復(fù)方荊芥顆粒的抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰作用以及急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

李 萍,安文藝,張譯方,畢小平*

(1山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑綜合實(shí)驗(yàn)室,太原 030001;2山西省侯馬市安益生中醫(yī)研究院;*通訊作者,E-mail:bixping@163.com)

慢性咽炎為上呼吸道慢性炎癥的一部分,臨床表現(xiàn)以咽部干、癢、痛及灼熱、異物感較為多見(jiàn)[1,2]。其發(fā)病原因及可能的誘因有:病原微生物的感染,不健康的生活習(xí)慣,空氣質(zhì)量下降等[3-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì),慢性咽炎的發(fā)病率占咽喉部疾病的10%-12%[6],發(fā)病率較高,且多呈現(xiàn)遷延難愈的特點(diǎn)。目前西醫(yī)治療慢性咽炎主要根據(jù)其感染的致病菌使用抗生素類藥物,因此會(huì)產(chǎn)生耐藥性及不良反應(yīng)等問(wèn)題。而中醫(yī)藥治療則具有療效確切、不良反應(yīng)小、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)勢(shì)[7]。

復(fù)方荊芥顆粒的源處方是應(yīng)用于臨床多年的經(jīng)驗(yàn)方,具有疏風(fēng)清熱,利咽消腫,宣肺散結(jié),祛風(fēng)止痛,理氣健脾,燥濕化痰的功效,在慢性咽炎的治療方面療效確切。但湯劑諸多不便,本實(shí)驗(yàn)室將其制備成顆粒劑,擬通過(guò)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)該顆粒的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),進(jìn)而依據(jù)該驗(yàn)方的功能主治進(jìn)行二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)、氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn),研究該顆粒的抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰之功效,并初步探究該顆粒的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);KQ-50DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XS205電子天平(梅特勒-托利多集團(tuán))。

復(fù)方荊芥顆粒(實(shí)驗(yàn)室自制,批號(hào)20200908,20200909,20200910);復(fù)方金銀花顆粒(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司,批號(hào)20200129);生理鹽水注射液(石家莊四藥有限公司,批號(hào)2007242007);二甲苯(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,批號(hào)20190103);酚紅(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,批號(hào)20190908);醋酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20110228);維生素C(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20160103)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康ICR小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2)g;山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(晉)2015-0001。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥方式 取ICR小鼠40只,隨機(jī)分為高、中、低劑量組,陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組,每組8只。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8],以成人劑量的10倍、5倍、1倍給以復(fù)方荊芥顆粒水溶液,作為高、中、低劑量組,分別為0.8,0.4,0.08 g/d;陽(yáng)性對(duì)照組給以復(fù)方金銀花顆粒,以0.8 g/d的劑量給藥;空白對(duì)照組給以同等體積的蒸餾水。給藥體積均為每10 g體質(zhì)量灌胃給藥0.2 ml,24 h內(nèi)給藥2次,連續(xù)給藥7 d,末次給藥前禁食不禁水。

1.3.2 耳腫脹實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及給藥,給藥45 min后,取20 μl二甲苯均勻涂布于小鼠右耳正反兩面,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,用6 mm直徑打孔器將小鼠雙耳同部位切下,稱定各耳廓重量。并按以下公式計(jì)算腫脹率(%)和腫脹抑制率(%)[9],并以此評(píng)價(jià)復(fù)方荊芥顆粒的抗炎作用:腫脹率=[(右耳廓重-左耳廓重)/左耳廓重]×100%;腫脹抑制率=[(空白對(duì)照組腫脹率-給藥組腫脹率)/空白對(duì)照組腫脹率]×100%。

1.3.3 醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及給藥,給藥45 min后,腹腔注射0.6%醋酸溶液10 ml/kg,記錄注射后20-45 min內(nèi)小鼠腹部?jī)?nèi)凹,伸展后肢,臀部抬高的次數(shù),按照下式計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率(%)[10],并以此評(píng)價(jià)顆粒的鎮(zhèn)痛作用：鎮(zhèn)痛百分率=[(空白對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/空白對(duì)照組扭體次數(shù)]×100%。

1.3.4 氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠40只,按“1.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及給藥,給藥30 min后,腹腔注射1%酚紅溶液20 ml/kg,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,剪開(kāi)其頸部皮膚,分離自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管,置于3 ml生理鹽水中,加入0.1 mol/L的NaOH溶液1 ml,超聲20 min顯色后,在546 nm處測(cè)定其吸光度值[11],以酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.379x+0.004(r=0.998 4),計(jì)算酚紅濃度及酚紅排泌量,按照下式計(jì)算祛痰百分率(%),并以此評(píng)價(jià)顆粒的祛痰作用：祛痰百分率=[(給藥組排泌量-空白對(duì)照組排泌量)/空白對(duì)照組排泌量]×100%。

1.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)方法

取20只ICR小鼠,隨機(jī)分為復(fù)方荊芥顆粒與空白對(duì)照組,每組10只。實(shí)驗(yàn)前,禁食過(guò)夜,自由飲水。以最大劑量每10 g體質(zhì)量給0.2 ml顆粒水溶液,24 h內(nèi)給藥3次,合并作為1次劑量計(jì)算。記錄14 d內(nèi)各組小鼠體質(zhì)量變化、飲食、外觀、行為、分泌物、排泄物等。于觀察期滿后,頸椎脫臼處死小鼠并進(jìn)行解剖,按照下式計(jì)算小鼠各臟器指數(shù)(%)[12]:臟器指數(shù)=各臟器濕重/小鼠體重×100%。

