AFB1對(duì)犬肝細(xì)胞的毒性作用及NAC的保護(hù)效應(yīng)

張 咪，趙 杰，徐靜茹，曹 利，馮士彬，李 玉，阮崇美，辜麗川，吳金節(jié)，王希春

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) a動(dòng)物科技學(xué)院 b信息與計(jì)算機(jī)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2 安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

霉菌毒素(mycotoxin)是指由霉菌在特定環(huán)境下產(chǎn)生的一類毒性次生代謝產(chǎn)物，能夠消耗飼料中的營(yíng)養(yǎng)成分，降低其品質(zhì)并散發(fā)出特殊的“霉臭”氣味，導(dǎo)致動(dòng)物采食量降低、機(jī)體免疫機(jī)能與生產(chǎn)性能下降等[1]。黃曲霉毒素是主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的一類帶有香豆素和雙呋喃環(huán)的毒性代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸、致突變作用[2]。黃曲霉毒素的衍生物約有20余種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，致癌性最強(qiáng)[3]。AFB1能夠?qū)θ撕蛣?dòng)物的健康產(chǎn)生不同程度的損害，肝臟是AFB1的主要靶器官。研究表明，給動(dòng)物飼喂含有AFB1的日糧，AFB1對(duì)動(dòng)物體質(zhì)重增長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，肝臟的形態(tài)和臟體比發(fā)生了明顯變化，且肝臟出現(xiàn)出血、部分壞死、變色等病理現(xiàn)象[4-6]。同時(shí)，AFB1可嚴(yán)重影響動(dòng)物體的肝功能，其中氧化和抗氧化標(biāo)志性酶類或非酶類分子呈現(xiàn)顯著性增加或減少[7]。目前，關(guān)于AFB1對(duì)肝細(xì)胞毒性作用的報(bào)道僅限于雛雞、雛鴨、錦鯉等動(dòng)物[8-10]，關(guān)于AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞的毒性研究尚未見報(bào)道。

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，簡(jiǎn)稱乙酰半胱氨酸，是氨基酸L-半胱氨酸的N-乙酰衍生物。NAC含有的巰基具有抗氧化作用，能夠減少自由基的產(chǎn)生[11]。同時(shí)NAC也是半胱氨酸的供體，半胱氨酸是谷胱甘肽形成時(shí)的必需氨基酸，因此NAC還能夠維持動(dòng)物體內(nèi)抗氧化物谷胱甘肽水平[12-13]。有研究表明，NAC對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，可調(diào)節(jié)大鼠肝細(xì)胞凋亡基因[14-15]。薛畫眉等[16]研究了NAC對(duì)玉米赤霉烯酮致大鼠睪丸支持細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，但未見NAC對(duì)AFB1毒性緩解作用的報(bào)道。針對(duì)以上研究現(xiàn)狀，本試驗(yàn)以犬原代肝細(xì)胞為模型，研究AFB1對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用以及NAC的保護(hù)效應(yīng)，以期為AFB1毒性的有效防控提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇1～2月齡比格犬幼犬，試驗(yàn)前，常規(guī)飼養(yǎng)1周，進(jìn)行臨床檢查，確保機(jī)體健康。

1.1.2 材料與儀器 N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)，購(gòu)于北京索萊寶公司；黃曲霉毒素B1(AFB1)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；RNAiso Plus，購(gòu)于大連寶生物工程公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)于合肥賽國(guó)生物科技公司；Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit試劑盒，購(gòu)于美國(guó)BD(Becton Dickinson)公司；TRIZOL RNA提取試劑盒，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司(Invitrogen)；丙二醛(MDA)、8-羥基脫氧鳥苷酸(8-HdG)、過(guò)氧化氫(H2O2)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購(gòu)于江蘇酶標(biāo)公司。CX31型生物顯微鏡，購(gòu)于日本Olympus公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；FACSCalibar流式細(xì)胞分析儀，購(gòu)于美國(guó)BD公司；核酸濃度測(cè)定儀，購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)儀，購(gòu)于美國(guó)ABI公司；電泳儀、凝膠成像儀，購(gòu)于上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；肝功能試劑盒與全自動(dòng)血液生化分析儀，購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 犬原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

