氮磷添加對(duì)杉木根葉分解殘余物微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性的影響

王玉鑫,付曉莉,王輝民,戴曉琴,寇 亮,方向民

1 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室千煙洲生態(tài)站,北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,北京 100049 3 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,南昌 330045

根、葉凋落物進(jìn)入土壤后為微生物提供碳源和營(yíng)養(yǎng)[1],其分解過(guò)程共同驅(qū)動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)碳排放及養(yǎng)分循環(huán)[2]。但根、葉凋落物輸入量及分解過(guò)程差異巨大。森林生態(tài)系統(tǒng)中,根、葉凋落物年輸入量之比在0.17—7.83之間[3]。根凋落物分解慢于葉凋落物,且分解至恒定時(shí)殘余率比葉凋落物高[4]。造成這種差異的原因主要有二方面。一是根葉凋落物化學(xué)屬性不同。根中相對(duì)難分解的碳(C)組分比葉中的高2—3倍,而葉凋落物具有更多易分解的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物等C組分[5- 6]。難分解C組分高通常伴有較高的真菌生物量,因?yàn)檎婢哂蟹纸鈴?fù)雜化合物(如木質(zhì)素)的酶系統(tǒng)。而易分解C組分則刺激特定細(xì)菌生長(zhǎng)[7]。二是根葉凋落物分解時(shí)所處的微環(huán)境不同。葉凋落物累積在土壤表面,更易受降雨的濺蝕與沖刷。根凋落物在土壤內(nèi),而大多數(shù)真菌(F)分解者需要氧氣進(jìn)行代謝或作為胞外酶的底物,需氧真菌群落在土壤內(nèi)常受低氧脅迫[8]。值得注意的是,微生物群落結(jié)構(gòu)及胞外酶特征不但參與、影響凋落物分解過(guò)程,且可指示生態(tài)系統(tǒng)對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)性,其本身也具有重要的生態(tài)學(xué)意義。如,微生物群落結(jié)構(gòu)參數(shù)及酶活性比常用來(lái)表征養(yǎng)分循環(huán)可持續(xù)狀態(tài)[9]、微生物受環(huán)境pH脅迫和碳源限制狀況[10]、微生物獲取養(yǎng)分的投入策略等[11]。

全球尺度的凋落物長(zhǎng)期分解試驗(yàn)整合分析表明：凋落物完全分解需要10年以上的時(shí)間；分解2年后,針葉林中根、葉凋落物殘余率分別約為59%和54%[12]。這些大量的根、葉分解殘余物仍是生態(tài)系統(tǒng)凋落物層和土壤碳庫(kù)的重要組成部分,影響著生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程,且根葉分解殘余物間化學(xué)屬性仍存在顯著差異。如,道格拉斯冷杉(Pseudotsugamenziesii)凋落物分解實(shí)驗(yàn)表明：分解2年后葉分解殘余物中的碳氮比(C/N)、氮磷比(N/P)分別為26和19,而根分解殘余物中的C/N、N/P分別為32和16[13]。根葉分解殘余物化學(xué)屬性差異預(yù)示著：根葉分解殘余物的微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性特征及其對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)可能不同。但野外分解試驗(yàn)時(shí)布設(shè)的初始凋落物質(zhì)量通常較小(根凋落物為1—2 g,葉凋落物為1—10 g)[6,14- 15],導(dǎo)致分解后期凋落物袋中的殘余物質(zhì)量十分有限,限制了對(duì)上述假設(shè)的科學(xué)驗(yàn)證。

當(dāng)前,氮、磷沉降是全球變化研究中的重要因子。我國(guó)亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)同時(shí)受氮沉降和磷沉降影響[16]。因此,本研究以亞熱帶地區(qū)杉木(Cunninghamialanceolata)林為對(duì)象,依托氮磷添加試驗(yàn)平臺(tái),布設(shè)凋落物分解試驗(yàn)時(shí)加大初始凋落物質(zhì)量,研究了分解3年后根(凋R)、葉殘余物(凋L)中的元素含量、化學(xué)計(jì)量比、微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性,以探究根、葉分解殘余物微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性特征對(duì)NP添加的響應(yīng)。我們假設(shè)：(1)分解3年后凋R與凋L間養(yǎng)分、微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性仍然存在差異；(2)與受真菌偏好的凋R相比,NP添加對(duì)受細(xì)菌偏好的凋L中的微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性影響更大,因?yàn)樯L(zhǎng)較慢的真菌比細(xì)菌更能抵抗干擾[17]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

