甘薯抗草甘膦生理指標(biāo)及其相關(guān)基因EPSPS和AKR的表達

柴沙沙,李成陽,雷 劍,王連軍,劉巧林,楊新筍

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a糧食作物研究所/湖北省甘薯工程技術(shù)研究中心/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室,b經(jīng)濟作物研究所，湖北 武漢 430064)

甘薯是一種重要的糧食、飼料及工業(yè)原料作物，作為一種新型能源作物，其地位十分重要。甘薯在莖葉封壟之前，田間雜草嚴(yán)重影響其幼苗生長，可引起甘薯減產(chǎn)5%～15%，草害嚴(yán)重時減產(chǎn)達50%以上，給甘薯生產(chǎn)帶來重大損失[1]。在甘薯大規(guī)模生產(chǎn)中中耕除草耗費人力物力。目前選用合適的除草劑是最經(jīng)濟有效的除草方法[2]。草甘膦是一種非選擇性、葉面施用的除草劑，由于具有廣譜、低毒、低土壤殘留的特點，主要用于防治一年生、二年生和多年生雜草，如莎草和闊葉雜草，主要作用部位是植物的莖和葉片[3-5]。

5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是植物和大部分微生物體內(nèi)莽草酸途徑的一個關(guān)鍵酶，在芳香族氨基酸的生物體合成中至關(guān)重要[6]。草甘膦會專一抑制EPSPS活性，導(dǎo)致莽草酸大量積累，從而擾亂生物體正常的氮代謝而致其死亡。初步研究發(fā)現(xiàn)，噴施草甘膦會加劇甘薯葉片膜脂過氧化程度，提高葉片的CAT活性和MDA含量[2]。醛酮還原酶(aldo-ketoreductase,AKR)是一個包括14個家族共40個成員的超家族，廣泛分布于原核生物和真核生物中[7-9]。AKR成員均屬于單體胞質(zhì)蛋白，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為其輔酶，將醛酮類化合物還原成相應(yīng)的醇類，在生物體中發(fā)揮重要作用[10-13]。Pan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，水稻愈傷組織和幼苗對草甘膦的抗性表現(xiàn)為EcAKR4-1過表達和AKR活性增強。研究表明，AKR及其同工酶可能參與細(xì)胞生長和分化調(diào)控[15]，以及調(diào)節(jié)滲透作用、細(xì)胞中有毒物質(zhì)的代謝等[6,16]。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物體內(nèi)具有重要的滲透調(diào)節(jié)作用。在逆境條件下植物體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加[17]。原向陽等[18]研究表明，噴施草甘膦后，大豆脯氨酸含量升高，且脯氨酸含量與草甘膦劑量呈顯著正相關(guān)。甘薯耐草甘膦是否與EPSPS和AKR基因的過表達有關(guān)尚不清楚。為此，本研究選取對草甘膦敏感性不同的2個甘薯品種N3589(草甘膦敏感型品種)和鄂薯11(草甘膦抗性品種)為試驗材料，研究噴施草甘膦后甘薯莽草酸和脯氨酸含量及根系活力的變化，以及EPSPS與AKR基因的表達特點，為甘薯耐草甘膦分子機制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品種N3589(親本為寧紫8號，集團雜交材料)。供試藥劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑(有效濃度2.16 mol/L，美國孟山都公司生產(chǎn))。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 田間試驗 試驗于2019年5-10月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所鄂州試驗基地進行。試驗地土壤質(zhì)地為壤土，0～20 cm土層土壤基礎(chǔ)肥力情況：有機質(zhì)含量26.3 g/kg，堿解氮含量185.06 mg/kg，速效磷(P)含量20.8 mg/kg，速效鉀(K)含量304.05 mg/kg。

試驗采用裂區(qū)試驗設(shè)計，主區(qū)為不噴施草甘膦處理(A1)和噴施草甘膦處理(A2)，其中A1為噴施清水對照；A2噴施21.6 mmol/L草甘膦，即將41%草甘膦異丙胺鹽水劑稀釋100倍。副區(qū)為草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11和草甘膦敏感型甘薯品種N3589。每個處理設(shè)3次重復(fù)，小區(qū)長5 m，寬4.8 m；株距25 cm，行距80 cm。栽插后20 d對甘薯進行噴施草甘膦處理，草甘膦溶液用量225 L/hm2，用噴霧器進行均勻噴霧，以葉面開始有液滴滑落時為準(zhǔn)。甘薯于2019年5月20日栽插，10月22日收獲，大田管理除了不進行中耕除草外，其他管理同田間生產(chǎn)。

