檀香提取物調(diào)控miR-199a-3p對大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的作用

何志凌,龍文杰,招煦杰

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院心血管科,廣州 511000;2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科;3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:vli321@163.com)

冠狀動脈再通、及時恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)是缺血性心臟病最常見的治療策略之一。血流的恢復(fù)可使梗死引起的損害最小化,從而降低死亡率。然而心肌再灌注損傷常引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),可能會導(dǎo)致額外的心血管損傷,稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[1]。目前I/R損傷的存在已成為影響心肌缺血治療效果亟待解決的重大難題。檀香是我國名貴藥材之一,據(jù)報道,檀香茶葉水提醇沉液在一定濃度時具有明顯加強(qiáng)衰竭離體蛙心正性肌力和增加心率作用[2]。此外,藏藥三味檀香散可能通過保護(hù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)、改善缺血心肌的能量代謝和降低心肌中一氧化氮合酶活性對大鼠心肌缺血損傷起保護(hù)作用[3]。miR-199a-3p是一種內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,最近研究表明miR-199a-3p在I/R心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),卡維地洛可能通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對I/R心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[4]。此外,有研究指出miR-199a-3p可能通過不同的調(diào)控機(jī)制影響缺血預(yù)處理保護(hù)心肌I/R損傷[5]。本研究構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型模擬I/R損傷過程,探討檀香提取物對大鼠心肌細(xì)胞H/R損傷的影響,分析其機(jī)制是否與調(diào)控miR-199a-3p表達(dá)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9c2購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;檀香葉購于佛山綠緣生態(tài)科技有限公司;miR-199a-3p模擬物(miR-199a-3p mimics)及其陰性對照(miR-NC)、miR-199a-3p抑制物(anti-miR-199a-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)購于上海吉凱基因公司;細(xì)胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)、膜聯(lián)蛋白異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技公司;兔源活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體、山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司;細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Fast qPCR Mix購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 H/R心肌細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建

復(fù)蘇H9c2細(xì)胞后,將其接種到DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),選擇對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用不含血清的DMEM培養(yǎng)基,并置于37 ℃、95% N2、5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)10 h;接著更換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,并置于條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣的孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)2 h,制備H/R損傷模型[6]。

1.3 檀香提取物的制備

參照文獻(xiàn)[7]方法制備檀香提取物。檀香葉陰干后,將檀香葉粉碎至0.3 mm,加入80%乙醇,在料液比為1 ∶10的條件下超聲處理10 min,浸提48 h后過濾,洗滌2次,合并濾液,將濾液減壓濃縮,并冷凍干燥,即得檀香葉粗提物,用無菌水稀釋成濃度為50 mg/ml的溶液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

為探究檀香提取物對H9c2細(xì)胞H/R損傷的影響,將H9c2細(xì)胞分為對照(control)組、模型(H/R)組、H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組。H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組為H9c2細(xì)胞進(jìn)行H/R處理后分別加入終濃度為0.1,0.2,0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測LDH和CK活性,RT-qPCR試劑盒檢測miR-199a-3p表達(dá)。

為檢測miR-199a-3p對H9c2細(xì)胞H/R損傷的影響,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,H/R處理后,依次標(biāo)記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-199a-3p組、H/R+anti-miR-NC組、H/R+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測LDH和CK活性。

為驗(yàn)證檀香提取物是通過調(diào)控miR-199a-3p表達(dá)進(jìn)而影響H9c2細(xì)胞H/R損傷,將miR-NC、miR-199a-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-199a-3p分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞,H/R處理后,采用終濃度為0.4 mg/ml檀香提取物的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h,依次記為H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組、H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),試劑盒檢測LDH和CK活性。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將H9c2細(xì)胞按照1×104個/孔接種于96孔板,按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理,每孔加入10 μl的CCK8試劑,培養(yǎng)箱孵育4 h,酶標(biāo)儀測定在450 nm處的各組細(xì)胞吸光度值(OD),計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將H9c2細(xì)胞按照2×105個/孔接種于6孔板,按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理。收集各組細(xì)胞,用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)。取105個細(xì)胞,加入195 μl的Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,加入5 μl的PI輕輕混勻,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,并測定蛋白濃度。取一定體積的蛋白樣品和等體積的2×上樣緩沖液混勻,沸水浴5 min變性后冷卻至室溫備用。制備濃縮膠和分離膠,按照每孔30 μg進(jìn)行上樣和聚丙烯酰胺凝膠電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近時停止電泳。取出凝膠,漂洗后,利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。洗膜后,按照5%脫脂奶粉封閉,洗膜,一抗(cleaved Caspase-3抗體1 ∶500稀釋,Bcl-2抗體、GAPDH抗體1 ∶10 000稀釋)孵育,洗膜,二抗(1 ∶2 000稀釋)孵育,洗膜,化學(xué)發(fā)光顯色步驟依次進(jìn)行。凝膠分析系統(tǒng)采集圖像,以cleaved Caspase-3蛋白灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值比值表示cleaved Caspase-3的相對表達(dá)量。

1.8 試劑盒測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH和CK活性測定

細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后,收集各組H9c2細(xì)胞上清液,2 000 r/min離心20 min后取上清液,按照試劑盒說明書測定上清液中LDH、CK活性。

