℃恒溫水浴鍋中通二氧化碳2 h)，配成人工瘤胃培養(yǎng)液，待用60 mL注射器每個發(fā)酵瓶注入60 mL混合培養(yǎng)液(注射器和發(fā)酵瓶經(jīng)39.5 ℃預(yù)熱)，加樣時保證二氧化碳的持續(xù)通入。將發(fā)酵瓶放入培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵。試驗分為2個品種(普通玉米和高直玉米)，每個品種分為1個對照組(老化前)和1個試驗組(老化后)，每個組別2個平行，重復(fù)測定2次，每個平行添加粉碎后的發(fā)酵底物1.0 g。

1.3.3 樣品采集與分析

發(fā)酵24 h后，將發(fā)酵完成的樣品通過400目的尼龍布過濾取得發(fā)酵瓶固相樣品烘干，待測其營養(yǎng)物質(zhì)(干物質(zhì)、NDF、ADF和淀粉)降解率。取得發(fā)酵瓶液相參考Broderick等[17]的方法測其VFA含量。利用壓力傳感器和氣相色譜儀(Agilent 7890A，美國)測定24 h總氣體、甲烷和氫氣產(chǎn)氣量。

營養(yǎng)物質(zhì)降解率=100×[發(fā)酵前營養(yǎng)物質(zhì)

質(zhì)量(g)-發(fā)酵后營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量(g)]/

發(fā)酵前營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量(g)。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)首先使用Excel 2007進行歸納整理，之后應(yīng)用SPSS 24.0分析軟件的一般線性模型單變量分析方法分析不同品種、老化處理及其交互作用在營養(yǎng)參數(shù)、FTIR分子結(jié)構(gòu)和體外發(fā)酵參數(shù)方面的顯著性。應(yīng)用SPSS 24.0 Spearman相關(guān)系數(shù)分析體外發(fā)酵參數(shù)與樣品FTIR分子結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性。統(tǒng)計學(xué)顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 玉米品種和淀粉老化處理對其營養(yǎng)成分含量的影響

由表1可知，與普通玉米相比，高直玉米中抗性淀粉含量顯著提高(P<0.05)；淀粉老化處理顯著提高了玉米中抗性淀粉含量(P<0.05)；高直玉米中粗蛋白質(zhì)和總淀粉含量顯著低于普通玉米(P<0.05)，而NDF、ADF含量顯著高于普通玉米(P<0.05)；淀粉老化處理顯著提高了玉米中NDF、ADF和半纖維素(HCEL)含量(P<0.05)。

表1 玉米品種和淀粉老化處理對其營養(yǎng)成分含量的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 玉米品種和淀粉老化處理對其FTIR分子結(jié)構(gòu)的影響

由表2可知，玉米品種和淀粉老化處理交互作用對β-葡聚糖峰高、纖維化合物面積和峰高以及碳水化合物區(qū)Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)面積有顯著影響(P<0.05)，老化前高直玉米β-葡聚糖峰高、纖維化合物面積和峰高以及碳水化合物Ⅲ區(qū)面積顯著高于普通玉米(P<0.05)，而老化后高直玉米碳水化合物Ⅱ區(qū)面積顯著低于普通玉米(P<0.05)。與普通玉米相比，高直玉米非淀粉碳水化合物區(qū)域的β-葡聚糖面積和峰高以及纖維化合物的面積和峰高顯著高于普通玉米(P<0.05)；從淀粉老化處理結(jié)果分析，淀粉老化處理顯著降低了玉米的酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高以及β-葡聚糖面積和峰高(P<0.05)，顯著提高了酰胺Ⅰ區(qū)面積和峰高、纖維化合物面積和峰高以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)(P<0.05)。

表2 玉米品種和淀粉老化處理對其FTIR分子結(jié)構(gòu)的影響

2.3 玉米品種和淀粉老化處理對其體外發(fā)酵參數(shù)的影響

2.3.1 24 h產(chǎn)氣量

由表3可知，高直玉米體外發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)氣量和氫氣產(chǎn)氣量顯著低于普通玉米(P<0.05)，淀粉老化處理顯著降低了體外發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)氣量和氫氣產(chǎn)氣量(P<0.05)，玉米品種和淀粉老化處理兩者之間對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量無顯著交互作用(P>0.05)。