1.2.2 盆栽試驗 盆栽試驗為研究噴施草甘膦之后，甘薯生長前期根系特性的輔助試驗。盆栽試驗處理同田間試驗。選用高25 cm、上下內(nèi)直徑分別為23 cm和20 cm的硬塑料盆，填裝大田耕層土壤，每盆裝土6 kg。取3葉1心的甘薯幼苗，移栽于硬塑料盆中，每盆1株，每處理15盆。噴施清水對照和草甘膦處理的盆栽分開擺放，不同處理的盆栽排列間留一排為隔離。移栽后20 d，向甘薯葉面均勻噴施草甘膦除草劑，以葉面開始有液滴滑落時為準(zhǔn)，草甘膦溶液濃度21.6 mmol/L，施用量為225 L/hm2。

1.3 取樣方法

田間試驗中設(shè)置專門的取樣區(qū), 分別于噴藥后第2，5，8，11天，在取樣區(qū)取3～5株,將整株植株分地上部與地下部2部分，其中地上部分將葉與莖分別稱質(zhì)量并留樣，地下部分將直徑≥0.5 cm的塊根稱質(zhì)量并留樣，110 ℃殺青，70 ℃烘干留樣用于脯氨酸含量的測定。同時, 每個處理取5片功能葉(頂5葉)，液氮速凍，-20 ℃低溫保存，用于莽草酸含量的測定。

盆栽試驗中，分別于噴藥后第2，5，8，11天沖根取樣, 每個處理沖根 6盆，共取 6株, 用于根系活力測定。同時, 每個處理取5片幼嫩葉片，液氮速凍，-80 ℃超低溫保存，用于實時熒光定量PCR(q-PCR)檢測基因表達。

1.4 生理指標(biāo)和根系活力的測定

莽草酸含量測定：采用分光光度法[19]并稍做改動：準(zhǔn)確稱取甘薯功能葉 0.1 g，剪碎于研缽中研磨，然后加入1 mL 0.25 mol/L HCl勻漿，4 ℃離心(12 000 r/min，15 min)，上清液置冰上待測。取上清液200 μL，加入2 mL 1%過碘酸溶液，混勻，室溫靜置3 h后再加入2 mL 1 mol/L的NaOH溶液和1.2 mL 0.1 mol/L甘氨酸，混勻靜置5 min，于380 nm處測定吸光度(OD)。根據(jù)莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算甘薯葉片中莽草酸含量。

脯氨酸含量測定：脯氨酸含量測定采用水浴浸提法[17]。

根系活力測定：根系活力測定采用TTC法[20]。

1.5 耐草甘膦相關(guān)基因表達檢測

1.5.1 葉片總RNA的提取和cDNA合成 取凍存的幼嫩葉片經(jīng)液氮研磨后，選用TransZol Up試劑盒(全式金生物技術(shù)有限公司) 進行總RNA提取。選用全式金生物技術(shù)有限公司的目錄號為AT341-01的試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存在-20 ℃冰箱。

1.5.2 引物設(shè)計 通過Sweetpotato GARDEN 網(wǎng)(http://sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/)和Sweet-potato Genomics Resource網(wǎng)(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/)獲得EPSPS和AKR基因序列，采用Premier3 Plus設(shè)計基因的實時熒光定量分析引物，目前已經(jīng)從甘薯中克隆到5條有序列差異的AKR基因(Itr_sc000139.1_g00024.1，Itr_sc000203.1_g00031.1，Itr_sc000691.1_g00020.1，Itr_sc000862.1_g00011.1，Itr_sc001070.1_g00006.1)，為將基因表達完全，分別設(shè)計2條引物AKR-1(Itr_sc000112.1_g00002.1)和AKR-2(Itr_sc000387.1_g00025.1)(表1)。內(nèi)標(biāo)基因甘薯肌動蛋白基因(β-actin)的檢測引物參照楊元軍等[21]的方法合成。

表1 試驗相關(guān)基因引物Table 1 Primers used in this experiment

1.5.3 實時熒光定量分析 實時熒光定量PCR檢測的熒光染料為SYBR Green(廈門致善生物科技有限公司)，PCR熱循環(huán)儀是Bio-Rad CFX 384，所用軟件為Bio-Rad CFX Manager。反應(yīng)體系為:cDNA模板1.0 μL，引物-F(10 μmol/L) 0.4 μL，引物-R (10 μmol/L) 0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，反應(yīng)體系總體積為20 μL。兩步法實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)條件為：94.0 ℃預(yù)變性2 min，94.0 ℃變性5 s，60.0 ℃退火30 s，45個循環(huán)；熔合曲線反應(yīng)溫度為65～95 ℃；每個樣品設(shè)3個重復(fù)及NTC對照。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線[14]。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法進行相對定量[22]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)的方差分析采用DPS處理，用Excel制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施草甘膦對甘薯葉片莽草酸含量的影響

