牛優(yōu)勢(shì)卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞中生殖激素合成相關(guān)基因的篩選與分析

趙園園，吳震洋，安清明，孟金柱

(銅仁學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

雌性哺乳動(dòng)物的卵泡是生殖系統(tǒng)的重要組成部分，它包含卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞(GCs)和膜細(xì)胞(TCs)[1]。TCs位于卵泡外部，能夠接收外來(lái)信號(hào)并在細(xì)胞色素P450 17A1(CYP17A1)的作用下產(chǎn)生雄激素[2]；而GCs位于卵泡內(nèi)部，通過(guò)細(xì)胞色素P450 19A1 (CYP19A1)將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素[3]。GCs和TCs協(xié)同合成類固醇激素并分泌到胞外，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的排出[4]。在不同生理?xiàng)l件下，GCs和TCs之間存在著復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)以調(diào)節(jié)雄激素的合成分泌[5]，關(guān)于GCs調(diào)控TCs中類固醇激素的研究比較分散，調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

Edson等[6]研究了牛、羊及人類卵泡中GCs和TCs的生理作用，發(fā)現(xiàn)不同物種之間GCs和TCs的生理作用存在差異性。Hatzirodos等[7]通過(guò)對(duì)牛直徑為3～5 mm及直徑大于9 mm卵泡的GCs和TCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了許多細(xì)胞外基質(zhì)基因，其中線粒體定位富含谷氨酸蛋白(MGARP)、甘氨酸脫羧酶(GLDC)、碳水化合物磺基轉(zhuǎn)移酶8(CHST8)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶3(GPX3)是顆粒細(xì)胞新的潛在標(biāo)記物，而腓骨蛋白5(FBLN5)、骨甘氨酸(OGN)、受體活性修飾蛋白2(RAMP2)在TCs的表達(dá)水平顯著高于GCs。Bonnet等[8]采用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)和芯片，分析識(shí)別綿羊早期卵泡發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞與GCs的基因表達(dá)模式，闡明了不同類型細(xì)胞的mRNA庫(kù)在原始卵泡向中間卵泡過(guò)渡的過(guò)程中受到動(dòng)態(tài)調(diào)控。

目前關(guān)于牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs和TCs中生殖激素合成及分泌機(jī)制的研究尚未見報(bào)道，為此，本研究對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE83524 RNA-seq表達(dá)譜中GCs和TCs之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選及生物信息學(xué)分析，并通過(guò)Real-time PCR對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了驗(yàn)證，以期為探明牛優(yōu)勢(shì)卵泡中GCs和TCs在生殖激素合成及分泌過(guò)程中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

從貴州省銅仁市萬(wàn)山區(qū)肉牛屠宰場(chǎng)選取10頭健康的青年(1歲齡)母思南黃牛，屠宰后采集卵巢上的最大(直徑8 10 mm)卵泡(每頭牛1枚)，迅速置于4 ℃滅菌杜氏磷酸緩沖液(DPBS)中并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，參考文獻(xiàn)[9]的方法篩選優(yōu)勢(shì)卵泡，最終獲得5個(gè)樣本。

將篩選出的優(yōu)勢(shì)卵泡放到盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿上，使用眼科剪刀將卵泡剪開，分別用細(xì)胞刮刀刮取位于卵泡壁上的GCs和TCs，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 差異表達(dá)基因篩選

1.2.1 芯片數(shù)據(jù) 在美國(guó)國(guó)立生物信息中心GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中搜索“bovine follicle development”，獲得GSE83524 RNA-seq表達(dá)譜，其中納入了4頭牛優(yōu)勢(shì)卵泡中的GCs樣本和3頭牛優(yōu)勢(shì)卵泡中的 TCs樣本。

1.2.2 差異表達(dá)基因的篩選與GO和KEGG分析 使用在線軟件GEO2R(https://www.ncbi.nlon.nih.gov/geo/geo2r1)對(duì)牛優(yōu)勢(shì)卵泡中GCs和TCs之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，篩選條件為：|差異倍數(shù)lb值 |≥1.5，每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)(FPKM)≥2，校正后的P<0.01。