表3 玉米品種和淀粉老化處理對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量的影響

2.3.2 24 h營養(yǎng)物質(zhì)降解率

由表4可知，淀粉老化處理顯著降低了體外發(fā)酵24 h干物質(zhì)降解率(P<0.05)，但是玉米品種和淀粉老化處理并沒有顯著影響其他營養(yǎng)物質(zhì)降解率(P>0.05)。

表4 玉米品種和淀粉老化處理對體外發(fā)酵24 h營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

2.3.3 24 h VFA含量

由表5可知，玉米品種和淀粉老化處理對體外發(fā)酵24 h總VFA含量和丁酸占比有顯著交互作用(P<0.05)，老化前和老化后高直玉米丁酸占比顯著低于普通玉米(P<0.05)，老化后高直玉米總VFA含量顯著低于老化前普通玉米(P<0.05)。與普通玉米相比，高直玉米丙酸占比顯著升高(P<0.05)，而丁酸占比顯著降低(P<0.05)；淀粉老化處理顯著降低了總VFA含量(P<0.05)，其中，顯著降低了丙酸和丁酸占比(P<0.05)，而顯著提高了乙酸占比(P<0.05)。

表5 玉米品種和淀粉老化處理對體外發(fā)酵24 h VFA含量的影響

2.4 體外發(fā)酵參數(shù)與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

2.4.1 體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

由表6可知，體外發(fā)酵24 h總產(chǎn)氣量與酰胺Ⅰ區(qū)峰高、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比和峰高比、纖維化合物峰高以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；甲烷、氫氣產(chǎn)氣量與酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比和峰高比呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；甲烷產(chǎn)氣量與β-葡聚糖面積、纖維化合物面積和碳水化合物Ⅲ區(qū)峰高呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；氫氣產(chǎn)氣量與酰胺Ⅱ區(qū)峰高呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比和峰高比、纖維化合物峰高以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

表6 體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量與FTIR分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

2.4.2 體外發(fā)酵24 h營養(yǎng)物質(zhì)降解率與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

由表7可知，體外發(fā)酵24 h干物質(zhì)降解率與酰胺Ⅱ區(qū)峰高、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)峰高比、纖維化合物峰高、碳水化合物Ⅰ區(qū)面積以及碳水化合物Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)峰高呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；NDF降解率與酰胺Ⅰ區(qū)峰高、碳水化合物Ⅱ區(qū)面積呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

表7 體外發(fā)酵24 h營養(yǎng)物質(zhì)降解率與FTIR結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

續(xù)表7項目 Items干物質(zhì)降解率 DM degradation rate中性洗滌纖維降解率 NDF degradation rate酸性洗滌纖維降解率 ADF degradation rate淀粉降解率 Starch degradation rate酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比 Area ratio of amide Ⅰ to amide Ⅱ-0.262-0.1770.006-0.329酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)峰高比 Height ratio of amide Ⅰ to amide Ⅱ-0.745**0.155-0.182-0.412非淀粉碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu) Non-starchy carbohydrate domain structureβ-葡聚糖面積 β-glucan area-0.140-0.1630.308-0.215β-葡聚糖峰高 β-glucan peak height-0.105-0.0600.303-0.018纖維化合物面積 Cellulosic compound area-0.1090.1000.408-0.094纖維化合物峰高 Cellulosic compound peak height-0.585*0.370-0.079-0.113總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu) Total carbohydrate domain structure總碳水化合物面積 Total carbohydrate area-0.4850.353-0.152-0.015碳水化合物Ⅰ區(qū)面積 Carbohydrate Ⅰ area-0.534*0.395-0.174-0.021碳水化合物Ⅱ區(qū)面積 Carbohydrate Ⅱ area-0.3790.557*-0.2760.206碳水化合物Ⅲ區(qū)面積 Carbohydrate Ⅲ area-0.3880.210-0.065-0.085碳水化合物Ⅰ區(qū)峰高 Carbohydrate Ⅰ peak height-0.521*0.371-0.240-0.054碳水化合物Ⅱ區(qū)峰高 Carbohydrate Ⅱ peak height-0.574*0.411-0.315-0.052碳水化合物Ⅲ區(qū)峰高 Carbohydrate Ⅲ peak height-0.4890.174-0.188-0.150

