巴氏殺菌、微濾及紫外處理對羊乳中菌落數(shù)與活性蛋白的影響

徐姝,劉大松,李志賓,張文錦,趙磊,周鵬

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

山羊乳組成較牛乳更接近人乳,同時具有低致敏性和易消化吸收的特點(diǎn)[1-2],市場占比逐年擴(kuò)大。羊乳除含有蛋白、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)等基本營養(yǎng)組分外,還含有免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)、乳鐵蛋白(lactoferrin,Lf)、乳過氧化物酶(lactoperoxidase,LPO)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)等生物活性物質(zhì),這些生物活性蛋白和酶通常具有熱敏性[3-4]。

在生鮮乳的加工過程中,通常會采用熱殺菌處理,如高溫短時殺菌(high temperature short time,HTST),以確保產(chǎn)品的微生物安全性,然而這往往會導(dǎo)致乳中生物活性物質(zhì)的失活。XIONG等[5]研究了不同溫度處理牛乳30 min對乳清抗菌組分和抗菌活性的影響,發(fā)現(xiàn)在溫度≥75 ℃時抗菌組分和活性都顯著降低。近年來,非熱或低熱處理技術(shù)在生鮮乳除菌中的應(yīng)用日益受到關(guān)注。微濾(micro filter,MF)是一種基于組分尺寸差異而實(shí)現(xiàn)分離的非熱加工技術(shù),可用于脫脂乳中細(xì)菌和體細(xì)胞的選擇性去除,同時保持乳的營養(yǎng)和生物活性成分[6]。ELWELL等[7]在50 ℃下采用1.4 μm孔徑陶瓷膜MF處理脫脂牛乳,發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)降低了3.8 lg CFU/mL,高于HTST處理所降低的1.7 lg CFU/mL。WANG等[8]在6 ℃下采用1.4 μm孔徑陶瓷膜MF處理脫脂牛乳,發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞數(shù)降低了2.8 lg CFU/mL,HTST處理則不能使體細(xì)胞數(shù)減少。紫外輻射(UV-C)是另一種新興的非熱除菌技術(shù),可誘導(dǎo)嘧啶二聚體的形成,阻斷DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯,阻止微生物增殖。UV-C處理在飲用水、蛋液、果蔬、海鮮等食品的除菌中表現(xiàn)出較好的效果[9-10]。關(guān)于生鮮乳MF和UV-C處理的前期研究,主要是針對牛乳,且主要集中在乳中微生物和體細(xì)胞去除方面,較少關(guān)注活性組分的保留。

本實(shí)驗(yàn)以莎能奶山羊脫脂乳為原料,分別進(jìn)行HTST、1.4和0.8 μm孔徑 MF、UV-C處理,比較4種不同處理方法對乳中微生物和體細(xì)胞去除、活性蛋白和天然乳清蛋白保留及蛋白氧化的影響,并比較了2種不同孔徑膜的分離效率。UV-C在乳中的穿透力較弱,本實(shí)驗(yàn)采用繞流式UV-C裝置,使羊乳在管路中因離心力而產(chǎn)生二次渦流,增強(qiáng)混合程度和殺菌效率。本實(shí)驗(yàn)旨在為高活性羊乳及其制品的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山羊乳,杭州云泉約牧業(yè)有限公司；微生物測試片6406、6416,美國3M PertrifilmTM公司；Amplex Red試劑(AR)、辣根過氧化物酶、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)、鄰甲苯甲醛(2,4-dinitrophenylhydrazone,DNPH)、溶壁微球菌,美國Sigma公司；羊乳IgG、IgA、IgM ELISA試劑盒,美國Alpha Diagnostic公司；羊乳Lf ELISA試劑盒,美國MyBioSource公司。

1.2 主要儀器

GH036T5L/4*紫外燈,德國Heraeus公司；CLARA 20LFCO乳脂分離器,瑞典Alfa Laval公司；GCM-C-03陶瓷膜分離設(shè)備,國初(廈門)科技有限公司；1.4和0.8 μm孔徑陶瓷膜,法國Tami公司；PT-20C-R 管板式組合式超高溫殺菌機(jī),日本Powerpoint International 公司；Waters Alliance e2695高效液相色譜儀,美國Waters公司；C8色譜柱,美國Agilent公司；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀、LYNX4000離心機(jī),美國Thermo Fisher 公司；Cytation5 熒光酶標(biāo)儀,美國 BioTek 儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計,日本Shimadzu公司；SKD-200凱氏定氮儀,上海沛歐分析儀器有限公司；FossomaticTM7 DC體細(xì)胞分析儀,丹麥Fossomatic公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂羊乳的除菌處理