由圖1可以看出，噴施草甘膦之后第2天和第5天，2個甘薯品種葉片的莽草酸含量處理A2均高于對照處理A1，與草甘膦敏感型品種N3589相比，草甘膦抗性品種鄂薯11 A2處理的葉片莽草酸含量升高不明顯。噴施草甘膦后第8天和第11天，草甘膦敏感型品種N3589處理A2的葉片莽草酸含量迅速下降，略高于處理A1；鄂薯11處理A2的莽草酸含量略有下降，但也略高于對照A1。由此可知，噴施草甘膦后，敏感型材料N3589的莽草酸迅速積累，而抗性品種鄂薯11的莽草酸積累較少。

圖1 噴施草甘膦后甘薯葉片莽草酸含量的變化Fig.1 Changes of shikimic acid content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

2.2 噴施草甘膦對甘薯脯氨酸含量的影響

由圖2和圖3可以看出，噴施草甘膦之后，草甘膦敏感型甘薯品種N3589葉片和塊根的脯氨酸含量先升高后降低，最大值出現(xiàn)在噴施后第5天；草甘膦抗性品種鄂薯11葉片和塊根的脯氨酸含量表現(xiàn)為先升高后降低又略微升高的趨勢，最大值也出現(xiàn)在噴施后第5天。無論是敏感型品種N3589還是抗性品種鄂薯11，噴施草甘膦之后，葉片和塊根中脯氨酸含量都顯著升高。由此可見，與對照相比，噴施草甘膦之后，甘薯葉片和塊根的脯氨酸含量均顯著升高。

圖2 噴施草甘膦后甘薯葉片脯氨酸含量的變化Fig.2 Changes of proline content in sweet potato leaves after spraying glyphosate

圖3 噴施草甘膦后甘薯塊根脯氨酸含量的變化Fig.3 Changes of proline content in sweet potato tuber after spraying glyphosate

2.3 噴施草甘膦對甘薯根系活力的影響

由圖4可以看出，噴施草甘膦之后，2個甘薯品種處理A2的根系活力都是先升高后降低，最大值都出現(xiàn)在噴施草甘膦之后第5天，與噴施清水對照處理A1的變化趨勢一致。與噴施清水對照處理A1相比，2個甘薯品種處理A2的根系活力均降低，一直到噴施草甘膦之后第11天，與對照A1相比，2個甘薯品種噴施草甘膦處理A2的根系活力差距減小。說明，無論敏感型還是抗性甘薯品種，噴施草甘膦之后，甘薯的根系活力均顯著降低；而噴施草甘膦11 d后根系活力有所恢復(fù)。

圖4 噴施草甘膦后甘薯根系活力的變化Fig.4 Changes of sweet potato root vigor after spraying glyphosate

2.4 甘薯耐草甘膦相關(guān)基因的表達

2.4.1EPSPS基因的表達 由圖5可以看出，噴施草甘膦之后，草甘膦敏感品種N3589的EPSPS基因表達顯著下調(diào)，而草甘膦抗性品種鄂薯11的EPSPS基因表達顯著上調(diào)。說明，噴施草甘膦后EPSPS基因是否上調(diào)表達，可以作為植物是否耐草甘膦的標(biāo)志。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences among treatments(P<0.05).The same below圖5 噴施草甘膦后甘薯葉片EPSPS基因相對表達水平Fig.5 Relative expression levels of sweet potato EPSPS gene after spraying glyphosate

2.4.2AKR基因的表達 由圖6和圖7 可以看出，相較于對照(A1)，噴施草甘膦處理(A2)的AKR-1和AKR-2基因的相對表達有較為相似的變化規(guī)律。在噴施草甘膦之后第2天，草甘膦敏感品種N3589的AKR基因均表達上調(diào)；第5天，AKR-1基因下調(diào)表達，AKR-2基因上調(diào)表達；第8天以及第11天，AKR基因均顯著下調(diào)表達。對于草甘膦抗性品種鄂薯11，噴施草甘膦后第2天，AKR基因表達顯著下調(diào)；之后，均上調(diào)表達。說明，噴施草甘膦之后，敏感品種的AKR基因先上調(diào)表達后下調(diào)表達，而抗性品種的AKR基因先下調(diào)表達后上調(diào)表達。