2.4.3 體外發(fā)酵24 h VFA含量與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

由表8可知，乙酸占比與酰胺Ⅰ區(qū)峰高、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)峰高比、纖維化合物峰高以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與β-葡聚糖面積和峰高呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；總VFA含量與酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與酰胺Ⅰ區(qū)峰高、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比和峰高比、纖維化合物峰高以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

3 討 論

高直玉米作為一種新興玉米品種，用途廣泛，涉及食品加工、醫(yī)療保健、材料紡織以及環(huán)境保護等多個領(lǐng)域，在反芻動物上的研究較少。在反芻動物中，淀粉主要在瘤胃微生物發(fā)酵作用下產(chǎn)生VFA被機體吸收，而過瘤胃后未降解的大部分淀粉在小腸α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶作用下分解為葡萄糖被機體吸收利用，另外還有一小部分淀粉會穿過小腸到達大腸，同樣經(jīng)過微生物發(fā)酵作用產(chǎn)生VFA再被機體吸收[18-19]。本試驗從營養(yǎng)成分、FTIR分子結(jié)構(gòu)、體外發(fā)酵參數(shù)以及FTIR分子結(jié)構(gòu)與體外發(fā)酵參數(shù)的相關(guān)性層面評估高直玉米與普通玉米及其淀粉老化處理引起的玉米分子結(jié)構(gòu)差異以及在反芻動物瘤胃中的降解能力。

表8 體外發(fā)酵24 h VFA含量與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

3.1 玉米品種和淀粉老化處理對其營養(yǎng)成分和FTIR分子結(jié)構(gòu)的影響

在玉米的營養(yǎng)成分分析中，常規(guī)營養(yǎng)組分測定可用于快速有效判斷飼料品質(zhì)優(yōu)劣[9]。試驗結(jié)果顯示，高直玉米的粗蛋白質(zhì)和淀粉水平顯著低于普通玉米，高直玉米的培育最大的問題是隨著直鏈淀粉的增加總淀粉含量下降以及可能伴隨其他營養(yǎng)物質(zhì)的下調(diào)，目前科學(xué)家們對于改良淀粉品質(zhì)或創(chuàng)造新型淀粉的研究仍在探索中[20]。老化處理沒有改變其粗蛋白質(zhì)和淀粉含量，而提高了其抗性淀粉、NDF和ADF的含量，并且在紅外光譜分析中老化后蛋白質(zhì)和碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這說明淀粉的老化主要改變了其分子結(jié)構(gòu)，并伴隨著抗性淀粉的增加，而沒有改變除了纖維以外的營養(yǎng)物質(zhì)水平，這可能是由于淀粉糊化后回生使淀粉結(jié)晶化，阻礙了可溶于中性洗滌劑和酸性洗滌劑物質(zhì)的溶解，從而提高了NDF和ADF含量[7]。在其他體外發(fā)酵試驗研究中發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉相比于普通淀粉的降解率并沒有下降[21]，這表明抗性淀粉雖然難以被腸道消化酶降解，但是在瘤胃中微生物的發(fā)酵速度并沒有變慢。相反的是，本試驗結(jié)果中含有更多抗性淀粉的高直玉米體外發(fā)酵總VFA含量、總產(chǎn)氣量都顯著低于普通玉米，而淀粉老化處理也有相似的結(jié)果，這可能主要由其中NDF、ADF含量所決定，這些纖維不適合微生物附著生長，不利于其發(fā)酵，而富含碳水化合物，纖維含量少的普通玉米更容易被微生物所利用，發(fā)酵更快，能產(chǎn)生更多的VFA以及甲烷等氣體[22]。

