全集成離心式微流控農(nóng)殘檢測(cè)芯片研制

王曉東,喬奇?zhèn)?,宋志謙,李英利,李艷秋

1(常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工與制藥工程學(xué)院,江蘇 常州,213164) 2(常州市微流控芯片技術(shù)及裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 常州,213164)

離心式圓盤狀微流控芯片以離心力驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng),具有集成度高、通量大、易操作等特點(diǎn),在食品安全快速檢測(cè)[1-2]、臨床診斷[3-4]等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。但通常待測(cè)樣品的前處理需要借助額外的設(shè)備[5-6],在芯片外部完成后再將檢測(cè)液體轉(zhuǎn)移至芯片中,大大降低了檢測(cè)系統(tǒng)的集成度,因此在芯片內(nèi)部?jī)?chǔ)存微量液體試劑并完成樣本前處理是微流控分析技術(shù)目前面臨的挑戰(zhàn)之一[7-8]。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用玻璃[9]和鋁基復(fù)合薄膜[10]的液囊集成到芯片中,但玻璃液囊加工難度大、成本高,復(fù)合材料液囊的封裝及液體釋放條件要求苛刻。

基于農(nóng)藥殘留對(duì)健康的危害性[11-12]和農(nóng)殘速測(cè)的緊迫性[13-14],微流控技術(shù)用于農(nóng)殘快速檢測(cè)已見報(bào)道[15],但樣品的前處理仍需在農(nóng)殘?zhí)崛x上完成,不利于檢測(cè)效率的提高。本研究采用透明聚乙烯(polyethylene,PE)膜制備微型液囊儲(chǔ)存液體試劑,并將其集成于芯片中,與預(yù)先固化反應(yīng)試劑構(gòu)成全集成微流控圓盤芯片,用于農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。通過拇指按壓擠破液囊的方式完成液體在線釋放,實(shí)現(xiàn)從樣品提取到最終檢測(cè)的全集成和自動(dòng)化操作,省去常規(guī)方法中必需的農(nóng)殘?zhí)崛x；結(jié)合實(shí)驗(yàn)室自制的便攜式離心檢測(cè)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)果蔬類產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的快速、大規(guī)模篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)板材、雙面膠、PE、力致黏性膜,杭州九洋生物科技有限公司；乙酰膽堿酯酶(500 U/mg)、碘化硫代乙酰膽堿、5,5-二硫二硝基苯甲酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；克百威標(biāo)準(zhǔn)品,上海市農(nóng)藥研究所；pH 8.0磷酸鹽緩沖溶液,中國計(jì)量科學(xué)院；小白菜,當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Spirit LCD-30TI型激光精密切割機(jī),廣州里程科技發(fā)展有限公司；CoolSafe55型冷凍干燥機(jī),香港藥化科技公司；FR-400封口機(jī),上海易諾包裝材料有限公司；GL124型分析天平,德國賽多利斯；Master-S15超純水系統(tǒng),上海和泰儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 芯片的設(shè)計(jì)與制備

離心式微流控芯片由3層組成,直徑80 mm,底層為厚度0.3 mm的空白PMMA基片,中間層為厚度3 mm的PMMA通道層,蓋板層為厚度0.1 mm的力致黏性膜。如圖1所示,每個(gè)單元包含：液囊池、樣品提取池、酶抑制反應(yīng)池、顯色檢測(cè)池、廢液池、通氣孔及連接通道。其中液囊池存放裝有農(nóng)殘?zhí)崛∫旱囊耗?樣品提取池用于樣品振蕩洗脫,酶抑制反應(yīng)池和顯色檢測(cè)池通過冷凍干燥方法分別固定膽堿酯酶和檢測(cè)試劑[16]。制備芯片時(shí)將芯片結(jié)構(gòu)圖輸入激光切割機(jī)軟件,選擇合適的激光功率和掃描速度,獲得帶有各種結(jié)構(gòu)單元PMMA圓形盤片；雙面膠黏合空白底板和中間層,力致黏性膜作為蓋板層將其密封制得最終芯片。

a-立體結(jié)構(gòu)；b-平面圖1-液囊池；2-樣品提取池；3-酶抑制反應(yīng)池；4-檢測(cè)池；5-廢液池和通氣孔；6-液囊

1.3.2 檢測(cè)流程及原理

稱取0.2 g樣本碎片放入樣品提取池,力致黏性膜封裝后將芯片放置在實(shí)驗(yàn)室搭建的檢測(cè)儀中,拇指擠壓液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊發(fā)生形變并破碎,完成液體釋放；檢測(cè)儀按設(shè)定轉(zhuǎn)速帶動(dòng)芯片旋轉(zhuǎn),離心力驅(qū)動(dòng)提取液進(jìn)入樣品池與待測(cè)樣品混合后,芯片順時(shí)針、逆時(shí)針周期性往復(fù)旋轉(zhuǎn),以達(dá)到振蕩提取菜葉表面殘留農(nóng)藥的目的；之后芯片順時(shí)針離心驅(qū)動(dòng)提取液依次進(jìn)入酶抑制反應(yīng)池和檢測(cè)池,進(jìn)行混合、生化和顯色反應(yīng),最后測(cè)量溶液在波長410 nm處吸光度變化值并計(jì)算農(nóng)殘抑制率[17-18]。芯片上液體的流動(dòng)狀態(tài)如圖2所示。

a-存儲(chǔ)；b-提?。籧-反應(yīng)；d-檢測(cè)