對(duì)1～2月齡幼犬前肢靜脈注射肝素鈉，用5 mg/kg舒泰麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)，剃毛消毒后，無(wú)菌條件下取出肝臟，移至無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，采用膠原酶法[17]處理肝臟直至流出澄清液體，終止消化。將肝臟剪切成泥狀，充分與RPMI-1640培養(yǎng)基混合，剔除多余的組織，過(guò)濾后收集原代肝細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸濁液，洗滌3次。將分離的原代肝細(xì)胞按照2×106mL-1接種細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)4 h后吸出上清液或死亡的未貼壁細(xì)胞，更換RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，保證細(xì)胞健康狀態(tài)良好。重復(fù)上述步驟更換RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，此時(shí)共培養(yǎng)48 h，原代肝細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[18]。

1.3 AFB1最佳處理時(shí)間和質(zhì)量濃度及NAC最佳保護(hù)濃度的篩選

取1.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬原代肝細(xì)胞，用0(對(duì)照)，0.05，0.25，1.25，6.25，31.25 μg/mL AFB1分別培養(yǎng)24，36，48 h，每處理3個(gè)平行試驗(yàn)，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，分析AFB1的最佳處理時(shí)間，并篩選AFB1的最佳攻毒質(zhì)量濃度。

取1.2中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬原代肝細(xì)胞，分別用0(對(duì)照)，0.1，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，128.0，256.0，512.0 mmol/L NAC培養(yǎng)36 h，每處理3個(gè)平行試驗(yàn)，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選出保護(hù)劑NAC的最佳作用濃度。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的觀察

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬原代肝細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×105mL-1，培養(yǎng)至貼壁后更換培養(yǎng)液，分別用0，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理后培養(yǎng)36 h，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各試驗(yàn)組細(xì)胞的形態(tài)。

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬原代肝細(xì)胞，將細(xì)胞分別用0，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理后培養(yǎng)36 h，用PBS溶液吹落細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，收集細(xì)胞，將其與體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛混合后靜置于4 ℃冰箱24 h，用PBS漂洗后用體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸進(jìn)行后固定，PBS漂洗，丙酮梯度脫水，梯度滲透，包埋，切片，最后正染，用透射電子顯微鏡觀察犬原代肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5 肝功能相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

試驗(yàn)分為對(duì)照組(0 μg/mLAFB1)、不同質(zhì)量濃度(0.05，0.25，1.25，6.25，31.25 μg/mL)AFB1處理組和NAC保護(hù)組(6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC)，在各處理組中分別加入犬原代肝細(xì)胞，培養(yǎng)36 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取上清液于1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，取上清液，每組設(shè)3個(gè)平行，采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性以及總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)的質(zhì)量濃度。

1.6 氧化與抗氧化功能的測(cè)定

取1.5中離心后的各處理組的細(xì)胞上清液，按照各試劑盒說(shuō)明書步驟操作，測(cè)定8-OhdG、MDA、H2O2含量以及GSH-Px、CAT和SOD活性。

1.7 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

取1.5中對(duì)照組(0 μg/mL AFB1)、6.25 μg/mL AFB1處理組和6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理組的細(xì)胞，將其在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率[19]。

1.8 凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬原代肝細(xì)胞，用0(對(duì)照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理36 h后，傾斜吸出細(xì)胞板中的上清液，加入4 ℃的PBS緩沖液處理后，棄上清液，加入1 mL RNAiso Plus，提取RNA，用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度，可知各處理組的RNA品質(zhì)符合試驗(yàn)要求。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript Ⅲ，按照說(shuō)明書建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，分別將各處理組的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將其置于-20 ℃保存。參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)合成含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解激活酶3基因 (cleaved-caspase-3)、天冬氨酸蛋白水解激活酶9基因(cleaved-caspase-9)引物。選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)其引物。試驗(yàn)引物序列如表1所示。

表1 供試的熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Sequences for primers for quantitative real-time PCR

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增各試驗(yàn)組的cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9基因和內(nèi)參基因GAPDH，PCR反應(yīng)體系為：qPCR反應(yīng)混合物10 μL，2.5 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，收集循環(huán)閾值(Ct),利用2-ΔΔCt法計(jì)算cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞毒性的最佳作用時(shí)間及攻毒質(zhì)量濃度

不同質(zhì)量濃度AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，處理36 h細(xì)胞的存活率總體呈降低的趨勢(shì)，呈現(xiàn)濃度依賴性；而處理24和48 h的犬原代肝細(xì)胞則無(wú)明顯變化規(guī)律，因此在后續(xù)的試驗(yàn)過(guò)程中均選擇36 h作為AFB1處理犬原代肝細(xì)胞的最佳時(shí)間。