飼料常規(guī)營養(yǎng)成分的測定只考慮了總的化學(xué)營養(yǎng)成分，而沒有考慮其內(nèi)在分子結(jié)構(gòu)變化，飼料的營養(yǎng)價值不僅受到其總化學(xué)成分影響，其內(nèi)在分子結(jié)構(gòu)也起著很大作用[23]。每個不同品種甚至不同部位都有其獨特的分子結(jié)構(gòu)特征，因此都有其獨特的紅外光譜。酰胺Ⅰ區(qū)(波數(shù)范圍1 579～1 760 cm-1)和酰胺Ⅱ區(qū)(波數(shù)范圍1 491～1 579 cm-1)是蛋白質(zhì)紅外吸收光譜中2個主要功能波段，酰胺Ⅰ區(qū)主要對與肽鍵相關(guān)的由80%的C=O和20%的C—N伸縮振動組成，酰胺Ⅱ區(qū)主要由60%的N—H彎曲振動和40%的C—N伸縮振動組成，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征主要由酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)決定[24-25]。波數(shù)范圍951～1 186 cm-1為淀粉特征峰區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)包含C—O、C—C、C—H的伸縮振動和C—OH的彎曲振動，非淀粉多糖區(qū)域主要由β-葡聚糖區(qū)域(1 387～1 442 cm-1)和纖維化合物區(qū)域(1 282～1 217 cm-1)組成，根據(jù)不同波段的吸收峰高度和面積變化，可推測臨近基團或化學(xué)鍵的類型，進而確定蛋白質(zhì)、非淀粉碳水化合物和總碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)特征信息[24-26]。環(huán)境中的任何溫度變化都會影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的非共價相互作用(氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水作用力)，其中氫鍵影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，疏水作用力影響三級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變[24]。這可能是導(dǎo)致本試驗結(jié)果發(fā)生的主要原因：淀粉老化處理提高了酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)的面積和峰高比，并且改變了其他碳水化合物區(qū)域的吸收強度。β-葡聚糖和纖維化合物水平與細胞壁的形成有關(guān)，在玉米細胞壁中，較高的β-葡聚糖和纖維素水平能提高細胞壁的厚度，從而抵抗消化酶的分解[27]，在本試驗中表現(xiàn)為高直玉米β-葡聚糖和纖維化合物的紅外吸收光譜顯著高于普通玉米。McAllister等[28]認為，淀粉顆粒周圍的蛋白質(zhì)基質(zhì)是谷物瘤胃淀粉消化率差異的主要因素，瘤胃微生物對淀粉的有效消化需要一系列纖維分解酶、蛋白水解酶和淀粉分解酶，蛋白質(zhì)和纖維碳水化合物保護淀粉顆粒免受酶攻擊的程度在不同的谷物中有所不同。淀粉和蛋白質(zhì)是玉米的主要組成成分，高直玉米和普通玉米組織中碳水化合物的光譜特征與淀粉結(jié)構(gòu)有關(guān)，但是在光譜結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)現(xiàn)高直玉米和普通玉米的總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)的差異，一個可能的原因是在總碳水化合物分子結(jié)構(gòu)方面，通過紅外光譜儀檢測到的玉米品種之間的差異不夠，紅外光譜儀可能無法檢測到碳水化合物的具體結(jié)構(gòu)差異[27]。