1.3.3 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建

實(shí)驗(yàn)室搭建了臺(tái)桌面型檢測(cè)系統(tǒng),包含控溫、離心、光學(xué)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理模塊,該系統(tǒng)可以保持芯片所處的腔室恒溫37 ℃,離心轉(zhuǎn)速100～5 000 r/min,檢測(cè)芯片反應(yīng)池內(nèi)液體的吸光度值并計(jì)算農(nóng)殘抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

芯片主要由四級(jí)串聯(lián)反應(yīng)池構(gòu)成,從圓心開始依次為液囊池、樣品提取池、酶抑制反應(yīng)池、顯色檢測(cè)池。液囊池存放體積1 mL的農(nóng)殘?zhí)崛∫耗?；樣品提取池容積為3 mL,較大的體積利于固、液樣品在其中振蕩混合提?。幻敢种品磻?yīng)池、檢測(cè)池體積均為1 mL。液囊池與提取池通過短粗通道相連,便于液體在外力的作用下快速流入；剩余反應(yīng)池的連接為細(xì)長通道,液體的流動(dòng)通過離心力驅(qū)動(dòng)完成,其中流體從提取池至酶抑制反應(yīng)池離心轉(zhuǎn)速為1 500 r/min,從酶抑制反應(yīng)池至檢測(cè)池轉(zhuǎn)速為2 000 r/min；廢液池200 μL,收集過量的反應(yīng)液；排氣孔保持盤片內(nèi)部壓力與外界大氣壓一致。

2.2 液體試劑的集成與釋放

以厚度0.02 mm的PE膜為液囊材料,首先熱壓制成一端開口的PE塑料袋,精密注入1 mL的磷酸緩沖液,熱壓密封制成液囊,放入微流控芯片液囊池中。如圖3所示,使用時(shí)拇指擠壓液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊發(fā)生形變并破碎,完成液體釋放,撤去外力后力致黏性薄膜迅速恢復(fù)原形貌,該薄膜在液體釋放時(shí)保證提取池的密封性,避免可能的外界接觸污染。PE液囊長期存儲(chǔ)實(shí)驗(yàn)(25 ℃,60 d)顯示它的質(zhì)量變化小于1%。結(jié)果表明采用本工作方法可實(shí)現(xiàn)液體試劑在微流控芯片中的簡(jiǎn)易、長期封裝存儲(chǔ)。

a-液體試劑的集成；b-液體試劑的釋放

2.3 芯片中酶抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)考察

常規(guī)速測(cè)法中酶抑制反應(yīng)需在37 ℃恒溫反應(yīng)10～15 min。本研究將0.1 mg/L克百威標(biāo)準(zhǔn)液加入芯片中,37 ℃恒溫條件下考察芯片中酶抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué),結(jié)果顯示反應(yīng)時(shí)間超過60 s后農(nóng)殘抑制率不再變化,因此取1 min作為芯片中酶抑制反應(yīng)時(shí)間。

2.4 農(nóng)藥標(biāo)樣檢測(cè)及檢出限

配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 mg/L的克百威標(biāo)準(zhǔn)液,按1.3.2方法檢測(cè),結(jié)果見圖4。Origin軟件擬合抑制率-農(nóng)藥濃度曲線,得出本方法對(duì)克百威農(nóng)藥的檢出限為0.01 mg/L,低于GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)要求的檢出限0.05 mg/L。

圖4 微流控芯片中克百威農(nóng)藥標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果

2.5 芯片中樣品提取時(shí)間的確定

針對(duì)微反應(yīng)體系,將噴灑農(nóng)藥的小白菜樣品0.2 g 放入樣品提取池,考察農(nóng)殘抑制率隨樣品提取時(shí)間的變化趨勢(shì)。如圖5所示,抑制率隨提取時(shí)間的延長而增大,2 min后達(dá)到69%并保持穩(wěn)定,本研究采用2 min作為芯片中樣品提取時(shí)間,與常規(guī)速測(cè)方法的提取時(shí)間保持一致。

圖5 芯片中農(nóng)殘抑制率隨樣品提取時(shí)間的變化

2.6 加標(biāo)回收率測(cè)定

表1列出了加標(biāo)回收結(jié)果,回收率在95.0%～101.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～4.9%,表明該方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好。

表1 加標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.7 方法對(duì)比

本研究提出的全集成離心式微流控農(nóng)殘檢測(cè)芯片,相較傳統(tǒng)速測(cè)方法,首次將樣品前處理單元集成在芯片上,省去常規(guī)方法中的農(nóng)殘?zhí)崛x,簡(jiǎn)化了人工操作步驟,提高檢測(cè)效率,在芯片上實(shí)現(xiàn)從樣品提取至檢測(cè)的自動(dòng)化操作,檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性滿足大批量樣品篩查需求。

3 結(jié)論與討論

基于微流控技術(shù)和酶抑制法的原理,本工作研制了一種全集成離心式圓盤微流控農(nóng)殘檢測(cè)芯片,將液體生化試劑集成于離心式農(nóng)殘速測(cè)芯片中,以氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威為對(duì)象,其檢出限達(dá)到0.01 mg/L,符合現(xiàn)有國標(biāo)速測(cè)儀檢出限標(biāo)準(zhǔn)。該檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于：(1)芯片集成前處理單元,提高了檢測(cè)效率；(2)無需樣品前處理設(shè)備,降低了檢測(cè)系統(tǒng)成本；(3)采用PE膜加工微型液囊,成本極低,適于大批量生產(chǎn)；(4)在微流控芯片中實(shí)現(xiàn)了從樣品提取到檢測(cè)的全自動(dòng)流程,同時(shí)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性滿足國標(biāo)需求。