1.5 羥基自由基清除率的測(cè)定方法

1.5.1 溶液的配制 供試品溶液:稱取復(fù)方荊芥顆粒0.1 g,溶于10 ml蒸餾水中,濾過(guò),稀釋10倍即得1 mg/ml的供試品溶液。

維生素C溶液:稱取維生素C約0.01 g,精密稱定,用蒸餾水溶解并定容至100 ml,得0.1 mg/ml維生素C溶液,臨用新制。

1.5.2 羥基自由基清除率的測(cè)定 取0.15 mmol/ml的亞甲藍(lán)溶液1 ml,于具塞刻度試管中,依次加入9 mmol/L FeSO4溶液55 μl,加入供試品溶液或維生素C溶液50 μl,混勻后,加入10 mmol/L H2O2溶液55 μl,渦旋反應(yīng)1 min,加入蒸餾水定容至10 ml,搖勻,于656 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1;以同體積蒸餾水代替樣品溶液,同法操作后,作為空白對(duì)照,于656 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)2;以等濃度亞甲藍(lán)吸光度值為A0。根據(jù)以下公式計(jì)算自由基清除率S(%)[13]:S=(A1-A2)/(A0-A2)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)可知,高、中、低劑量復(fù)方荊芥顆粒在炎癥抑制作用中存在明顯的劑量依賴關(guān)系,劑量越高,小鼠耳腫脹率越低,表明抗炎作用越強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較,高、中劑量組小鼠耳廓腫脹率顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。且由腫脹抑制率可知,高、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1),表明高、中劑量對(duì)二甲苯導(dǎo)致的炎癥均有明顯的抑制作用。

表1 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由醋酸扭體實(shí)驗(yàn)可知,高、中、低劑量復(fù)方荊芥顆粒在鎮(zhèn)痛作用中存在明顯的劑量依賴關(guān)系,劑量越高,扭體次數(shù)越少,表明鎮(zhèn)痛作用越強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較,高、中劑量組小鼠扭體次數(shù)有顯著降低(P<0.01,見(jiàn)表2);且高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間鎮(zhèn)痛百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明復(fù)方荊芥顆粒對(duì)醋酸所致的疼痛有明顯的抑制作用。

表2 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn)可知,高、中、低劑量組在祛痰作用中存在明顯的劑量依賴關(guān)系,劑量越高,酚紅排泌量越高,表明祛痰作用越強(qiáng)。與空白對(duì)照組比較,高、中、低劑量組小鼠排泌量顯著增加(P<0.01,見(jiàn)表3),且高、中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間祛痰百分率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明復(fù)方荊芥顆粒具有祛痰作用。

表3 氣管酚紅排泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

觀察期內(nèi),復(fù)方荊芥顆粒組小鼠的外觀、飲食、行為活動(dòng)、分泌物、排泄物等均正常,各組均未出現(xiàn)死亡情況,體質(zhì)量增長(zhǎng)率與空白對(duì)照組小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表4)。觀察期滿后,對(duì)小鼠進(jìn)行大體解剖,并稱定心、肝、脾、肺、腎各組織的重量。結(jié)果表明,給藥組與空白對(duì)照組小鼠的各臟器指數(shù)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見(jiàn)表5)?？沙醪脚袛鄰?fù)方荊芥顆粒安全無(wú)毒。

表4 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠存活情況及體質(zhì)量增長(zhǎng)率

表5 急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠各臟器指數(shù)

2.5 羥基自由基清除率測(cè)定結(jié)果

3批次自制復(fù)方荊芥顆粒的羥基自由基清除率測(cè)定結(jié)果顯示,0.5 mg顆粒的平均清除率為71.5%,與0.4 mg維生素C的抗氧化活性(72.2%)相當(dāng)(見(jiàn)表6),表明顆粒具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

表6 羥基自由基清除率測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究表明,復(fù)方荊芥顆粒具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,可能是與其抗氧化活性有關(guān)。復(fù)方荊芥顆粒中含有的主要活性物質(zhì)包括揮發(fā)油、黃酮類化合物、多糖類化合物等。這些活性物質(zhì)均具有抗氧化活性[14-16],也是抗炎、鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)。本顆粒劑可能是通過(guò)抗氧化作用,抑制活性氧激活促炎性轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制過(guò)量炎癥因子(如IL-6、TNF-α等)的產(chǎn)生[17,18],達(dá)到抗炎的目的。進(jìn)而抑制因子TNF-α和IL-6導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛[19]。當(dāng)然,他們也可能是通過(guò)下調(diào)促炎因子的釋放,減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn),從而抑制炎癥反應(yīng)[20-22];抑或是通過(guò)介導(dǎo)炎癥性疼痛氧化失衡而產(chǎn)生的痛行為來(lái)抑制疼痛[23,24],以及利用揮發(fā)油的中樞鎮(zhèn)痛活性來(lái)減輕小鼠的痛感[25]。故而,本文的研究結(jié)果為進(jìn)一步深入探究復(fù)方荊芥顆粒抗炎、鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。究竟該顆粒劑通過(guò)什么途徑發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用,以及祛痰作用機(jī)制如何,還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上,復(fù)方荊芥顆粒安全無(wú)毒,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、祛痰的作用,可為臨床治療慢性咽炎提供科學(xué)依據(jù),具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。