1.9 RT-qPCR試劑盒檢測細(xì)胞miR-199a-3p的表達(dá)水平

細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后,采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA,測定濃度和純度合格后,采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模板,利用SYBR Green Fast qPCR Mix進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。miR-199a-3p上游引物:5′-CAATCGCTTTCAAATAG-3′,下游引物:5′-CAGGAGATGCTGTCATC-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸35 s,35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-199a-3p的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性及凋亡的影響

與對照組相比,H/R組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1,圖1)。

圖1 檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表1 檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性及凋亡的影響

2.2 檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞受損程度及miR-199a-3p表達(dá)的影響

與對照組相比,H/R組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,LDH和CK活性顯著增加(P<0.05);與H/R組相比,H/R+0.1 mg/ml檀香組、H/R+0.2 mg/ml檀香組、H/R+0.4 mg/ml檀香組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的表達(dá)水平顯著升高,LDH和CK活性顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中LDH和CK含量的影響

2.3 過表達(dá)miR-199a-3p對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+miR-NC組相比,H/R+miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3,圖2)。

表3 過表達(dá)miR-199a-3p對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

2.4 抑制miR-199a-3p表達(dá)對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+anti-miR-NC組相比,H/R+anti-miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表4和圖3)。

表4 抑制miR-199a-3p對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖3 抑制miR-199a-3p對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of inhibition of miR-199a-3p on apoptosis and expression of related proteins in hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes

2.5 抑制miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+anti-miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對水平顯著降低,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著升高,LDH和CK活性顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表5和圖4)。

表5 miR-199a-3p抑制和檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

圖4 抑制miR-199a-3p能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Inhibition of miR-199a-3p reversed the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

2.6 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

與H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-NC組相比,H/R+0.4 mg/ml檀香+miR-199a-3p組H9c2細(xì)胞miR-199a-3p的相對水平顯著升高,cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率顯著降低,LDH和CK活性顯著降低,Bcl-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5和表6)。

圖5 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Overexpression of miR-199a-3p enhanced the effect of sandalwood extract on apoptosis and expression of related proteins in myocardial cells after hypoxia/reoxygenation

表6 過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞細(xì)胞活性、凋亡及受損程度的影響

3 討論

檀香又名白檀香、浴香,是全球最重要的藥用植物之一。研究顯示,檀香提取物具有抗菌、抗氧化、抗癌等多方面藥理作用[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)丹參-檀香配伍提取物對小鼠心肌缺血損傷具有一定的保護(hù)作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后,H9c2細(xì)胞存活率、抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低,細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增加,采用一定劑量的檀香提取物干預(yù)H/R處理的H9c2細(xì)胞后,心肌細(xì)胞的存活率、Bcl-2表現(xiàn)為明顯增加,而細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)表現(xiàn)為明顯降低,說明檀香提取物對H9c2細(xì)胞I/R損傷具有良好的保護(hù)作用。缺血性心臟病發(fā)生時,心肌組織中生成大量的活性氧,活性氧可直接損傷DNA,誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和心肌細(xì)胞凋亡[11]。此外,大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的釋放引起細(xì)胞膜通透性改變,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致LDH和CK等心肌酶的大量釋放。因此,檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性是評價心肌細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)[6,12]。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性表現(xiàn)為顯著增加,而一定劑量的檀香提取物干預(yù)可降低H/R處理H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK活性。以上研究說明,檀香提取物可減輕心肌細(xì)胞損傷程度,提高心肌細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡,對心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用。

miRNAs是機(jī)體生理和病理過程的重要調(diào)節(jié)因子,在心臟生物學(xué)和疾病中具有重要的發(fā)揮重要作用[13]。miR-199a-3p是miR-199/214簇成員之一,Chen等[14]研究表明,在心臟發(fā)生過程中miR-199a-3p表達(dá)上調(diào),miR-199a-3p抑制劑可提高胚狀體的跳動率,促進(jìn)心臟特異性標(biāo)志物的表達(dá)以及干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。Lesizza等[15]認(rèn)為單劑量心內(nèi)注射促再生性miR-199a-3p可顯著減少梗死面積,改善心肌梗死后的心臟功能。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn),CRRL的缺失通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)可促進(jìn)新生大鼠內(nèi)源性心肌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖,減輕心肌梗死后的重構(gòu),保護(hù)成年大鼠的心臟功能。本研究發(fā)現(xiàn)H/R處理后H9c2細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-199a-3p可提高H/R處理H9c2細(xì)胞的活力,抑制細(xì)胞凋亡,減輕細(xì)胞損傷程度,這與Torrini等[17]和Giacca等[18]miR-199a-3p具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖活性的結(jié)論基本吻合,與檀香提取物對H/R心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用一致。然而抑制miR-199a-3p表達(dá)后卻加重H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷和凋亡。而且進(jìn)一步研究顯示抑制miR-199a-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)檀香提取物對H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,而過表達(dá)miR-199a-3p能增強(qiáng)檀香提取物對H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。以上研究說明檀香提取物通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)對H/R心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。然而,檀香提取物中包含黃酮類、酚類物、有機(jī)酸以及氨基酸、多肽、多糖等多種活性成分[7],探究其發(fā)揮H/R心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的活性組分將是下一步研究重點(diǎn)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)檀香提取物能通過上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)顯著提高H/R損傷后細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞凋亡率,減輕細(xì)胞損傷程度,對心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用。