使用DAVID軟件對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO(gene ontology)功能富集分析；為了獲得與細(xì)胞內(nèi)生殖激素合成相關(guān)的信號(hào)通路，使用KOBAS軟件進(jìn)行KEGG(kgoto encyclopedia of genes and genomes)信號(hào)通路分析，篩選出GCs和TCs之間參與生殖激素合成相關(guān)信號(hào)通路。

使用String軟件構(gòu)建蛋白與蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，并將得到的互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過(guò)其Cyto-Hubba插件的MCC算法篩選出排名前10位的Hub基因。

1.3 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

1.3.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 從-80 ℃冰箱中取出3個(gè)樣本的GCs和TCs置于冰盒上解凍，用Trizol法分別提取2種細(xì)胞的總RNA，采用NanoDrop 2000測(cè)量濃度。用北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 以核糖體磷酸化蛋白大亞基P0基因(RPLP0)為內(nèi)參基因，選取參與卵巢類固醇激素生成的腺苷酸環(huán)化酶3基因(ADCY3)、細(xì)胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、腺苷酸環(huán)化酶8基因(ADCY8)、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白基因(GNAS)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6基因(BMP6)5個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。

用Primer 5.0設(shè)計(jì)ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6及內(nèi)參基因RPLP0引物，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度如表1所示，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物信息Table 1 Sequences of tested primers

1.3.3 Real-time PCR驗(yàn)證 根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司TransStart?Tip Green qPCR SuperMix使用說(shuō)明，建立20 μL Real-time PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 4 μL，上、下游引物各0.5 μL， SYBR MIX 10 μL，ddH2O 5 μL；PCR反應(yīng)在Light Cycler 480平臺(tái)進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)4次。

PCR反應(yīng)結(jié)束后收集循環(huán)閾值(Ct),采用2-ΔΔCt法計(jì)算ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6基因的相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中差異表達(dá)基因的篩選

經(jīng)在線軟件GEO2R分析，共獲得247個(gè)在牛優(yōu)勢(shì)卵泡CGs與TCs中差異表達(dá)基因：上調(diào)表達(dá)基因43個(gè)，其中差異倍數(shù)最高的20個(gè)基因及其功能見表2；下調(diào)表達(dá)基因204個(gè)，其中差異倍數(shù)最高的20個(gè)基因及其功能見表3。從表2和表3可以看出，各基因在GCs和TCs中表達(dá)水平均比較高，差異倍數(shù)較大，表明這些基因在牛卵泡優(yōu)勢(shì)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其中有參與細(xì)胞有絲分裂的基因，也有參與細(xì)胞發(fā)育和內(nèi)分泌激素調(diào)控的基因。例如，前列腺素E2受體EP3基因(PTGER3)參與了子宮收縮；干擾素誘導(dǎo)基因3(IFNT3)促進(jìn)了干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡；F-Box蛋白5基因(FBXO5)在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中有重要的調(diào)控作用；細(xì)胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)是性激素合成的關(guān)鍵酶，在膜細(xì)胞中參與了雄激素的合成；G蛋白亞單位γ11基因(GNG11)參與了跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，屬于卵泡負(fù)調(diào)控發(fā)育因子。

表2 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中差異倍數(shù)最高的20個(gè)上調(diào)表達(dá)基因及其功能分析Table 2 Top 20 up-regulated genes in GCs and TCs and their functions of dominant follicles in cattle

表3 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中差異倍數(shù)最高的20個(gè)下調(diào)表達(dá)基因及其功能分析Table 3 Top 20 down-regulated genes in GCs and TCs and their functions of dominant follicles in cattle

2.2 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中差異表達(dá)基因GO功能富集分析

通過(guò)DAVID軟件對(duì)247個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因分為3大類41組，其中參與生物學(xué)過(guò)程的有 22組，主要包括細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控及心臟發(fā)育等；參與細(xì)胞組分的有12組，主要富集在細(xì)胞外的外泌體、細(xì)胞外空間及蛋白質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)；參與分子功能的有7組，主要在以下功能富集，即鈣離子結(jié)合、肝素結(jié)合、整合素結(jié)合及細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分。