杉木人工林氮磷添加試驗(yàn)平臺(tái)位于中國(guó)科學(xué)院千煙洲森林生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站 (115°13′04″E,26°44′52″N,海拔102 m)。該站點(diǎn)主要土壤類(lèi)型為紅壤,屬于典型強(qiáng)淋溶土(FAO, 2014),土壤為粉質(zhì)粘土,pH為4.3[18]。試驗(yàn)區(qū)屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候,年均氣溫和降水量分別為17.9℃和1471.2 mm。2011年11月在1998 年種植的二代杉木純林中建立了氮磷添加試驗(yàn)平臺(tái)。該平臺(tái)包括CK(對(duì)照)和100 kg hm-2a-1氮+50 kg hm-2a-1磷(NP添加)兩個(gè)處理,采用完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),每個(gè)處理6個(gè)樣方重復(fù)(20 m×20 m)。其中,氮、磷肥分別以NH4NO3和NaH2PO4形式施加,將肥料溶于水,人工均勻噴灑；CK處理人工噴灑等量的水。2011年,樣地林齡為14 a,密度約為2137棵/hm2,平均高度約為8.94 m,胸徑約為10.3 cm[19]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

2012年8月,在CK和NP添加處理中各選取3個(gè)樣方布設(shè)凋落物分解試驗(yàn)。每個(gè)樣方分別劃定2個(gè)3×5 m的子樣方,去除凋落物層和腐殖質(zhì)層。并在每個(gè)子樣方里步設(shè)葉凋落物(C含量為463.6 g/kg；N含量為8.4 g/kg；C/N比為55.19)和根凋落物(C含量為468.3 g/kg；N含量為12.8 g/kg；C/N比為36.59)兩個(gè)處理。其中,葉凋落物處理是將含250 g干重的葉凋落物袋置于PVC管(內(nèi)徑30 cm,長(zhǎng)度40 cm)內(nèi)的土壤表層；根凋落物處理是將含50 g干重的根凋落物袋置于PVC管內(nèi)土壤的5 cm深處。每種處理有6個(gè)PVC管重復(fù)。根、葉凋落物均采自未施肥杉木人工林。由于尚未分解的死根很難獲取,根凋落物是用0—10cm土層中的活細(xì)根(直徑≤2 mm)代替。杉木的小枝和葉一起掉落,所以葉凋落物包含小枝。杉木人工林葉凋落物的年輸入量約為0—10 cm土層中根凋落物年輸入量的5倍[20],因此,葉凋落物干重與根凋落物干重比設(shè)置為5∶1。凋落物尼龍網(wǎng)袋尺寸為30 cm×30 cm。杉木葉凋落物、根凋落物的本底化學(xué)屬性差異顯著：根凋落物的N、P、鉀(K)、鎂(Mg)、鐵(Fe)、鋁(Al)含量顯著高于葉凋落物；但根凋落物的鈣(Ca)、錳(Mn)含量顯著低于葉凋落物。