羊乳經(jīng)乳脂分離器去除奶油,收集生鮮脫脂羊乳。使用管板式組合式超高溫殺菌機(jī)進(jìn)行HTST處理,殺菌條件為72 ℃、15 s；使用 1.4、0.8 μm孔徑陶瓷膜進(jìn)行MF處理,溫度50 ℃,跨膜壓力差75 kPa,膜通量根據(jù)透過液體積、膜面積和處理時間計算；使用繞流式UV-C裝置(圖1)進(jìn)行除菌,石英套管外徑23 mm,全氟烷氧基管長度6 m、內(nèi)徑1.5 mm,流速150 mL/min,UV-C處理時間16.7 s。

圖1 繞流式UV-C裝置示意圖

1.3.2 微生物和體細(xì)胞數(shù)的測定

菌落總數(shù)、大腸桿菌數(shù)測定：取1 mL稀釋樣,滴加在3M測試片中央,壓緊上層薄膜,靜置1 min,待培養(yǎng)基凝固后,置于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取菌落數(shù)為25～250的測試片計數(shù)。

芽孢數(shù)測定：參考孔凡丕的方法[11]。取處理后的脫脂羊乳于無菌離心管中,水浴鍋內(nèi)80 ℃保持10 min,冰水浴冷卻,稀釋后按照菌落總數(shù)測定方法進(jìn)行測定。

體細(xì)胞數(shù)檢測：取處理后的脫脂羊乳,采用體細(xì)胞分析儀進(jìn)行測定。

1.3.3 活性蛋白含量的測定

活性蛋白IgG、IgA、IgM、Lf含量的測定：根據(jù)ELISA試劑盒所提供的方法進(jìn)行測定,采用稀釋2 000～5 000倍的脫脂羊乳測定IgG、IgA、IgM含量,采用脫脂羊乳直接測定Lf含量。

1.3.4 抗菌酶酶活力的測定

LPO酶活力的測定參考ZOU等[12]的方法。取30 μL稀釋100倍的脫脂羊乳與195 μL反應(yīng)試劑(0.23 mmol/L AR、4.6 mmol/L硫氰酸鉀)混合,取50 μL混合液加入96孔板中,37 ℃保持20 min,用酶標(biāo)儀自動加樣系統(tǒng)加50 μL 110 μmol/L H2O2溶液,空白用50 μL去離子水代替H2O2溶液,在激發(fā)/發(fā)射波長544/590 nm處每隔10 s測定熒光強(qiáng)度。用不同濃度梯度的H2O2溶液(0～8 μmol/L)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

XO酶活力的測定參考ZOU等[13]的方法。取50 μL 稀釋100倍的脫脂羊乳加入96孔板中,加入50 μL反應(yīng)試劑(0.1 mmol/L AR、0.4 mmol/L次黃嘌呤、0.8 U/mL辣根過氧化物酶)混合,用酶標(biāo)儀在激發(fā)/發(fā)射波長544/590 nm處每隔10 s測定熒光強(qiáng)度。用不同濃度梯度的H2O2溶液(0～8 μmol/L)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 天然乳清蛋白含量的測定

乳清蛋白含量通過考馬斯亮藍(lán)法測定[14]。取脫脂羊乳樣品50 mL,用鹽酸調(diào)pH至4.3,靜置1 h后,在25 ℃、8 000×g下離心15 min,收集上清液。用超純水將上清液稀釋400倍后測定,以牛血清白蛋白作為標(biāo)品。

1.3.6 蛋白羰基和總巰基含量的測定

參考ELLMAN等[15]的方法測定蛋白羰基含量。取0.35 mL的脫脂羊乳加入0.5 mL 10 mmol/L DNPH溶液,室溫靜置反應(yīng)1 h,加入1 mL 20% TCA溶液,混勻10 000×g離心5 min,收集沉淀并用乙酸乙酯-乙醇(1∶1,體積比)洗滌3次,加入1.5 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液,在37 ℃保持至沉淀全部溶解,在370 nm波長處測定吸光度,羰基含量單位為nmol/(L·mg Pro),采用分子消光系數(shù)為22 000 L/(mol·cm),蛋白質(zhì)濃度由凱氏定氮法測得。

參考ELWELL等[7,15]的方法測定總巰基含量。取0.5 mL脫脂羊乳與4 mL反應(yīng)試劑(80 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、100 mmol/L甘氨酸、5 mmol/L EDTA、8 mol/L尿素)混合,加入0.5 mL 10 mmol/L DTNB試劑反應(yīng)30 min,在412 nm波長處測定吸光度。巰基含量單位為nmol/(L·mg Pro),分子消光系數(shù)為13 600 L/(mol·cm)。