圖6 噴施草甘膦后甘薯葉片AKR-1基因相對表達水平Fig.6 Relative expression levels of sweet potato AKR-1 gene after spraying glyphosate

圖7 噴施草甘膦后甘薯葉片AKR-2基因相對表達水平Fig.7 Relative expression levels of sweet potato AKR-2 gene after spraying glyphosate

3 討 論

3.1 噴施草甘膦后甘薯生理指標(biāo)的變化

脯氨酸在植物體內(nèi)起到重要的滲透調(diào)節(jié)作用。在逆境條件下，植物體內(nèi)的脯氨酸含量顯著增加，在一定程度上反映了植物的抗逆性[17]。原向陽等[18]研究表明，噴施草甘膦后大豆脯氨酸含量升高，且與草甘膦劑量呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，噴施草甘膦后甘薯葉片和塊根的脯氨酸含量均升高，這與前人研究結(jié)果一致。草甘膦引起植物產(chǎn)生各種生理脅迫或氧化脅迫，其中最明顯的癥狀是抑制植物的生長。根系活力是指根的吸收和合成代謝能力，生長速度是根系活力的整體表現(xiàn)[23]。本研究結(jié)果顯示，噴施草甘膦后甘薯的根系活力均顯著降低，但噴施草甘膦11 d后根系活力有所恢復(fù)。

3.2 草甘膦對甘薯EPSPS和AKR基因表達的影響

EPSPS是莽草酸途徑中的關(guān)鍵酶[6]。草甘膦會專一抑制EPSPS活性，導(dǎo)致莽草酸大量積累，從而擾亂生物體正常的氮代謝而致其死亡。在草甘膦敏感型雜草中，草甘膦對EPSPS的抑制通常導(dǎo)致莽草酸大量積累，而在耐草甘膦或抗草甘膦雜草中莽草酸積累相對較少[24]。研究認(rèn)為，可以使用莽草酸積累作為區(qū)分草甘膦抗性的參數(shù)[25-27]。EPSPS基因擴增使EPSPS過量表達產(chǎn)生抗藥性[28]，這一機制已在8種雜草中有報告[29]。本研究中，草甘膦敏感品種N3589的莽草酸含量遠(yuǎn)高于草甘膦抗性品種鄂薯11，同時噴施草甘膦后，草甘膦抗性品種鄂薯11的EPSPS基因上調(diào)表達，這與前人的研究結(jié)果[28]一致。在噴施草甘膦后，草甘膦敏感型甘薯品種N3589的EPSPS基因顯著下調(diào)，而草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11的EPSPS基因顯著上調(diào)。

AKR在植物中主要參與醛基解毒、脅迫防御、滲透液生成及二次代謝和膜運輸[7,9]。在大腸桿菌中抗草甘膦品系的AKR基因表達量高于感病品系，表達的EcAKR4-1能代謝草甘膦產(chǎn)生氨甲基膦酸(AMPA)和乙醛酸[14]。水稻愈傷組織和幼苗對草甘膦的抗性表現(xiàn)為EcAKR4-1過表達和AKR活性增強。研究表明，擬南芥中AKR4C8和AKR4C9可以減少包含活性醛基的有毒化合物范圍[7]。玉米的AKR4C7可以催化山梨糖醇氧化為葡萄糖[30]。來自藍細(xì)菌魚腥藻的AKR17A1可以催化除草劑丁草胺代謝為二羧酸和苯酚[31]。本研究結(jié)果顯示，在噴施草甘膦后，草甘膦敏感型甘薯品種N3589的AKR基因先上調(diào)表達后下調(diào)表達；而草甘膦抗性甘薯品種鄂薯11的AKR基因先下調(diào)表達后上調(diào)表達。由此可推斷，受到草甘膦脅迫后，草甘膦敏感材料的AKR基因迅速啟動，但不能減少草甘膦的脅迫危害；而草甘膦抗性材料的AKR基因反應(yīng)較遲緩，噴施草甘膦5 d后一直處于上調(diào)表達狀態(tài)，其具體的代謝機理還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，噴施草甘膦后，與敏感型甘薯品種N3589相比，草甘膦抗性品種鄂薯11的莽草酸積累較少，這是由于噴施草甘膦后抗性品種鄂薯11的EPSPS基因迅速上調(diào)表達，從而減少體內(nèi)莽草酸累積對植株造成的傷害；與此同時，在噴施草甘膦后第5天開始，AKR基因迅速上調(diào)表達，從而參與了甘薯體內(nèi)草甘膦的代謝，減少后期草甘膦對植株的危害。至于AKR基因如何參與草甘膦代謝，還有待于進一步研究。