3.2 玉米品種和淀粉老化處理對其體外發(fā)酵參數(shù)的影響

在動物飼糧生產(chǎn)中以玉米-豆粕型飼糧為主，然而高谷物飼糧由于其易降解，在瘤胃中快速發(fā)酵，使VFA堆積，造成亞急性瘤胃酸中毒，對反芻動物健康發(fā)育具有不利影響，從而影響反芻動物的正常生長[3]。高直玉米與淀粉老化后的玉米在瘤胃中的降解可能具有相似的特性，都難以被分解，這不僅與其營養(yǎng)物質(zhì)水平有關(guān)，也與其分子結(jié)構(gòu)的差異有很大關(guān)系[7]。飼料經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后的營養(yǎng)物質(zhì)降解率、VFA生成和發(fā)酵氣體的產(chǎn)生都是衡量飼料可發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，通過體外模擬瘤胃發(fā)酵可以在一定程度上觀察到瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)降解特性，為反芻動物的實際生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。本試驗結(jié)果顯示，高直玉米體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、甲烷和氫氣產(chǎn)氣量以及總VFA含量均顯著低于普通玉米，這說明高直玉米比普通玉米更難以降解。相比于普通玉米，高直玉米丙酸占比更高，而淀粉老化處理顯著降低了丙酸占比，提高了乙酸占比，這表明高直玉米在瘤胃的發(fā)酵形式主要是丙酸型發(fā)酵，而淀粉老化后的玉米在瘤胃的發(fā)酵形式主要是乙酸型發(fā)酵。丙酸是機體糖異生的主要前體物質(zhì)，能為機體提供能量，促進動物生長[29]。所以高直玉米在一定程度上不僅能減緩瘤胃酸中毒的幾率，還可能促進動物生長發(fā)育。在反芻動物瘤胃中氣體生成過快可能導(dǎo)致反芻動物噯氣不及時，造成瘤胃脹氣，甚至可能導(dǎo)致死亡[30]，高直玉米以及淀粉老化處理可能在一定程度上能緩解這種因碳水化合物的快速發(fā)酵產(chǎn)生氣體而造成的瘤胃脹氣現(xiàn)象。玉米品種和淀粉老化處理在抗性淀粉含量、β-葡聚糖峰高、纖維化合物面積和峰高、碳水化合物Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)、Ⅲ區(qū)面積、總VFA含量以及丁酸占比都存在顯著交互作用。淀粉老化后的玉米品種之間沒有發(fā)現(xiàn)紅外光譜結(jié)構(gòu)的顯著差異，這可能是由于玉米經(jīng)過淀粉老化后，分子結(jié)構(gòu)重組使得普通玉米和高直玉米的結(jié)構(gòu)趨于相似[7]。另外，淀粉老化后高直玉米總VFA含量和丁酸占比低于普通玉米，但是老化前玉米品種在總VFA含量方面沒有顯著差異，這表明相較于普通玉米，淀粉老化可能更容易發(fā)生在高直玉米中。直鏈淀粉相比于支鏈淀粉更容易發(fā)生玉米淀粉老化[31]，這可能是由于直鏈淀粉的線性空間阻礙小，更容易回生[7]。植物來源和支鏈淀粉精細結(jié)構(gòu)、直鏈淀粉與支鏈淀粉的比率以及含水量等都會影響淀粉的回生老化，直鏈淀粉在糊化后降溫的很短的時間內(nèi)(不到1 d)就會發(fā)生老化，而支鏈淀粉分子能適應(yīng)淀粉凝膠流變，可能長時間的低溫條件下才會發(fā)生老化現(xiàn)象[7,32]。淀粉的糊化要求較低，所以淀粉老化處理相比于其他加工方式要更簡便，成本更低[5]。

3.3 體外發(fā)酵參數(shù)與FTIR分子結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析