不同質(zhì)量濃度AFB1處理36 h對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性的影響結(jié)果(圖1)顯示，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，犬原代肝細(xì)胞活性呈降低的趨勢(shì)，且當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL時(shí)，犬原代肝細(xì)胞活性降至最低；之后隨著AFB1質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，犬原代肝細(xì)胞活性無(wú)顯著變化，故后續(xù)試驗(yàn)選擇6.25 μg/mL作為AFB1處理犬原代肝細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度。

**表示不同質(zhì)量濃度AFB1處理36 h后與對(duì)照組(0 μg/mL AFB1)差異達(dá)極顯著水平(P<0.01) **means extremely significant differences between AFB1 treatments for 36 h and the control group(0 μg/mL AFB1)(P<0.01)圖1 不同質(zhì)量濃度AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of AFB1 on cell activity of canine primary hepatocytes

2.2 NAC對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性最佳保護(hù)濃度

圖2為不同濃度NAC對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性的影響結(jié)果。由圖2可知，隨著NAC濃度的增加，細(xì)胞活性呈先降低后增加再降低的趨勢(shì)，當(dāng)NAC濃度為64.0 mmol/L時(shí)，細(xì)胞活性達(dá)到最高；之后隨著NAC濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低。故64.0 mmol/L為NAC對(duì)犬原代肝細(xì)胞的最佳保護(hù)濃度。

圖2 不同濃度NAC對(duì)犬原代肝細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of NAC concentration on cell activity of canine primary hepatocytes

2.3 AFB1和NAC處理后犬原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的光學(xué)顯微觀察

AFB1和NAC處理后犬原代肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的光學(xué)顯微觀察見圖3。如圖3所示，0 μg/mL AFB1處理細(xì)胞貼壁情況好，細(xì)胞間連接緊密；0.05～6.25 μg/mL AFB1處理的細(xì)胞發(fā)生了明顯變化，且隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐步遞減，細(xì)胞間隙變大，視野中破碎細(xì)胞、漂浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞失去飽滿性，出現(xiàn)凋亡、壞死的現(xiàn)象逐漸明顯且愈加嚴(yán)重。與6.25 μg/mL AFB1處理細(xì)胞相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理細(xì)胞飽滿且活性良好，細(xì)胞數(shù)目增加，視野中漂浮的裂解細(xì)胞碎片較少。

2.4 AFB1和NAC處理后犬原代肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電子顯微觀察

觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中，肝細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，且具有肝細(xì)胞偽足現(xiàn)象，細(xì)胞胞核形態(tài)完整且規(guī)則，染色質(zhì)在胞核內(nèi)分布均勻，各類細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)形態(tài)未見明顯異常(圖4-A)。0.05～6.25 μg/mL AFB1處理的肝細(xì)胞中，細(xì)胞核的核膜開始皺縮，染色質(zhì)凝集并出現(xiàn)不同程度的邊移化，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器也發(fā)生相應(yīng)變化，細(xì)胞器出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，線粒體的體積增大，并且細(xì)胞凋亡情況會(huì)隨AFB1質(zhì)量濃度的遞增而越發(fā)明顯，同時(shí)凋亡小體的數(shù)量逐漸增加(圖4-B～E)。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理的肝細(xì)胞狀態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整(圖4-F)。

A～F表示0(對(duì)照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理36 h的犬原代肝細(xì)胞A-F represent logarithmic phase of cell in the 0(control),0.05,0.25,1.25,6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC treatments for 36 h圖3 AFB1和NAC處理后犬原代肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)比較(400×)Fig.3 Morphological characteristics of canine primary hepatocytes treated with AFB1 and NAC (400×)

A～F表示0(對(duì)照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理36 h犬原代肝細(xì)胞?！硎炯?xì)胞出現(xiàn)空泡化；▲表示線粒體腫脹；Δ表示細(xì)胞膜破裂；◆表示染色質(zhì)邊移化A-F represent 0(contrast),0.05,0.25,1.25, 6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC treatment for 36 h. → indicates vacuolization of cells;▲ indicates mitochondrial swelling;Δ indicates membrane rupture;◆ indicates chromatin edging