1.3.7 總蛋白、酪蛋白和乳清蛋白含量的測定

脫脂羊乳中總蛋白含量采用凱氏定氮方法[16]進(jìn)行測定。取5 mL脫脂羊乳于消化管中,加入0.2 g CuSO4、4 g K2SO4和20 mL濃硫酸,將消化管放入消化爐中消化至溶液澄清透明,放入定氮儀中加70 mL 40% NaOH溶液后開始蒸餾,接收瓶里加入30 mL 4%硼酸,滴加2～3滴混合指示劑,蒸餾時間為6 min,用0.1 mmol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,計算總氮含量。另取10 mL脫脂羊乳,加入40 mL三氯乙酸,濾紙過濾,取25 mL 濾液按上述條件消化、蒸餾、滴定,計算非蛋白氮含量?？偟鞍缀?(總氮含量-非蛋白氮含量)×6.38。

脫脂羊乳中酪蛋白和乳清蛋白含量采用反相高效液相色譜法[17]測定。取0.9 mL脫脂羊乳與0.9 mL緩沖液1(0.1 mol/L Bis-Tris丙烷、pH 7、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT,1.3% 檸檬酸鈉)混合,在室溫下振蕩1 h后10 000×g離心5 min,取0.45 mL上清液與1.35 mL緩沖液2[V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=100∶900∶1,6 mol/L Urea]混合,過0.45 μm有機(jī)膜。采用C8色譜柱,上樣量40 μL,梯度洗脫所用的流動相A和B中V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)分別為 100∶900∶1和900∶100∶0.7,流速 0.8 mL/min,檢測波長為220 nm。采用 Empower 軟件對各個色譜峰的面積進(jìn)行積分。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,用One-Way ANOVA方法進(jìn)行方差分析,采用Duncan’s test比較均值之間的差異,P<0.05時表明結(jié)果間存在顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同除菌方式對脫脂羊乳中微生物和體細(xì)胞去除的影響

國標(biāo)GB 19645—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 巴氏殺菌乳》[18]規(guī)定:生乳菌落總數(shù)不得超過6.3 lg CFU/mL,巴氏殺菌乳菌落總數(shù)不得超過4.7 lg CFU/mL、大腸菌群數(shù)不得超過0.7 lg CFU/mL。此外,芽孢桿菌在自然界中普遍存在,能形成耐受HTST處理的芽孢,難以去除[19]。體細(xì)胞數(shù)與奶牛乳房炎癥相關(guān),是反應(yīng)牛乳品質(zhì)的一個重要指標(biāo),較高的體細(xì)胞數(shù)會導(dǎo)致蛋白和脂肪水解增加,產(chǎn)生異味,縮短乳制品的保質(zhì)期[8,20-21]。我國國標(biāo)沒有限定生乳中體細(xì)胞的含量,但歐盟規(guī)定生乳中體細(xì)胞數(shù)不得超過5.6 lg CFU/mL,美國農(nóng)業(yè)部規(guī)定不得超過5.9 lg CFU/mL[21]。

表1顯示了不同除菌方式對脫脂羊乳中菌落總數(shù)、大腸桿菌數(shù)、芽孢數(shù)和體細(xì)胞數(shù)的影響。生鮮脫脂羊乳的菌落總數(shù)低于國標(biāo)對生乳要求的上限。經(jīng)HTST處理,菌落總數(shù)降低至3.5 lg CFU/mL,即降低了2.0 lg,菌落總數(shù)低于國標(biāo)對巴氏殺菌乳要求的上限。菌落總數(shù)在經(jīng)MF-1.4、MF-0.8和UV-C處理后均達(dá)到了與HTST處理相同的降低率,其中UV-C的降低率在統(tǒng)計上略低于MF-1.4和MF-0.8。大腸菌群數(shù)在經(jīng)HTST、MF-1.4和MF-0.8處理后降低到未檢出水平,在經(jīng)UV-C處理后則降低1.6 lg,殘留的大腸菌群數(shù)低于國標(biāo)對巴氏殺菌乳要求的上限。芽孢數(shù)在經(jīng)HTST和UV-C處理后僅降低了0.3和0.2 lg,在經(jīng)MF-1.4和MF-0.8處理后則降低到未檢出水平。體細(xì)胞數(shù)在經(jīng)HTST和UV-C處理后無顯著降低,在經(jīng)MF-1.4和MF-0.8處理后則降低到未檢出水平。細(xì)菌及其芽孢粒徑在0.2～6 μm,體細(xì)胞粒徑在6～15 μm,均可通過0.8～1.4 μm孔徑的微濾處理有效地被去除[11,22]。