2.4 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中差異表達(dá)基因KEGG信號(hào)通路分析

用KOBAS軟件對(duì)所獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共發(fā)現(xiàn)17條通路，其中與本研究?jī)?nèi)容相關(guān)的通路為卵巢類固醇生成通路，其包含ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6 5個(gè)基因。

2.5 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中Hub基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析

PPI結(jié)果(圖1)顯示，排名前10位的Hub基因分別是透明質(zhì)酸介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)受體基因(HMMR)、著絲粒蛋白F基因(CENPF)、著絲粒蛋白E基因(CENPE)、驅(qū)動(dòng)蛋白家族11基因(KIF11)、Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5基因(DLGAP5)、MIS18結(jié)合蛋白1基因(MIS18BP1)、表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移序列2基因(ECT2)、正核分裂周期蛋白80基因(NDC80)、多梳蛋白復(fù)合體1基因(PRC1)、PDZ結(jié)合激酶基因(PBK)。

圖1 牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中排名前10位Hub基因的PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析Fig.1 PPI analysis of top 10 Hub genes in GCs and TCs of dominant follicles in cattle

2.6 Real-time PCR驗(yàn)證分析

Real-time PCR結(jié)果(表5)顯示，CYP17A1、ADCY8在TCs中的表達(dá)量極顯著高于GCs (P<0.01)；ADCY3、BMP6在TCs中的表達(dá)量顯著高于GCs (P<0.05) ，GNAS在GCs中的表達(dá)量極顯著高于TCs (P<0.01)。ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6在GCs和TCs中的表達(dá)趨勢(shì)與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