2.5 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞肝功能指標(biāo)的影響

由表2可知，與對(duì)照組(0 μg/mL AFB1)相比，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度高于1.25 μg/mL時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加顯著上升(P<0.05)；經(jīng)0.05～31.25 μg/mL AFB1處理后堿性磷酸酶(ALP)活性顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度高于1.25 μg/mL時(shí)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GGT)活性顯著降低(P<0.05)；當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為0.05～0.25 μg/mL時(shí)，γ-GGT活性顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL時(shí)，ALB質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05)；用0.05～31.25 μg/mL AFB1處理后，TP質(zhì)量濃度無(wú)顯著變化。與6.25 μg/mL AFB1組相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組AST、ALP、γ-GGT活性和TP、ALB質(zhì)量濃度顯著降低(P<0.05)。

表2 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞肝功能指標(biāo)的影響Table 2 Effect of AFB1 on liver function of canine primary hepatocytes

2.6 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞氧化與抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對(duì)照組(0 μg/mL AFB1)相比，不同質(zhì)量濃度AFB1處理組的8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)和丙二醇(MDA)含量顯著增加(P<0.05)。較高質(zhì)量濃度(1.25～31.25 μg/mL)AFB1處理后，H2O2質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.05)，且隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，H2O2質(zhì)量濃度呈上升趨勢(shì)。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組的8-OHdG、MDA和H2O2表達(dá)水平與6.25 μg/mL AFB1組相比顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加均無(wú)顯著變化；當(dāng)AFB1的濃度為0.25～31.25 μg/mL時(shí)，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性顯著降低(P<0.05)。6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組CAT和GSH-Px活性與6.25 μg/ml AFB1組相比顯著升高(P<0.05)，而SOD活性無(wú)顯著變化。

表3 AFB1和NAC對(duì)犬原代肝細(xì)胞氧化與抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of AFB1 and NAC on oxidant and antioxidant indexes in hepatocytes

2.7 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞凋亡的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示，6.25 μg/mL AFB1組的細(xì)胞凋亡率最高，達(dá)到12%，與對(duì)照組(4%)相比極顯著增加(P<0.01)；6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組的細(xì)胞凋亡率(7%)雖極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，但與AFB1組相比極顯著降低(P<0.01)。

2.8 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著增加(P<0.01)。與6.25 μg/mL AFB1組相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。

A～F表示用0(對(duì)照)，0.05，0.25，1.25，6.25 μg/mL AFB1以及6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理犬原代肝細(xì)胞，**代表0.05～6.25 μg/mL AFB1處理組和6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理組與對(duì)照組(0 μg/mL AFB1)差異極顯著(P<0.01)，##代表6.25 μg/mL AFB1處理組與6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理組差異極顯著(P<0.01)A-F represent canine primary hepatocytes treated with 0(control group),0.05,0.25,1.25,6.25 μg/mL AFB1 and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC，** means extremely significant difference in 0.05-6.25 μg/mL AFB1 groups and 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC groups in comparison with the control group (0 μg/mL AFB1) (P<0.01)，## means extremely significant difference between the 6.25 μg/mL AFB1 group and the 6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NACd group (P<0.01)圖5 AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞凋亡相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of AFB1 on relative expression of apoptosis related genes in canine primary hepatocytes

3 討 論

AFB1的毒性機(jī)制是通過(guò)激活CYP450產(chǎn)生代謝物，從而影響細(xì)胞的正常代謝和蛋白質(zhì)合成等[20]。本研究中，當(dāng)用0～6.25 μg/mL AFB1處理36 h后，隨AFB1質(zhì)量濃度的增加，犬原代肝細(xì)胞活性逐漸降低，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，犬的原代肝細(xì)胞對(duì)AFB1具有濃度依賴性，這與Ribeiro等[21]的研究結(jié)果相似。劉珊等[22]用AFB1對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)進(jìn)行攻毒時(shí)，選擇的時(shí)間為15 d，說(shuō)明AFB1的毒性作用受年齡、物種、器官、組織、細(xì)胞種類的影響。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用0.05～6.25 μg/mL AFB1處理后，犬原代肝細(xì)胞數(shù)目隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加而逐漸減少，細(xì)胞膜變薄，細(xì)胞之間的銜接距離增大，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變差，細(xì)胞發(fā)生裂解、死亡的現(xiàn)象，并具有濃度依賴性。梁娜等[23]通過(guò)觀察雛雞胸腺H.E.染色的病理切片后發(fā)現(xiàn)，受AFB1污染的胸腺中有大量的細(xì)胞核碎片，本研究結(jié)果與其基本一致。