不同品種改變了非淀粉碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)，而淀粉老化處理改變了蛋白質(zhì)、非淀粉碳水化合物以及總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)的不同會影響營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的發(fā)酵作用，改變飼料營養(yǎng)物質(zhì)的降解特性。本試驗結(jié)果顯示，酰胺Ⅰ區(qū)、酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)面積比和峰高值、纖維化合物區(qū)域以及總碳水化合物區(qū)域吸收強度與總VFA含量、總產(chǎn)氣量和氫氣產(chǎn)氣量呈負相關(guān)，而酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高與總VFA含量、總產(chǎn)氣量和氫氣產(chǎn)氣量呈正相關(guān)。光譜結(jié)構(gòu)中酰胺Ⅱ區(qū)主要由N—H和C—N振動組成，氫氣等氣體生成可能來自酰胺Ⅱ區(qū)的N—H中的H，所以酰胺Ⅱ區(qū)吸收強度越大，氫氣、甲烷以及營養(yǎng)物質(zhì)分解后VFA生成越多[20-21]。乙酸占比與β-葡聚糖吸收強度呈負相關(guān)，β-葡聚糖是植物細胞壁的重要組成部分，所以β-葡聚糖吸收強度越大，植物細胞越難以分解，乙酸生成越少；同時，乙酸占比與酰胺Ⅰ區(qū)峰高、纖維化合物峰高和總碳水化合物區(qū)域吸收呈正相關(guān)，淀粉老化可能抑制了乙酸向丁酸的轉(zhuǎn)化，使得乙酸堆積，所以淀粉老化處理的光譜吸收強度越高，乙酸占比也越大。在體外發(fā)酵試驗中，淀粉老化處理降低了干物質(zhì)降解率，因此其分子結(jié)構(gòu)的變化影響干物質(zhì)降解率，結(jié)果中表示為干物質(zhì)降解率與酰胺Ⅰ區(qū)與酰胺Ⅱ區(qū)峰高比、纖維化合物峰高、碳水化合物Ⅰ區(qū)面積以及碳水化合物Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)峰高呈顯著負相關(guān)。

總得來說，通過FTIR儀對高直玉米和普通玉米以及其淀粉老化處理樣品的測定，發(fā)現(xiàn)不同品種和淀粉老化處理的玉米紅外光譜特征存在差異，這種差異只限制于蛋白質(zhì)、非淀粉碳水化合物和總碳水化合物區(qū)域，無法更精準(zhǔn)地檢測區(qū)域內(nèi)特定化合物以及其內(nèi)在結(jié)構(gòu)聯(lián)系，也無法明確官能團數(shù)量特點。在體外發(fā)酵試驗中，高直玉米和淀粉老化處理樣品發(fā)酵速度顯著降低，其中高直玉米的發(fā)酵形式主要以丙酸型發(fā)酵為主，而淀粉老化處理主要以乙酸型發(fā)酵為主，淀粉的老化更容易發(fā)生在高直玉米中。玉米FTIR分子結(jié)構(gòu)影響其營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中的發(fā)酵特性，24 h總產(chǎn)氣量、氫氣產(chǎn)氣量、總VFA含量與總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈負相關(guān)，干物質(zhì)降解率與碳水化合物Ⅰ區(qū)面積和峰高、碳水化合物Ⅱ區(qū)峰高呈負相關(guān)，而乙酸占比與總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)，24 h總產(chǎn)氣量、氫氣產(chǎn)氣量和總VFA含量與酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高呈正相關(guān)。

4 結(jié) 論

① 高直玉米中含有更高的抗性淀粉、NDF和ADF含量，但是粗蛋白質(zhì)和淀粉含量要低于普通玉米；淀粉老化處理顯著提高了抗性淀粉、NDF、ADF和HCEL含量。

② 高直玉米非淀粉碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)面積和峰高顯著高于普通玉米；淀粉老化處理顯著降低了酰胺Ⅱ區(qū)面積和峰高，顯著提高了酰胺Ⅰ區(qū)、纖維化合物以及總碳水化合物區(qū)域面積和峰高。

③ 高直玉米體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量、總VFA含量低于普通玉米；淀粉老化處理顯著降低了24 h產(chǎn)氣量、干物質(zhì)降解率和總VFA含量。

④ 24 h總產(chǎn)氣量、氫氣產(chǎn)氣量、總VFA含量與總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈負相關(guān)，干物質(zhì)降解率與碳水化合物Ⅰ區(qū)面積和峰高、碳水化合物Ⅱ區(qū)峰高呈負相關(guān)，而乙酸占比與總碳水化合物區(qū)域結(jié)構(gòu)呈正相關(guān)，24 h總產(chǎn)氣量、氫氣產(chǎn)氣量和總VFA含量與酰胺區(qū)Ⅱ面積和峰高呈正相關(guān)。