于2015年10月(即約分解3年后)采集凋L和凋R。部分樣品4℃冰箱保存,部分樣品風(fēng)干,用于后續(xù)分析。

1.3 測(cè)定方法

采用PLFA法檢測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)。用i14:0,i15:0,a15:0,i16:0,i17:0,a17:0,16:1ω7cis,16:1ω9cis,17:1ω7cis,18:1w5c,18:1ω7cis,cy17:0,cy19:0表示細(xì)菌(B)；18:3ω6cis,18:2ω6cis,18:2ω9cis,18:1ω9cis表示真菌(F)；16:1ω7cis,16:1ω9cis,17:1ω7cis,18:1w5c,18:1ω7cis,cy17:0,cy19:0表示革蘭氏陰性菌(G-)；i14:0,i15:0,a15:0,i16:0,i17:0,a17:0表示革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)[21]。同時(shí)計(jì)算環(huán)丙基脂肪酸與前體結(jié)構(gòu)的比值(Cy/pre)、單不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值(Mono/sat)[22]、G+/G-及F/B。Cy/pre越大表示微生物受環(huán)境pH脅迫越大[10],Mono/sat升高表示微生物受環(huán)境碳源限制加劇[11],G+/G-升高表示底物中較難利用的、復(fù)雜C組分比例變高[23],F/B升高表示養(yǎng)分循環(huán)更可持續(xù)、更保守[9]。

根據(jù)Allison[24]等人描述的方法測(cè)定β-葡萄糖苷酶(βG),N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和酸性磷酸酶(AP)的活性。酶活性比率(βG/NAG、βG/AP)可代表微生物獲取C,N及P的相對(duì)投資。βG/NAG較低表明相對(duì)于獲取C,微生物對(duì)獲取N的投入更大；βG/AP較低表明相對(duì)于獲取C,微生物對(duì)獲取P的投入更大[25]。

全C和全N采用元素分析儀(Vario Max CN,Elementar,Germany)測(cè)定。P、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Al元素含量使用高壓微波消解/萃取儀(ETHOS-T,MILESTONE,Italy)及電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP-AE,Thermo Elemental,United States)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)研究凋落物類(lèi)型及氮磷添加對(duì)分解殘余物中微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性及化學(xué)性質(zhì)的影響,并用Bonferroni法對(duì)不同處理凋落物間的差異性進(jìn)行多重比較。用多元逐步回歸分析探討分解殘余物中的微生物群落、酶活性參數(shù)與化學(xué)元素含量及計(jì)量比間的關(guān)系。上述分析用SPSS statistics 21.0實(shí)現(xiàn),由Origin 2017制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分解殘余物的化學(xué)屬性

氮磷添加和凋落物類(lèi)型對(duì)分解殘余物化學(xué)屬性影響顯著(表1)。CK處理下,凋R的N、Al含量、N/Ca、N/Mg、N/Mn、P/Ca、P/Mg、P/Mn高于凋L,而Ca、Mn含量低于凋L。氮磷添加對(duì)殘余物P、Ca含量、C/N、N/P、N/Mn、P/K、P/Ca、P/Mg的主效應(yīng)顯著,氮磷添加顯著增大殘余物P含量,降低N/P。氮磷添加和凋落物類(lèi)型對(duì)C、P、Ca、Mn含量、N/P、N/Mg、N/Mn、P/Ca存在交互效應(yīng)。氮磷添加處理下,凋R的N、P、K、Fe、Al、N/Ca、P/Ca、P/Mn含量高于凋L,而凋R的Ca、Mn、C/N、N/Al、P/Al含量低于凋L。

表1 氮磷添加和凋落物類(lèi)型對(duì)分解殘余物化學(xué)屬性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)影響的方差分析結(jié)果

2.2 分解殘余物中的微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性特征

凋落物類(lèi)型對(duì)分解殘余物微生物群落結(jié)構(gòu)影響顯著,氮磷添加對(duì)分解殘余物微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)主效應(yīng),凋落物類(lèi)型和氮磷添加對(duì)分解殘余物微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)交互作用(圖1)。總體而言,與凋R相比,凋L中的cy/pre、F/B、G+/G-低,而Mono/sat高。雖然氮磷添加對(duì)凋R中的微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)影響,但顯著提高了凋L中的Cy/pre。

圖1 氮磷添加和凋落物類(lèi)型對(duì)分解殘余物中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Responses of the microbial community structure in debris to nitrogen and phosphorus additions and litter types圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=6)；CK：對(duì)照 Control；NP：氮磷添加 Nitrogen and phosphorus additions；NS：不顯著 Not significant；不同字母表示處理間存在顯著差異(Bonferroni多重比較檢驗(yàn),P<0.0083)