表1 不同除菌方式處理脫脂羊乳的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、芽孢數(shù)和體細(xì)胞數(shù)(lg CFU/mL)

2.2 不同除菌方式對脫脂羊乳中活性蛋白保留的影響

IgG、IgA、IgM和Lf是乳中重要的活性蛋白,具有免疫調(diào)節(jié)、過敏保護(hù)、抑菌等生理功能,但也具有熱敏性[23]。LIU等[24]報道牛乳經(jīng)60 ℃處理30 min,活性Lf含量降低約40%。圖2顯示了不同除菌方式對脫脂羊乳中活性IgG、IgA、IgM和Lf保留率的影響。HTST處理使活性Lf、IgA、IgG、IgM的保留率降低至86%、68%、51%、28%,說明四者的熱穩(wěn)定性依次遞減。活性Lf、IgA、IgG、IgM的保留率在經(jīng)MF-1.4處理后達(dá)90%、88%、87%、94%,在經(jīng)MF-0.8處理后則達(dá)82%、82%、80%、88%,MF-1.4對Lf和IgG的保留率在統(tǒng)計上高于MF-0.8,對IgA和IgM的保留率在數(shù)值上高于MF-0.8,但無顯著差異,說明較大的膜孔徑更有利于活性蛋白的透過。MF-1.4對4種活性蛋白的保留率都高于HTST,MF-0.8對IgG、IgM的保留率都高于HTST,對IgA、Lf的保留率與HTST無顯著差異。UV-C處理使活性Lf、IgA、IgG、IgM的保留率達(dá)94%、91%、75%、97%,均高于HTST。UV-C對Lf、IgA、IgM的保留率與MF-1.4無顯著差異,對IgG的保留率低于MF-1.4。UV-C對IgG、IgA、IgM的保留率與MF-0.8無顯著差異,對Lf的保留率高于MF-0.8。

圖2 不同除菌方式處理脫脂羊乳的活性IgG、IgA、IgM和Lf保留率

2.3 不同除菌方式對脫脂羊乳中抗菌酶酶活力保留的影響

LPO和XO是乳中重要的抗菌酶,兩者具有協(xié)同增效作用[13]。LPO酶活力還常用于表征乳所受熱處理的強(qiáng)度[12]。乳中XO主要結(jié)合在乳脂肪球膜[13]上,生鮮羊乳經(jīng)脫脂后,XO酶活力由9.0 U/L降低至3.8 U/L。圖3顯示了不同除菌方式對脫脂羊乳中LPO和XO酶活力保留率的影響。HTST處理使LPO和XO酶活力的保留率降低至47%和49%。LORENZEN等[25]報道了牛乳中LPO的酶活力在經(jīng)HTST處理后保留率降至40%～50%,與本文研究結(jié)果相一致。LPO和XO酶活力的保留率在經(jīng)MF-1.4處理后達(dá)97%和72%,在經(jīng)MF-0.8處理后達(dá)85%和70%,在經(jīng)UV-C處理后達(dá)93%和86%。MF-1.4、MF-0.8、UV-C對2種抗菌酶酶活力的保留率都高于HTST。對LPO酶活力的保留率,MF-1.4與UV-C無顯著差異,兩者都高于MF-0.8。MF-1.4、MF-0.8、UV-C對XO酶活力的保留率相互間無顯著差異。

a-LPO酶活力保留率;b-XO酶活力保留率

2.4 不同除菌方式對脫脂羊乳中天然乳清蛋白保留率的影響

乳中天然的乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白以及一些低豐度的活性蛋白和抗菌酶類等[26]。圖4顯示了不同除菌方式對脫脂羊乳中天然乳清蛋白保留率的影響。經(jīng)HTST處理,天然乳清蛋白的保留率降低至84%,這與活性蛋白和抗菌酶的保留率相對應(yīng)。LIU等[27]報道了牛乳中的天然乳清蛋白在經(jīng)HTST處理后保留率達(dá)92%,高于羊乳中天然乳清蛋白的保留率,這可能是因?yàn)檠蛉槿榍宓鞍椎臒岱€(wěn)定性較低。在熱處理過程中,部分天然乳清蛋白變性,并暴露分子內(nèi)部的疏水區(qū)域和巰基基團(tuán),產(chǎn)生分子間自聚集或者與酪蛋白形成復(fù)合物,在酸性條件下經(jīng)離心與酪蛋白產(chǎn)生共沉淀[24,28]。與生鮮脫脂羊乳相比,天然乳清蛋白的保留率在經(jīng)MF-1.4、MF-0.8、UV-C處理后無顯著降低。

