海蜇病原菌輪蟲弧菌的分離及鑒定

高楊

摘 要：海蜇生長階段分為螅狀體、碟狀體、水母體三個階段。海蜇潰爛病主要發(fā)生在水母體階段。從傘部凹陷、潰爛的海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）體內(nèi)分離到3株優(yōu)勢菌株DS2020072901、DS2020072902、DS2020072903。通過全自動細菌分析儀及16S rDNA基因序列同源性分析鑒定，分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌、輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）。其中輪蟲弧菌為首次在患病海蜇中分離得到，初步判定為致病菌。人工感染試驗確定了海蜇潰爛病的病原菌為輪蟲弧菌。藥敏分析結(jié)果顯示，該菌株對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等抗生素敏感。

關(guān)鍵詞：海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）;輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）;藥敏試驗

海蜇（Rhopilema esculentum Kishinouye）是海水立體生態(tài)養(yǎng)殖模式中重要的養(yǎng)殖生物，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，近年來海蜇病害日益嚴(yán)重，疾病成為制約海蜇養(yǎng)殖健康發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。海蜇易發(fā)生的病害有氣泡病、長脖、平頭、萎縮、頭部潰爛、爛邊、鲺病、小蝦附著等[1-4]。輪蟲弧菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害新發(fā)病原[5]，可引起青蟹幼體、半滑舌鰨、許氏平鲉等養(yǎng)殖品種的皮膚潰瘍癥。作者通過對丹東東港市某立體養(yǎng)殖池患病的海蜇傘體部和口腕部進行細菌分離與鑒定， 16s rDNA序列分析，感染試驗和藥敏試驗，分析影響海蜇生長和病害發(fā)生的原因，為海蜇的健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020年7月29日，東港市某立體養(yǎng)殖池海蜇出現(xiàn)傘部凹陷、潰爛等癥狀（見封三，圖1）。患病海蜇傘蓋下充滿棕黃色黏液，游動緩慢，緊貼池邊游動，頂網(wǎng)，影響生長。

1.2 試驗方法

1.2.1 肉眼檢查及剖檢 將患病海蜇通過肉眼觀察體表癥狀，解剖傘體部和口腕部，對胃腔、中膠層和口柱進行鏡檢，并記錄。

1.2.2 細菌分離 在無菌條件下，用接種環(huán)穿刺挑取海蜇的胃腔、中膠層和口柱， 用接種環(huán)接種于2216E瓊脂海水培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上[1]，劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌的單菌落，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上純化培養(yǎng)。將純化后的分離株在常溫和低溫（-80 ℃）下保種。

1.2.3 細菌鑒定

1.2.3.1 分子生物學(xué)鑒定 對分離菌株進行常規(guī)16s rDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3.2 生化鑒定 采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的微生物自動分析系統(tǒng)進行生化特征分析。

1.2.4 人工感染試驗 試驗用海蜇為東港地區(qū)某立體養(yǎng)殖池健康海蜇10尾，體重400～500 g，暫養(yǎng)于四個200 L水族箱中，溫度控制在18 ℃，充氣增氧。試驗組與對照組各10 L水體分別放入3尾海蜇，采用浸泡感染方法，每組采用致病菌的菌懸液濃度約107cfu/mL，對照組加入同等體積培養(yǎng)基。觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.5 藥敏試驗 對所分離并經(jīng)鑒定的致病菌株，采用瓊脂擴散紙片法（K-B）進行對常用抗菌類藥物的敏感性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

在海蜇的胃腔和口柱內(nèi)分離獲得3株優(yōu)勢菌，分別編號為DS2020072901、DS2020072902和DS2020072903。菌落呈淡黃色、圓形、濕潤;表面光滑、不透明;菌落直徑1.5～2 mm，其中DS2020072901菌落形狀呈彌散型。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察均為革蘭氏陰性菌。

2.2 菌株的生理、生化鑒定

由全自動細菌分析儀對病原菌的生理生化檢測結(jié)果可知，3株菌初步鑒定為弧菌屬細菌。

2.3 菌株16s rDNA基因序列分析及致病菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌所擴增的16s rDNA基因序列進行BLAST比對結(jié)果顯示，從胃腔和口柱內(nèi)分離出的菌株 DS2020072901、DS2020072902和DS2020072903分別為溶藻弧菌、副溶血弧菌和輪蟲弧菌。由于溶藻弧菌和副溶血弧菌在健康海蜇上均分離得到過，因此初步判斷輪蟲弧菌為該病的致病菌。從胃腔和口柱內(nèi)分離出的菌株DS2020072903的基因與輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianus）相應(yīng)基因的相似率達99%。將致病菌所擴增的16s rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號為MW990094，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，致病菌株與輪蟲弧菌聚為一支。

2.4 人工感染試驗

試驗組的5尾海蜇感染后的4～5 d死亡2尾，發(fā)病3尾，解剖觀察，對發(fā)病海蜇進行細菌分離與鑒定，結(jié)果與原致病菌一致 。

2.5 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株DS2020072903對氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等抗生素敏感，對青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。不同菌株間耐藥差異不明顯。

3 討論

本文首次報道引起海蜇頭部潰爛病的病原菌為輪蟲弧菌。輪蟲弧菌是引起魚類潰爛病的主要病原[6-8]。藥敏試驗表明該致病菌對氟苯尼考、沙星類抗生素等敏感，對其他抗生素敏感度低。本試驗采用16s rDNA鑒定分離的基因序列，在系統(tǒng)進化樹中與輪蟲弧菌[10-11]聚為一支，相似度>99%。海蜇疾病相關(guān)報道較少，而微生態(tài)制劑對于弧菌的抑制作用是較為顯著的[12-15]。芽孢桿菌、蛭弧菌等益生菌作為抗生素的替代品，能有效抑制病原菌，具有提高養(yǎng)殖動物的免疫力，改善水質(zhì)及生態(tài)環(huán)境的作用。

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（收稿日期：2021-04-23）