凋落物類(lèi)型和氮磷添加均對(duì)分解殘余物中的微生物酶活性特征有影響,凋落物類(lèi)型和氮磷添加對(duì)分解殘余物微生物酶活性特征無(wú)交互作用(圖2)。凋落物類(lèi)型對(duì)βG、NAG及βG/AP有主效應(yīng)。與凋R相比,凋L中的βG和NAG活性高,βG/AP大。氮磷添加對(duì)AP、βG/NAG及βG/AP有主效應(yīng)。與CK相比,氮磷添加抑制了AP活性,提高了βG/NAG及βG/AP。其中,氮磷添加對(duì)凋R的AP活性抑制作用更強(qiáng),對(duì)凋L的βG/NAG提升幅度更大。

圖2 氮磷添加及凋落物類(lèi)型對(duì)分解殘余物中水解酶酶活性及酶活性計(jì)量的影響Fig.2 Responses of hydrolytic enzymes and related enzymatic stoichiometry in debris to nitrogen and phosphorus additions and litter types圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=6)；不同字母表示處理間存在顯著差異(Bonferroni多重比較檢驗(yàn),P<0.0083)

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性特征與分解殘余物化學(xué)屬性的關(guān)聯(lián)性

對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)參數(shù)而言,分解殘余物中的Mono/sat、G+/G、F/B分別與分解殘余物中Mn含量、P/Ca、N含量正相關(guān)(表2)。對(duì)酶活性參數(shù)而言,分解殘余物中的AP、βG/NAG分別與分解殘余物N/P、P/Fe正相關(guān)；βG/AP、NAG、βG分別與分解殘余物N/Mn、P/Mg、N/Ca負(fù)相關(guān)(表2)。

3 討論

3.1 根葉分解殘余物中微生物群落結(jié)構(gòu)及酶屬性差異

凋落物基質(zhì)質(zhì)量塑造著微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性特征[26]。C/N是反應(yīng)凋落物基質(zhì)質(zhì)量的典型指標(biāo)[12]。在C/N高的基質(zhì)中,微生物往往生長(zhǎng)緩慢、酶活性低,但酶系統(tǒng)復(fù)雜、效率高[27]。另外基質(zhì)化學(xué)組分會(huì)隨分解時(shí)間發(fā)生改變,導(dǎo)致基質(zhì)中的微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性也隨分解時(shí)間發(fā)生改變[26]。

本研究中,分解3年后凋R與凋L間的微生物群落結(jié)構(gòu)、酶屬性仍存在顯著差異,且與殘余物的化學(xué)屬性密切相關(guān)(表2),這支持了我們的假設(shè)一。與凋R相比,凋L的P/Ca和N含量低,導(dǎo)致G+/G-、F/B低；而Mn含量、Mono/sat高(圖1)。該結(jié)果說(shuō)明：與凋R相比,盡管凋L中Mn含量高有利于碳的分解[28],但凋L微生物總的碳源限制性高(Mono/sat高)、養(yǎng)分循環(huán)可持續(xù)性低(F/B低)。此外,凋R微生物受pH脅迫大(Cy/pre高)。這可能是因?yàn)椋涸搮^(qū)土壤為酸性、pH值低,凋R與土壤的接觸面積大于凋L,因此受pH脅迫較高[29]；且凋L中Ca元素的富集也有利于緩解pH脅迫[30]。

表2 微生物群落結(jié)構(gòu)及酶活性相關(guān)參數(shù)與化學(xué)性質(zhì)的多元逐步回歸分析

凋L的N/Ca和P/Mg低于凋R(表1),且分解殘余物中的βG和NAG分別與N/Ca和P/Mg顯著負(fù)相關(guān)(表2),故凋L的βG和NAG高于凋R(圖2)。凋L的βG和NAG高可能與凋L易分解C源比例大(G+/G-低)有關(guān)。凋L中的N/Mn低于凋R,且分解殘余物中的βG/AP與N/Mn顯著負(fù)相關(guān),故凋L中的βG/AP高于凋R。此外,酸性脅迫可降低基質(zhì)中的βG/AP[25],凋L微生物受pH脅迫小也會(huì)導(dǎo)致其βG/AP較高。凋L中的βG/AP高說(shuō)明凋L中的微生物相對(duì)于獲取P,對(duì)獲取C的投入更大[31],這與凋L微生物受C限制更大(Mono/sat高)的結(jié)果一致。