細(xì)胞死亡類型分壞死和凋亡。本研究通過(guò)電子顯微觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組犬原代肝細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核飽滿，細(xì)胞器形態(tài)正常；隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡情況逐漸嚴(yán)重，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度的皺縮、碎裂，染色質(zhì)凝集或邊移，細(xì)胞器出現(xiàn)空泡狀，凋亡小體出現(xiàn)。細(xì)胞凋亡本是一種正常的生命活動(dòng)，但凋亡過(guò)度會(huì)引起組織萎縮。Saifei等[24]和Heil等[25]研究顯示，NAC單獨(dú)作用不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究中，6.25 μg/mL AFB1處理犬原代肝細(xì)胞凋亡率為12%，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC處理組細(xì)胞凋亡率為7%，可知NAC可保護(hù)5%左右的細(xì)胞免遭凋亡，表明NAC具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，這與前人的研究結(jié)果[26]相同。

細(xì)胞的凋亡途徑包括2種，即細(xì)胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑，其中蛋白酶Caspases在凋亡通路中起著至關(guān)重要的作用[27]，其可分為具有啟動(dòng)能力的caspase-2、caspase-8、caspase-9和起效應(yīng)功能的caspase-3、caspase-6、caspase-7，這些因子被蛋白水解激活后，便開始啟動(dòng)細(xì)胞死亡程序[28]。本試驗(yàn)中，當(dāng)AFB1質(zhì)量濃度為0～6.25 μg/mL時(shí)，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)的凋亡基因cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9 mRNA表達(dá)量總體呈劑量依賴性增大；與6.25 μg/mL AFB1組相比，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組的凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表達(dá)量極顯著降低，說(shuō)明NAC能降低AFB1激活的凋亡基因的表達(dá)。

NAC在細(xì)胞上的應(yīng)用主要是由于它具有抗氧化性以及能夠抑制細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的原因是細(xì)胞內(nèi)的活性氧過(guò)量引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[29]，使細(xì)胞中的細(xì)胞器受損。在細(xì)胞中常見的抗氧化物酶有GSH-Px、MDA、SOD、硫化物等，有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)最重要的抗氧化物是谷胱甘肽[30]。谷胱甘肽的形成需要3種必需氨基酸，其中半胱氨酸便是限制谷胱甘肽合成的最后一種氨基酸[31]，而NAC是半胱氨酸的供體，可以維持谷胱甘肽的水平[32]。因?yàn)镹AC具有毒性作用比較小、水溶性好且在自然條件下不易氧化等特性，在臨床上當(dāng)谷胱甘肽缺失時(shí)，可以選擇NAC直接用藥[32]。除作為抗氧化物前體物質(zhì)的功能外，人們還發(fā)現(xiàn)NAC自身也有清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基的作用[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，6.25 μg/mL AFB1+64 mmol/L NAC組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器正常；與6.25 μg/mL AFB1組相比，其細(xì)胞凋亡率極顯著降低，cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA表達(dá)量也極顯著降低，8-OHdG、MDA和H2O2水平均顯著降低，GSH-Px和CAT活性均顯著增加。由此可知，NAC能夠顯著提高犬原代肝細(xì)胞抗氧化酶活性，降低肝細(xì)胞的損傷和凋亡水平，緩解AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞的損傷，具有一定的保護(hù)性，與預(yù)期相符合。

綜上所述，AFB1能夠引起犬的原代肝細(xì)胞形態(tài)異常，且具有明顯的濃度依賴性細(xì)胞毒性作用；AFB1能夠影響肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST、ALP、γ-GGT活性，造成肝細(xì)胞損傷及肝功能異常；同時(shí)AFB1能激活細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9 mRNA的表達(dá)，加快肝細(xì)胞凋亡；而NAC能夠顯著降低AFB1對(duì)犬原代肝細(xì)胞的損傷和凋亡，維持肝功能相關(guān)指標(biāo)的正常水平，通過(guò)提高GSH-Px和CAT活性，發(fā)揮抗氧化作用，降低細(xì)胞內(nèi)氧化水平和凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)一步緩解AFB1對(duì)肝臟的損傷。