圖4 不同除菌方式處理脫脂羊乳的天然乳清蛋白保留率

2.5 不同除菌方式對脫脂羊乳中蛋白氧化的影響

乳蛋白分子在加工中易發(fā)生氧化修飾,如堿性氨基酸殘基的羰基化、半胱氨酸殘基脫氫形成二硫鍵,降低蛋白質(zhì)的消化率和營養(yǎng)價值[28-30]。圖5顯示了不同除菌方式對脫脂羊乳中蛋白羰基和總巰基含量的影響。蛋白羰基含量在經(jīng)HTST處理后增加了18%,說明蛋白分子發(fā)生了熱誘導(dǎo)氧化[31]。蛋白羰基含量在經(jīng)UV-C處理后增加了19%,說明蛋白分子發(fā)生了光誘導(dǎo)氧化[31]。蛋白羰基含量在經(jīng)MF-1.4和MF-0.8處理后無顯著增加。蛋白總巰基含量在經(jīng)HTST處理后降低了7%,在經(jīng)MF-1.4、MF-0.8、UV-C處理后無顯著降低。上述結(jié)果與不同除菌方式對天然乳清蛋白保留率的影響相對應(yīng),兩者都說明微濾除菌處理對蛋白分子天然結(jié)構(gòu)的保持效果較好。

a-羰基含量；b-總巰基含量

2.6 不同膜孔徑MF處理脫脂羊乳對膜通量及蛋白透過率的影響

在膜過濾分離過程中,膜表面逐漸發(fā)生濃差極化、濾餅層沉積等現(xiàn)象,導(dǎo)致膜通量和蛋白透過率的降低[23]。圖6顯示了不同膜孔徑微濾處理脫脂羊乳對膜通量及蛋白透過率的影響。

a-膜通量;b-蛋白透過率

在整個膜過濾過程中,MF-1.4處理的膜通量均高于MF-0.8處理。對于MF-1.4處理,膜通量在最初的透過液體積1～5 L時降低了41%,隨后保持穩(wěn)定；對于MF-0.8處理,膜通量在最初的透過液體積1～7 L時降低了75%,在隨后的7～12 L時保持較低水平,降低了10%。這說明MF-1.4更適用于工業(yè)上連續(xù)式的生鮮乳除菌處理。MF-1.4處理使總蛋白完全透過,MF-0.8處理則使總蛋白的透過率降低到85%,該結(jié)果與不同膜孔徑微濾處理脫脂羊乳對膜通量的影響相對應(yīng)。酪蛋白在經(jīng)MF-1.4處理后完全透過,在經(jīng)MF-0.8處理后透過率降低到74%,乳清蛋白在經(jīng)MF-1.4和MF-0.8處理后都完全透過。這說明MF-0.8處理后總蛋白透過率的降低主要是由酪蛋白的截留所導(dǎo)致。羊乳酪蛋白主要以膠束結(jié)構(gòu)形式存在,其粒徑約為50～150 nm,乳清蛋白粒徑約為1～6 nm,因此酪蛋白更易于被小孔徑的微濾膜所截留[32]。

3 結(jié)論

HTST、1.4和0.8 μm孔徑MF、UV-C處理對脫脂羊乳中微生物和體細(xì)胞去除、活性蛋白和天然乳清蛋白保留有顯著影響。在微生物方面,總菌落經(jīng)MF-1.4、MF-0.8和UV-C處理均達(dá)到與HTST相同的去除率,大腸菌群均符合國標(biāo)巴殺乳要求；且相較于HTST、UV-C處理,MF處理能有效的截留芽孢和體細(xì)胞。在活性成分保留方面,經(jīng)MF-1.4處理后,其活性成分的保留顯著高于HTST處理,活性乳鐵蛋白、IgA、IgG、黃嘌呤氧化酶、乳過氧化物酶、IgM保留率分別為90%、88%、87%、72%、97%、94%；在乳清蛋白變性和蛋白氧化方面,HTST處理的樣品變性顯著,且HTST和UV-C處理蛋白氧化較MF處理明顯。在MF處理過程中,MF-1.4較MF-0.8處理,有更高的膜通量和蛋白透過率。上述結(jié)果為高微生物安全性、高生物活性羊乳及其制品的生產(chǎn)提供了參考。