3 討 論

卵母細(xì)胞、GCs和TCs是雌性動(dòng)物卵泡的主要組成部分，它們?cè)诩に睾铣?、卵泡發(fā)育和閉鎖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[10]。由GCs分泌的胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、激活素和抑制素可以通過(guò)自分泌/旁分泌來(lái)調(diào)節(jié)卵巢的功能[11]。TCs不僅支持發(fā)育中卵泡的結(jié)構(gòu)，而且為GCs合成雌激素提供雄激素，從而刺激早期卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育[12-13]。在雌性動(dòng)物卵巢中，激素的生成是由GCs和TCs特異性表達(dá)的一系列類固醇酶通過(guò)協(xié)同作用來(lái)完成的[14]。GCs通過(guò)縫隙連接將信號(hào)傳遞到卵母細(xì)胞，對(duì)卵子的發(fā)生、形成和成熟以及受精后胚胎發(fā)育至關(guān)重要[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，類固醇樣原急性調(diào)節(jié)蛋白(STAR)通過(guò)將膽固醇運(yùn)輸?shù)骄€粒體來(lái)調(diào)節(jié)雄激素的分泌[16]，而TCs所表達(dá)的細(xì)胞色素P450 11A1 (CYP11A1)、細(xì)胞色素CYP17A1和HSD3B2均為雄激素生物合成的關(guān)鍵酶[17]。體外研究表明， TCs的一個(gè)關(guān)鍵特征是雄激素分泌的增加是由LH以劑量依賴性的方式驅(qū)動(dòng)的[18-19]。CYP17A1是催化孕烯酮轉(zhuǎn)化為17-羥基孕烯酮和孕酮轉(zhuǎn)化為17-羥基孕酮的定性調(diào)節(jié)劑，是雄激素生物合成的限速酶[20]。CYP17A1主要表達(dá)于腎上腺、睪丸間質(zhì)細(xì)胞和卵巢膜細(xì)胞，其活性的增加能夠顯著促進(jìn)TCs中雄激素的生物合成和分泌[21]。CYP17A1啟動(dòng)子區(qū)翻譯起始位點(diǎn)上游-34位點(diǎn)的T突變?yōu)镃被認(rèn)為會(huì)增加CYP17A1基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致雄激素的合成增加，這是由于突變?cè)黾恿宿D(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)所致[22]。腺苷酸環(huán)化酶8 (ADCY8)是一種膜結(jié)合酶，在高等脊椎動(dòng)物中催化ATP形成cAMP。研究表明，慢性輸注人類情緒穩(wěn)定劑卡馬西平能夠顯著降低小鼠的回避行為，這是通過(guò)ADCY8活性發(fā)揮作用[23]。此外，還有研究指出ADCY8可以促進(jìn)接受型子宮內(nèi)膜的形成，在子宮內(nèi)膜容受性發(fā)育中起重要作用[24]。鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(GNAS)復(fù)合位點(diǎn)能產(chǎn)生多個(gè)選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本，GNAS復(fù)合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄本以組織特異性的方式被印跡，它與牛的胴體性狀、產(chǎn)奶量和生殖性狀存在顯著相關(guān)性[25]。在豬上，有研究證實(shí)了GNAS編碼多個(gè)印跡或雙等位基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本[26]。在人類中，GNAS復(fù)合位點(diǎn)編碼片段的突變會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)分泌疾病，如假性甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和垂體腫瘤[27]。ADCY3通過(guò)催化信號(hào)分子cAMP的形成以響應(yīng)G蛋白信號(hào)。Baxendale等[28]研究表明，減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞可以產(chǎn)生ADCY3蛋白。敲除小鼠ADCY3后發(fā)現(xiàn)其是嗅覺喪失，還會(huì)導(dǎo)致雄性小鼠精子活力不足，進(jìn)而導(dǎo)致不育[29]。在雌性動(dòng)物中， ADCY3參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂信號(hào)通路。骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)是TGF-akt通路中的一員， BMP6可以抑制cAMP的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致STAR和P450scc mRNA的水平降低，卻不影響芳香化酶mRNA水平，使孕激素水平顯著下降[30]。牛卵泡內(nèi)GCs和TCs在激素的調(diào)控下有序的進(jìn)行增殖、分化，與其相關(guān)的基因也在不同時(shí)空準(zhǔn)確表達(dá)。優(yōu)勢(shì)卵泡GCs和TCs協(xié)同合成雌激素與抑制素，抑制促卵泡素(FSH)的分泌，導(dǎo)致其他卵泡的發(fā)育受阻，最終走向閉鎖[31]。本研究通過(guò)對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE83524 RNA-seq表達(dá)譜進(jìn)行分析，共獲得247個(gè)差異表達(dá)基因，其中43個(gè)表達(dá)上調(diào)，204個(gè)表達(dá)下調(diào)。通過(guò)對(duì)所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG信號(hào)通路及PPI網(wǎng)絡(luò)互作分析，共篩選出ADCY3、CYP17A1、ADCY8、GNAS、BMP6 5個(gè)在卵巢中參與類固醇激素合成的基因，Real-time PCR驗(yàn)證分析結(jié)果顯示這5個(gè)基因在GCs和TCs中的表達(dá)趨勢(shì)與GEO芯片數(shù)據(jù)結(jié)果一致。因此推測(cè)這5個(gè)基因在牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs和TCs中對(duì)生殖激素的合成及分泌起了重要作用，為進(jìn)一步研究其在生殖激素合成及分泌過(guò)程中的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究在牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs與TCs中獲得247個(gè)差異表達(dá)基因，其中43個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，204個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過(guò)GO功能富集、KEGG信號(hào)通路分析及PPI網(wǎng)路互作分析，篩選出5個(gè)與牛卵泡中類固醇激素合成相關(guān)的基因，其中CYP17A1、ADCY8、ADCY3、BMP6在TCs中的表達(dá)量均顯著高于GCs，GNAS在GCs中的表達(dá)量極顯著高于TCs，因此推測(cè)這5個(gè)基因在牛優(yōu)勢(shì)卵泡GCs和TCs中對(duì)生殖激素的合成及分泌起了重要作用。