3.2 氮磷添加對(duì)分解殘余物中微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性的影響

本研究中,氮磷同時(shí)添加對(duì)分解殘余物中微生物群落結(jié)構(gòu)參數(shù)無(wú)主效應(yīng)(圖1)。與本研究結(jié)果相似,Ma等研究發(fā)現(xiàn)NP添加第5年對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。微生物群落會(huì)隨分解階段而演替[32]。分解初期,對(duì)易分解C組分偏好的快速生長(zhǎng)的r-策略微生物或共生菌為主導(dǎo)；分解后期,微生物群落逐漸被生長(zhǎng)較慢的k-策略微生物取代,這類(lèi)微生物具有相對(duì)復(fù)雜高效的酶系統(tǒng),可以在低營(yíng)養(yǎng)條件下分解更多的頑固性化合物[33]。可見(jiàn),分解第3年,根葉殘余物中的微生物群落結(jié)構(gòu)漸趨穩(wěn)定。氮磷添加對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)主效應(yīng)的原因也可能是由于N、P的激發(fā)效應(yīng)多發(fā)生在微生物C限制較低的環(huán)境中[34]。此外,采用以碳源利用為基礎(chǔ)的BIOLOG微孔板技術(shù)或高通量測(cè)序技術(shù)也許更能細(xì)致地發(fā)現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)與碳源間的關(guān)系[35-36],這需進(jìn)一步探究。

值得注意的是：氮磷添加顯著提高了葉殘余物的Cy/pre,但未改變根殘余物的Cy/pre。這一方面說(shuō)明氮磷添加增加了葉殘余物中微生物的pH脅迫,另一方面也表明根葉殘余物所處位置的差異使葉殘余物更易受外界干擾影響[37]。

本研究采用50倍于常量的初始凋落物質(zhì)量,且凋落分解試驗(yàn)需要多次取樣,而根系的采集耗時(shí)費(fèi)力。因此,針對(duì)研究區(qū)存在氮磷同時(shí)沉降這一問(wèn)題,本研究?jī)H解析了NP同時(shí)添加對(duì)凋落物分解殘余物微生物群落及酶活性的影響。未來(lái)研究可相對(duì)地減少初始分解質(zhì)量、增設(shè)單獨(dú)氮添加和單獨(dú)磷添加處理,以期更好地揭示氮、磷外源養(yǎng)分各自輸入對(duì)凋落物分解殘余物生物學(xué)特征的影響。

4 結(jié)論

杉木林的根葉分解試驗(yàn)表明：分解3年后,凋R與凋L間養(yǎng)分、微生物群落結(jié)構(gòu)、酶活性仍然存在差異,表明根、葉分解殘余物仍可對(duì)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)過(guò)程產(chǎn)生不同影響。與根分解殘余物比,葉分解殘余物微生物受C源限制性大,其微生物對(duì)獲取C的投入增多,F/B更低；但葉分解殘余物微生物受pH脅迫小。氮磷添加對(duì)分解殘余物的微生物群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響,但抑制了分解殘余物AP的活性,提高了βG/NAG和βG/AP,表明外源養(yǎng)分輸入對(duì)根葉分解殘余物仍有激發(fā)效應(yīng)。且氮磷添加對(duì)葉分解殘余物βG/NAG的提升幅度更大,表明亞熱帶地區(qū)氮磷沉降可加劇杉木林葉分解殘余物中微生物的C限制,這可能不利于分解后期杉木葉殘余物養(yǎng)分的歸還,延長(zhǎng)葉分解殘余物在生態(tài)系統(tǒng)中的存留時(shí)間。